瘦肉精檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

1、 畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）題 目： 瘦肉精檢測(cè)方法的研究進(jìn)展 學(xué) 院： 專業(yè)班級(jí)： 指導(dǎo)教師： 職稱： 學(xué)生姓名： 學(xué) 號(hào)： 前 言上世紀(jì)80年代初，美國(guó)脂胺公司的研究人員意外地發(fā)現(xiàn)，將一定量的鹽酸克倫特羅添加在飼料中，能夠改變營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝途徑，促進(jìn)動(dòng)物肌肉特別是骨胳肌蛋白質(zhì)的合成，同時(shí)對(duì)脂肪合成有一定的抑制作用，從而可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，增加瘦肉率，并根據(jù)一定試驗(yàn)得出，如果在飼料中添加適量的鹽酸克倫特羅，可以提高飼料轉(zhuǎn)化率、生長(zhǎng)速率、胴體瘦肉率10以上。所以，當(dāng)時(shí)認(rèn)為這是一種不可多得的飼料藥物添加劑，并在世界各地進(jìn)行推廣應(yīng)用，而我國(guó)也于80年代后期，在一些大專院校、科研院所進(jìn)行了研發(fā)試驗(yàn)和推廣試驗(yàn)，經(jīng)

2、過(guò)證明其作用效果十分明顯，并把鹽酸克倫特羅簡(jiǎn)稱瘦肉精。雖然這種飼料添加劑一直沒(méi)有得到國(guó)家主管部門的認(rèn)可，但是在利益的驅(qū)使下，我國(guó)許多地區(qū)的飼料加工企業(yè)和養(yǎng)殖戶都開始推廣應(yīng)用。到了上世紀(jì)90年代，由于瘦肉精在動(dòng)物體內(nèi)吸收快分布廣、脂溶性高，具有殘留性積累和半衰期長(zhǎng)等藥理特性，人食用殘留鹽酸克倫特羅肉品后對(duì)肝、腎等內(nèi)臟器官會(huì)產(chǎn)生毒害作用，出現(xiàn)心悸、頭痛、目眩、惡心、嘔吐、心率加快、肌肉振顫等癥狀，嚴(yán)重者甚至死亡。鹽酸克倫特羅引起的中毒事件不斷發(fā)生.對(duì)人類健康造成的危害和對(duì)生態(tài)食物鏈所造的破壞已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外高度的重視。所以，尋求一種準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)方法很有必要。目前，檢測(cè)瘦肉精的方法主要有四種，即高

3、效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜一質(zhì)譜法（GCMS）、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法（CE）和免疫分析技術(shù)（IA）。而我國(guó)結(jié)合自己的實(shí)際情況，2001年農(nóng)業(yè)部首先組織制定了飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定標(biāo)淮。該標(biāo)準(zhǔn)選擇確定了兩種：即高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜質(zhì)譜法（GCMS）。其中將HPLC法作為檢測(cè)瘦肉精的半確證性方法，GCMS法定為檢測(cè)瘦肉精的確證性方法。第1章 緒 論1.1 什么是瘦肉精瘦肉精，顧名思義就是一種可以用來(lái)提高瘦肉率的藥物，它的學(xué)名叫“鹽酸克倫特羅（CLBenbuterol，Spiropent，Planipart，CLB）”，瘦肉精是一種2受體激動(dòng)劑，上世紀(jì)80年代初國(guó)外曾用于飼料添

4、加劑，后因人的不良反應(yīng)而被禁用。國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬戶不顧農(nóng)業(yè)部的規(guī)定，為了使豬肉不長(zhǎng)肥膘，在飼料中摻入瘦肉精。豬食用后在代謝過(guò)程中促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，加速脂肪的轉(zhuǎn)化和分解，提高了豬肉的瘦肉率，因此稱為瘦肉精。1.2 鹽酸克倫特羅的性質(zhì)1.2.1 鹽酸克倫特羅的化學(xué)性質(zhì)鹽酸克倫特羅的化學(xué)名為“2(叔丁氨基)甲基4氨基3，5二氯苯甲醇鹽酸鹽或羥甲叔丁腎上腺素”，藥品名為“克喘素、舒喘寧、雙氯醇胺”等，俗名“瘦肉精”。它是一種從天然兒茶酚胺衍生合成的化合物，分子式為C12H18Cl2N2OHC1，分子量為313.7，熔點(diǎn)為174175，無(wú)色或(類)白色微結(jié)晶粉末，無(wú)臭，味苦，具有調(diào)節(jié)動(dòng)物神經(jīng)興奮及其體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)素重分

5、配的功能。易溶于水、甲醇、熱乙醇，微溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯和乙醚，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，高溫不易分解。由于它化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，耐受高溫，畜產(chǎn)品一旦攜有，常規(guī)烹飪方法和過(guò)程如煮沸100、燒烤和微波處理等對(duì)其殘留不起破壞作用，也不能使其失活、溶解、熔化、損耗或清除它，因而不能消除毒性，人食用后易發(fā)生中毒，而且在血液中有很長(zhǎng)的生物半衰期、很高的生物利用率和很低的排除率，因此其殘留危害也更大。鹽酸克倫特羅不僅會(huì)對(duì)動(dòng)物造成損害，對(duì)人也會(huì)帶來(lái)極大的危害性1-2。1.2.2 鹽酸克倫特羅的藥理作用鹽酸克倫特羅臨床上用于急救、治療哮喘、粘膜充血、止血、過(guò)敏反應(yīng)和婦女產(chǎn)后因子宮收縮引起的劇痛等。在畜牧業(yè)上用于

6、提高動(dòng)物的生長(zhǎng)速度及胴體瘦肉率，因此，又稱之為“生長(zhǎng)促進(jìn)劑”和“營(yíng)養(yǎng)重分配劑”，俗稱瘦肉精3。其藥理作用主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：可作用于氣管平滑肌細(xì)胞的2受體，使平滑肌松弛，支氣管擴(kuò)張，從而達(dá)到平喘作用；可作用于骨骼肌慢收縮纖維上的2受體，使之加速收縮，表現(xiàn)為手不能握住，走路困難，面頸部骨骼肌震顫；可使血糖升高，胰島素分泌增強(qiáng)，引起厭食；促進(jìn)鉀離子進(jìn)入細(xì)胞，血液中鉀離子濃度下降，引起低鉀血癥，導(dǎo)致心律失常；能引起血乳酸丙酮酸升高，并可出現(xiàn)酮體，引起代謝紊亂，糖尿病人可引起酮中毒和酸中毒；調(diào)節(jié)機(jī)體物質(zhì)代謝，加強(qiáng)脂肪分解，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)再分配，加快禽畜生長(zhǎng)速度，使動(dòng)物瘦肉率增加9%

7、16%，骨骼肌脂肪降低8%15%；對(duì)子宮及尿道平滑肌也有舒張作用；抑制肌肉萎縮的作用；神經(jīng)保護(hù)作用；并對(duì)機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力有影響。1.3 瘦肉精的發(fā)現(xiàn)上世紀(jì)80年代初，美國(guó)脂胺公司的研究人員意外地發(fā)現(xiàn)，將一定量的鹽酸克倫特羅添加在飼料中，能夠改變營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝途徑，促進(jìn)動(dòng)物肌肉特別是骨胳肌蛋白質(zhì)的合成，同時(shí)對(duì)脂肪合成有一定的抑制作用，從而可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，增加瘦肉率，并根據(jù)一定試驗(yàn)得出，如果在飼料中添加適量的鹽酸克倫特羅，可以提高飼料轉(zhuǎn)化率、生長(zhǎng)速率、胴體瘦肉率10以上。所以，當(dāng)時(shí)認(rèn)為這是一種不可多得的飼料藥物添加劑，并在世界各地進(jìn)行推廣應(yīng)用，而我國(guó)也于80年代后期，在一些大專院校、科研院所進(jìn)行了

8、研發(fā)試驗(yàn)和推廣試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)證明其作用效果十分明顯，并把鹽酸克倫特羅簡(jiǎn)稱瘦肉精。雖然這種飼料添加劑一直沒(méi)有得到國(guó)家主管部門的認(rèn)可，但是在利益的驅(qū)使下，我國(guó)許多地區(qū)的飼料加工企業(yè)和養(yǎng)殖戶都開始推廣應(yīng)用，并稱其為“瘦肉精”。1.4 瘦肉精的危害1.4.1 瘦肉精的殘留性由于鹽酸克倫特羅在動(dòng)物生產(chǎn)中有明顯的促生長(zhǎng)和提高瘦肉率的作用，受此利益驅(qū)使國(guó)內(nèi)外CLB在養(yǎng)殖業(yè)中濫用問(wèn)題非常嚴(yán)重。又鹽酸克倫特羅在動(dòng)物體內(nèi)具有吸收快、分布廣、脂溶性高、具有殘留性積累和半衰期長(zhǎng)等特點(diǎn)。在動(dòng)物體內(nèi)的蓄積與其藥量和給藥持續(xù)時(shí)間有關(guān)，隨停藥期的延長(zhǎng)逐漸下降，其代謝率較低，不宜大量代謝排出，殘留量較高。因鹽酸克倫特羅在生產(chǎn)中的用

9、量是治療量的510倍，而且持續(xù)添加時(shí)間(3周以上)和在體內(nèi)消除半衰期(2539h)都很長(zhǎng)，所以極易在動(dòng)物組織中蓄積殘留1。在機(jī)體的各個(gè)組織中，鹽酸克倫特羅在眼和毛發(fā)中殘留的濃度最高，如眼中鹽酸克倫特羅殘留量比血漿中濃度高107倍。原因是鹽酸克倫特羅對(duì)不同組織有選擇性，首先選擇有色素沉著的眼組織和毛發(fā)組織沉積，且在眼組織中主要結(jié)合在有色素沉著的視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜上，而在無(wú)色素的眼的其他部位則蓄積較少。除了眼和毛發(fā)，其他器官的殘留情況是：肺、肝、腎約為血漿濃度的2090倍，肌肉和脂肪為315倍。如果在屠宰前沒(méi)有休藥期，則殘留量將更高。在動(dòng)物體內(nèi)的殘留依次為：視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜（眼睛）、毛發(fā)肝、腎、肺肌肉組

10、織、脂肪組織4。1.4.2 瘦肉精對(duì)人類的危害雖然鹽酸克倫特羅的毒性并不是很強(qiáng)。小鼠、豚鼠靜脈注射的半數(shù)致死量分別是每公斤體重27.6 mg和12.6 mg。但是由于它的半衰期長(zhǎng)，在體內(nèi)代謝慢，極易蓄積殘留于動(dòng)物體內(nèi)，在動(dòng)物肝臟中CLB平均濃度可達(dá)45 mg/kg，也就是說(shuō)，按臨床最高治療劑量每天0.8g/kg計(jì)算，人食用100 g被鹽酸克倫特羅污染的動(dòng)物肝臟攝人體內(nèi)的鹽酸克倫特羅就相當(dāng)于一次治療劑量的10倍以上，因而極有可能通過(guò)食物鏈?zhǔn)谷梭w中毒而對(duì)健康構(gòu)成威脅。自上世紀(jì)80年代中期歐美國(guó)家發(fā)現(xiàn)瘦肉精的毒副作用以來(lái)，至今世界范圍內(nèi)已有數(shù)以千計(jì)甚至萬(wàn)計(jì)因食用殘留有瘦肉精的動(dòng)物源食品而中毒的人員。

11、人食用殘留有鹽酸克倫特羅的畜產(chǎn)品后表現(xiàn)為肌肉興奮性增強(qiáng)，有的人中毒后表現(xiàn)為肌肉震顫，重癥者腓腸肌痙攣；同時(shí)引起心肌收縮加強(qiáng)，心率加快；對(duì)高血壓患者危害更大，鹽酸克倫特羅分解脂肪成游離脂肪酸進(jìn)入血液，使血管壁彈性降低，引起血壓升高，微循環(huán)血管膨脹，壓迫刺激周圍的神經(jīng)，引起頭痛頭暈；引起人內(nèi)臟橫紋肌和平滑肌興奮性增強(qiáng)，表現(xiàn)為嘔吐和腹瀉；又因體內(nèi)K+ 、Ca 2+、Na+ 和Mg2+等濃度的平衡破壞，導(dǎo)致細(xì)胞膜生物電位去極化能力增強(qiáng)，復(fù)極化能力減弱，細(xì)胞膜對(duì)離子通透性改變，心電圖可呈“T波倒置或底平”，ST段下移等，若患者發(fā)生死亡，則死于心臟舒張期或心肌梗死。鹽酸克倫特羅中毒的患者群中，對(duì)患心、腦血

12、管疾病、糖尿病、甲狀腺亢進(jìn)、青光眼、前列腺肥大者可造成威脅生命的惡果。孕婦中毒又可導(dǎo)致癌變、胎兒致畸的嚴(yán)重危害性1。1.4.3 瘦肉精可引起急性中毒和慢性中毒急性中毒一般是在食用含瘦肉精較高的動(dòng)物組織后15min6h內(nèi)出現(xiàn)癥狀，持續(xù)90min2d。何松岳等對(duì)48例中毒者臨床分析發(fā)現(xiàn)，病人主要表現(xiàn)為頭痛、頭暈（54.2%），四肢震顫（95.8%），肌肉酸痛（75%），多汗（47.9%），胸悶（52.1%），心悸（54.2%）?？梢?jiàn)，出現(xiàn)死機(jī)震顫癥狀的患者比例最高，肌肉酸痛次之，約一般的患者出現(xiàn)頭痛、頭暈、多汗、胸悶、心悸等癥狀，并無(wú)明顯年齡、性別差異、目前，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)患者死亡的現(xiàn)象。慢性中毒可引起

13、心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。主要表現(xiàn)為心肌收縮加強(qiáng)，心率加快；血管壁彈性降低，血壓升高；微循環(huán)血管膨脹，壓迫刺激周圍的神經(jīng)，引起頭痛、頭暈；內(nèi)臟橫紋肌和平滑肌興奮劑增強(qiáng)，表現(xiàn)為嘔吐和腹瀉；發(fā)生代謝紊亂，細(xì)胞膜離子通透性改變。神經(jīng)另有研究發(fā)現(xiàn)，其慢性中毒可引發(fā)染色體畸變，誘發(fā)惡性腫瘤4。1.5 瘦肉精的防治措施 1.5.1 歐美各國(guó)的防治措施早在20世紀(jì)80年代中期、歐美各國(guó)已發(fā)現(xiàn)鹽酸克倫特羅的毒副作用。西班牙、意大利、法國(guó)等歐美國(guó)家有關(guān)中毒的報(bào)道頻繁見(jiàn)諸于國(guó)際傳媒。早在20世紀(jì)80年代初,美國(guó)的食品藥品監(jiān)督管理局( FDA)和世界衛(wèi)生組織(WHO)就明文規(guī)定鹽酸克倫特羅的最高殘留量（MRL）標(biāo)準(zhǔn)

14、為：肉0.2g/kg、肝0.6g/kg、腎0.6g/kg、脂肪0.2g/kg、乳0.05g/kg。部分歐盟成員國(guó)如英國(guó)規(guī)定可食性組織中MRL值為0.5g/kg，荷蘭規(guī)定牛、馬肝臟組織中MRL值0.5g/kg。歐盟成員國(guó)已將鹽酸克倫特羅殘留作為肉品進(jìn)口必檢項(xiàng)目，因而這也成了WTO成員國(guó)之間進(jìn)行國(guó)際貿(mào)易的技術(shù)壁壘。由此可見(jiàn)，鹽酸克倫特羅的非法使用及殘留不但嚴(yán)重地威脅著消費(fèi)者的健康，而且也影響著一個(gè)國(guó)家的對(duì)外貿(mào)易和聲譽(yù)。1.5.2 我國(guó)采取的防治措施我國(guó)自1996年起至今年3月，香港特區(qū)及廣東、廣州、上海、北京、重慶、杭州、蘇州、福建、泉州等部分省市因食瘦肉精發(fā)生群體性中毒事例屢有發(fā)生，引起有關(guān)部門

15、的高度重視，20年來(lái)相繼出臺(tái)多項(xiàng)的防治措施。國(guó)家農(nóng)業(yè)部早在1997年3月就嚴(yán)令禁止2受體激動(dòng)劑在畜牧養(yǎng)成殖業(yè)中的應(yīng)用。1999年起又在全國(guó)范圍內(nèi)開展瘦肉精等違禁獸藥、飼料的專項(xiàng)查處。2001年初又頒布強(qiáng)制性行業(yè)標(biāo)準(zhǔn):MY438 2001飼料中監(jiān)酸克倫特羅的測(cè)定明文規(guī)定瘦肉精殘留量。并確定兩種測(cè)定方法:高壓液相色譜(HPLC)測(cè)定方法和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GCMS)確定法。前者帶有半確認(rèn)性質(zhì)：測(cè)定快速、簡(jiǎn)便。其最低檢測(cè)限量為0.05mgkg。后者則具有足夠的監(jiān)測(cè)靈敏度，其最低檢測(cè)限量為0.01mg/kg。主要用于最后確認(rèn)與仲載。該標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布為全國(guó)查處非法制售和使用CLB提供技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。衛(wèi)生部起草的國(guó)

16、家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定檢測(cè)限量：尿液為0.5 mg/kg,肉類產(chǎn)品為1mg/kg。中國(guó)肉類協(xié)會(huì)于2002年2月發(fā)出關(guān)于嚴(yán)禁制售“瘦肉精”豬肉流入市場(chǎng)的通知以行業(yè)協(xié)會(huì)名義強(qiáng)化線管理。加大執(zhí)法力度發(fā)布“兩院”公告。2002年8月16日,我國(guó)最高人民法院審判委員會(huì)、最高人民檢察院檢查委員會(huì)聯(lián)合發(fā)布公告關(guān)于辦理非法生產(chǎn)、銷售、使用禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中的藥品等刑事案件具體應(yīng)用法律若干問(wèn)題的解釋中明確規(guī)定，非法生產(chǎn)、銷售鹽酸克倫特羅等禁止在飼料和動(dòng)物飲用水使用的藥品,以非法經(jīng)營(yíng)罪、生產(chǎn)銷售有毒有害食品罪追究刑事責(zé)任，公安司法的加入使執(zhí)法力度更大1。我們應(yīng)借鑒美國(guó)、歐盟等國(guó)家在動(dòng)物產(chǎn)品生產(chǎn)和食品工業(yè)上實(shí)施的良好生產(chǎn)

17、規(guī)范(GMP)、危害分析與關(guān)鍵控制點(diǎn)(HACCP)和全過(guò)程質(zhì)量控制(IKB)等管理經(jīng)驗(yàn)，并結(jié)合我國(guó)動(dòng)物產(chǎn)品生產(chǎn)的特點(diǎn)。引入全過(guò)程質(zhì)量控制的新理念，加強(qiáng)養(yǎng)殖、屠宰加工和銷售環(huán)節(jié)的質(zhì)量管理，減小甚至消除CLB殘留造成的危害。1.6 本研究的目的及內(nèi)容1.6.1 課題研究的目的意義鹽酸克倫特羅是種飼料添加劑，由于其可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，增長(zhǎng)瘦肉率，雖然對(duì)人有很大的危害，但是在利益的的誘惑下，仍有人違法使用，故需要快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)鹽酸克倫特羅。本研究的目的是探討各種檢測(cè)方法的的步驟和優(yōu)缺點(diǎn)，并研究檢測(cè)方法的未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)，希望對(duì)瘦肉精的檢測(cè)有參考價(jià)值。1.6.2 課題研究的內(nèi)容本課題主要從以下幾個(gè)方面

18、進(jìn)行研究:介紹檢測(cè)瘦肉精的主要四種方法：即高效液相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜法、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法和免疫分析技術(shù)，以及未來(lái)檢測(cè)方法的發(fā)展趨勢(shì)生物傳感器技術(shù)、生物芯片技術(shù)。第2章 瘦肉精的檢測(cè)方法目前，已經(jīng)有多種技術(shù)可以對(duì)鹽酸克倫特羅進(jìn)行較為靈敏的檢測(cè)。主要有感觀檢驗(yàn)法；色譜技術(shù)，包括高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜、凝膠滲透色譜等；波譜與色譜聯(lián)用技術(shù).如氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GCMS)、液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LCMS)；免疫分析技術(shù)，包括放射免疫分析技術(shù)(RIA)、酶聯(lián)免疫技術(shù)(EIA)、滴金免疫技術(shù)(DIGFA)；電化學(xué)技術(shù)，包括修飾電極技術(shù)、生物傳感器技術(shù)(BS)、高效毛細(xì)管電泳(CE)等。

19、檢測(cè)瘦肉精的方法主要有四種，即高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜一質(zhì)譜法（GCMS）、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法（CE）和免疫分析技術(shù)（IA）。而我國(guó)結(jié)合自己的實(shí)際情況，2001年農(nóng)業(yè)部首先組織制定了飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定標(biāo)淮。該標(biāo)準(zhǔn)選擇確定了兩種：即高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜一質(zhì)譜法（GCMS）。其中將HPLC法作為檢測(cè)瘦肉精的半確證性方法，其最低檢測(cè)限為0.05g/kg，優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)精確度高，而且假陽(yáng)性率低；缺點(diǎn)是檢測(cè)過(guò)程煩瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，需貴重儀器、難于操作、價(jià)格昂貴。而GC一MS法優(yōu)點(diǎn)是能在多種殘留物同時(shí)存在的情況下對(duì)某種特定的殘留物進(jìn)行定性、定量分析。GCMS法與HPLC法相比，檢

20、測(cè)靈敏度更高，假陽(yáng)性率更低，已將GCMS法定為檢測(cè)瘦肉精的確證性方法。GCMS法的缺點(diǎn)同HPLC相似。2.1感觀檢測(cè)法憑人的感覺(jué)器官對(duì)商品的外觀特征進(jìn)行判斷，可用于克倫特羅的粗略判斷，主觀性強(qiáng)，但可為消費(fèi)者購(gòu)買提供一定的參考。屠宰前，當(dāng)豬皮膚光潔、白里泛紅、背毛少而松軟、臀部結(jié)實(shí)上翹、腹部勻稱、無(wú)下墜感且背部體表經(jīng)驅(qū)打后易見(jiàn)傷痕，可懷疑攝入克倫特羅；當(dāng)豬臥地不起或行走不靈活，易發(fā)生跛行或在運(yùn)輸中前后肢易發(fā)生開叉，蹄部易受傷并發(fā)生其他感染劇烈運(yùn)動(dòng)易造成死亡時(shí)，可懷疑攝入克倫特羅。屠宰后，如果肉色澤鮮紅、松軟、后臀肌飽滿突出、脂肪層非常薄，肉皮緊貼著瘦肉，瘦肉纖維比較疏松、肉皮與瘦肉之間無(wú)肥肉（肥

21、膘厚度不到1.5cm），有時(shí)有少量汗水滲出肉面。酮體兩側(cè)腹股溝脂肪層毛細(xì)血管分布密集、甚至充血，可懷疑含有克倫特羅1,4,5。2.2 高效液相色譜法（HPLC）高效液相色譜(HPLC)是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的新穎、快速的分離分析技術(shù)，適于分離生物醫(yī)學(xué)大分子和離子化合物、不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物、種類繁多的其他高分子及不穩(wěn)定化合物的檢測(cè)。鹽酸克倫特羅做HPLC分析時(shí)不需要衍生，利用2腎上腺素能激動(dòng)劑分子可與C18或C8固定相分子相互作用，應(yīng)用反相柱檢測(cè)2激動(dòng)劑類物質(zhì)。HPLC在技術(shù)上采用高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，可以與柱前提取、純化及柱后熒光衍生化反應(yīng)和質(zhì)譜（MS)等系統(tǒng)聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)分析過(guò)程的自動(dòng)

22、化。所用檢測(cè)器有電化學(xué)檢測(cè)器、紫外檢測(cè)器、質(zhì)譜檢測(cè)器和二極管陣列檢測(cè)器。2.2.1 電化學(xué)檢測(cè)器電化學(xué)發(fā)光分析法是近年來(lái)發(fā)展較快的一種發(fā)光分析方法，已廣泛應(yīng)用于許多無(wú)機(jī)物和有機(jī)物的分析測(cè)定。它除了具有傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光分析法的優(yōu)點(diǎn)，如靈敏度高、線性范圍寬、儀器簡(jiǎn)單等以外，還具有反應(yīng)過(guò)程控制性強(qiáng)、發(fā)光信號(hào)易于檢測(cè)、易于微型化的優(yōu)點(diǎn).然而，至今為止，還未見(jiàn)到應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光分析方法來(lái)檢測(cè)鹽酸克倫特羅的報(bào)道。我們?cè)谘芯抗ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)，鹽酸克倫特羅對(duì)聯(lián)吡啶釕(Ru(bpy)32+)在0.1 mol/L的Na2HPO4介質(zhì)中的弱電化學(xué)發(fā)光信號(hào)有較強(qiáng)的增敏作用。據(jù)此，建立了一種高靈敏測(cè)定鹽酸克倫特羅的電化學(xué)發(fā)光新方法

23、，可用于新型鹽酸克倫特羅HPLC檢測(cè)器或便攜式傳感器的設(shè)計(jì).C.crescemzlto等6用LichroeartRPSB柱子，以乙腈：緩沖液(30：70)為流動(dòng)相，流速為0.8 mL/min的條件下分析肝臟中的鹽酸克倫特羅，處理后的樣品用電化學(xué)檢測(cè)器，工作電極設(shè)在+800 mV，參比電極為Ag/AgCl，其檢測(cè)限為0.5g/g。楊志凌等7用Discovery Cl8(5m，4.6 mm i.d.250 mm)色譜柱，流動(dòng)相為1.7 mmol/L的氯化鋰甲酸甲醇(65：1：34)混合溶液，流速為1.0 mL/min.柱溫40，電化學(xué)檢測(cè)器工作電位為1.25 V，測(cè)定豬肉組織中的鹽酸克倫特羅，方法

24、靈敏度高，簡(jiǎn)便，可用于肌肉、肺臟、肝臟、腎臟及脂肪組織中CLB殘留的檢測(cè)。屈穎娟等8建立了一種檢測(cè)鹽酸克倫特羅的電化學(xué)發(fā)光新方法。結(jié)果表明，在0.1 mol/L的Na2HPO4介質(zhì)中，以循環(huán)伏安為電解方式，聯(lián)吡啶釕的濃度為1.010-6g/mL時(shí)，鹽酸克倫特羅對(duì)聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的增敏效果最好，在此條件下，該方法對(duì)鹽酸克倫特羅的線性范圍為6.010-79.010-6g/mL，檢出限為7.310-8g/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏RSD為3.9(n=7，c=1.010-6g/mL)。電化學(xué)檢測(cè)器在樣品凈處理較好時(shí)可以得到很好的靈敏度，但它不穩(wěn)定，重現(xiàn)性差且不能作為梯度洗脫條件下的檢測(cè)器。2.2.2 紫外

25、檢測(cè)器(UV)紫外檢測(cè)器是一種常用的檢測(cè)器，用于分析鹽酸克倫特羅所選用的波長(zhǎng)范圍為215245 nm。James F9用Watersl503.9mmd的symmetryCl18柱分離，用含有醋酸和醋酸銨的甲醇水為流動(dòng)相以0.8 mL/min進(jìn)行梯度洗脫，在245 nm下對(duì)肝臟中的鹽酸克倫特羅進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度可達(dá)0.3ng/g?？道虻?0用水提取豬肉及內(nèi)臟樣品中的鹽酸克倫特羅殘留，固相萃取凈化、濃縮，以二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定，方法檢出限為1.7 ng/g，回收率在81.091.4 ，精密度為1.37(低濃度)和0.76(高濃度)，該法操作簡(jiǎn)單，干擾少，宜于推廣。紫外檢測(cè)器價(jià)格便宜，最為普及，但其選

26、擇性不好，在分離效果不好的情況下易受干擾，且靈敏度不高，該檢測(cè)器常用于檢測(cè)組織中高濃度的鹽酸克倫特羅，尚未見(jiàn)到用于血、尿中CLB的分析報(bào)道。2.2.3 質(zhì)譜檢測(cè)器質(zhì)譜檢測(cè)器可以大大降低檢測(cè)限，尤其是二級(jí)質(zhì)譜可以作為特異性檢測(cè)器，也可以彌補(bǔ)色譜上分離的不足，使得對(duì)樣品處理的要求也大大降低。A.F.Lehner11用含0.05 甲酸和5 的乙腈水及含0.05 甲酸的乙腈為流動(dòng)相，在0.45 mL/min的流速下，用2502 mm的Luna phenyl柱子進(jìn)行梯度洗脫，使用ESIMS/MS檢測(cè)器進(jìn)行多反應(yīng)檢測(cè)，檢測(cè)母離子m/z為277，子離子m/z為277、259、204、64的產(chǎn)物離子，氘代的克

27、倫特羅作為內(nèi)標(biāo)物(質(zhì)譜的條件為：源溫度為120，錐孔電壓為+19 V，碰撞塌壓為-16 V)，檢測(cè)限可達(dá)4 pg/mL，這是GC/MS不能達(dá)到的。聶建榮等12采用調(diào)節(jié)pH后，過(guò)SCX柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化、濃縮，進(jìn)入高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜，使用電噴霧離子源正離子模式檢測(cè)。建立了以高效液相色譜一質(zhì)譜(HPLCMS/MS)快速檢測(cè)動(dòng)物尿液中的萊克多巴胺和克倫特羅分析方法。樣品經(jīng)SCX柱凈化濃縮后，以乙腈-5mmol/L乙酸銨(65：35，V/V)為流動(dòng)相，采用Kromasil CN色譜柱分離，通過(guò)電噴霧(ESI)離子源電離多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)對(duì)萊克多巴胺和克倫特羅作定性和定量分析。在1.0500.0

28、 g/L的范圍內(nèi)線性良好(r0.999)。在0.5、4.0、40.0、80.0、200.0 g/L添加水平下，回收率在89.7103.3，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.07.8。檢測(cè)限(S/N=5)為0.1 g/L。質(zhì)譜檢測(cè)器靈敏度高，特異性好，但其價(jià)格昂貴，儀器不易普及。 二極管陣列檢測(cè)器（DAD）GCMS法是定性的最佳手段，但由于儀器昂貴不利于推廣使用。應(yīng)用HPLC法成本低，但低濃度檢測(cè)時(shí)普通的紫外檢測(cè)器檢出假陽(yáng)性率高。應(yīng)用光電二極管陣列分光光度技術(shù)的二極管陣列檢測(cè)器(DAD)不但克服了普通紫外檢測(cè)器的缺點(diǎn)，而且能在線獲得色譜分離的三維光譜色譜圖，提供豐富的定性定量信息，通過(guò)比較被測(cè)組分和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的光

29、譜圖，便可以判斷兩者是否為同一物質(zhì)，因此，二極管陣列檢測(cè)器是液相色譜中理想的定性手段。劉平年13應(yīng)用高效液相色譜法結(jié)合二極管陣列檢測(cè)器建立了豬肝中鹽酸克倫特羅的定性、定量分析方法。用5 高氯酸溶液酸化提取，SCX固相小柱凈化，高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定豬肝中的鹽酸克倫特羅的方法，利用二極管陣列檢測(cè)器(DAD)定量并輔助定性。該方法的平均加標(biāo)回收率為79 ，檢出限0.01mg/kg。應(yīng)用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)豬肝中鹽酸克倫特羅進(jìn)行定性、定量分析，方法簡(jiǎn)單高效，設(shè)備配置要求低，定性準(zhǔn)確度較高，定量滿足測(cè)量要求，適于實(shí)驗(yàn)室大批量樣品的測(cè)試。目前，我國(guó)已將HPLC法作為檢測(cè)鹽酸克倫特羅殘留的半確證性方

30、法，最低檢測(cè)限范圍為115 ng。其優(yōu)點(diǎn)采用等度洗脫的方式，兩種化合物達(dá)到完全分離，互不干擾，采集一次樣品數(shù)據(jù)只需6.5 min時(shí)間?；厥章矢撸瑱z測(cè)限低，精密度、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性良好，可以作為相關(guān)部門制定標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)；缺點(diǎn)是樣品處理時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)過(guò)程煩瑣、難于操作、需貴重儀器，在實(shí)際應(yīng)用中受到一定的限制。2.3 氣相色譜質(zhì)譜法(GCMS)GCMS常用于測(cè)定血液及組織中CLB殘留。由于GC要求樣品有較低的沸點(diǎn)且相對(duì)熱穩(wěn)定性，而鹽酸克倫特羅的極性大，沸點(diǎn)高，不宜直接用于分析，故測(cè)定前要對(duì)分子上羥基、氨基等極性基團(tuán)衍生化，主要有硅烷化和環(huán)化衍生兩種。Giancarlo Biancotto14用含1TMCS

31、的BSTFA在60下30 min對(duì)CLB分子中的羥基進(jìn)行硅烷化衍生，衍生物用HP5MS的柱子進(jìn)行分離，程序升溫為：100 1 min，20/min升到190保持1 min，再以13/min升到305保持4 min，進(jìn)樣口溫度為250，離子源溫度為200的條件下用離子肼監(jiān)測(cè)m/z為349、264、266 的產(chǎn)物離子，檢測(cè)限為0.12 ng/mL。Imad K Abukhalaf15用三甲基環(huán)硼氧烷在80左右15 min下環(huán)化衍生樣品，選擇性監(jiān)測(cè)m/z為243、285、245、300的離子，尿及血中的檢測(cè)限分別為0.15ng/mL和0.2 ng/mL。原理16：樣品用鹽酸葡萄糖醛苷酶或芳基硫酸酯酶

32、在pH5.2的緩沖液中消化，萃取液用MCX小柱固相萃取凈化，分離的藥物殘留經(jīng)過(guò)雙三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)衍生后，用帶有質(zhì)量選擇檢測(cè)器的氣相色譜儀測(cè)定。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)：采用DB31/T2472000豬尿中鹽酸克侖特羅殘留量的檢測(cè)方法。檢測(cè)步驟：提?。阂迫?mL豬尿樣品于50mL具塞的離心管中，用乙酸調(diào)整pH至5.2，加入20mmol的乙酸銨緩沖溶液lmL，加入50L鹽酸葡萄糖醛苷酶溶液，震蕩、超聲15min，于37孵育18h。加入10mL乙酸乙酯異丙醇混合液，震蕩15min，用滴管收集有機(jī)相。用10mL上述混合液重復(fù)提取一次，合并兩次提取的溶液于試管中，用氮?dú)獯蹈?。?mL乙酸銨緩沖液溶解。

33、 用SCX柱凈化樣品。衍生化：用氮?dú)獯蹈缮鲜鋈芤?，加?00L甲苯，100L BSTFA，混均。置80 的烘箱中加熱衍生1h，冷卻后加0.5mL甲苯振蕩溶解。用氣質(zhì)聯(lián)用儀選擇離子檢測(cè)方式檢測(cè)。GCMS與HPLC法相比，檢測(cè)靈敏度更高，假陽(yáng)性率更低，具有快速、分離效果好、費(fèi)用較低等優(yōu)點(diǎn)，能在多種殘留物同時(shí)存在的情況下可以準(zhǔn)確地對(duì)某種特定的殘留物進(jìn)行定性、定量分析，中國(guó)已將此法定為檢測(cè)CLB的確證性方法。但其衍生化操作繁瑣，成本高，而且氣質(zhì)聯(lián)用儀目前在國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室并未普及，難于開展此項(xiàng)工作2.4 免疫分析法(IA)IA法靈敏高，檢測(cè)限可達(dá)到0.5ng/g甚至更低，一次可處理大量樣品，樣品處理簡(jiǎn)單或者

34、不需要處理，成本低，每個(gè)檢測(cè)成本在110元左右。隨著新標(biāo)記物的發(fā)展與聯(lián)合應(yīng)用、單克隆以及基因工程抗體的應(yīng)用及免疫放大技術(shù)，明顯提高檢測(cè)特異性，可實(shí)現(xiàn)分子水平的檢測(cè)。2.4.1 酶免疫分析法(EIA) 最初用于鹽酸克倫特羅檢測(cè)的EIA技術(shù)是一種選擇性雙抗和異源免疫分析的技術(shù)，目前，檢測(cè)鹽酸克倫特羅較高效的免疫分析技術(shù)是酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA)。EIA是繼RIA之后發(fā)展起來(lái)的，由于其簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，現(xiàn)已成為一種比RIA應(yīng)用更廣泛的檢測(cè)方法。最初用于CLB檢測(cè)的是一種選擇性雙抗和異源免疫分析，現(xiàn)在主要采用競(jìng)爭(zhēng)EIA原理。近年來(lái)出現(xiàn)了一些關(guān)于EIA的其它方法，總體特征是簡(jiǎn)捷、快速、費(fèi)用低，已有

35、試劑盒開發(fā)出來(lái)，應(yīng)用廣泛是英國(guó)的Randox Laboratories Ltd和德國(guó)的rbiopharm公司的產(chǎn)品。EIA的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)迅速，價(jià)格便宜。缺點(diǎn)是仍不能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，而且假陽(yáng)性率高，因此要求樣品處理、反應(yīng)條件要盡可能一致。酶聯(lián)免疫吸附法(Enzymelinked immunoassay，ELISA)酶聯(lián)免疫吸附法是檢測(cè)鹽酸克倫特羅較高效的方法，是用酶標(biāo)記的抗體或抗抗體來(lái)進(jìn)行的抗原一抗體反應(yīng)，利用免疫學(xué)抗原抗體特異性結(jié)合和酶的高效催化作用，通過(guò)化學(xué)方法將植物辣根過(guò)氧化物酶(HRP)與CLB結(jié)合，形成偶聯(lián)克倫特羅，然后加入待測(cè)克倫特羅，競(jìng)爭(zhēng)性與克倫特羅抗體結(jié)合，洗滌后

36、加底物，由于酶的專一性催化作用，可使原來(lái)無(wú)色的底物通過(guò)水解，氧化或還原反應(yīng)而顯示顏色，根據(jù)有色物的變化計(jì)量待測(cè)克倫特羅的量。Sawaya W N等運(yùn)用ELISA檢測(cè)了綿羊尿和眼組織中鹽酸克倫特羅的殘留情況，最大殘留檢測(cè)限分別為0.272ng/mL和1.5ng/g，但假陽(yáng)性率較高，檢出陽(yáng)性者需用GCMS法確證。ELISA檢測(cè)限可達(dá)0.05ng/g，最高可達(dá)0.003ng/g，目前，英國(guó)的Randox Laboratories Ltd和德國(guó)的Rbiopharm公司均開發(fā)出了檢測(cè)肉品、飼料中CLB殘留的ELISA試劑盒2。中國(guó)在應(yīng)用EIA檢測(cè)鹽酸克倫特羅方面的研究較晚.但近幾年取得了明顯的進(jìn)展，據(jù)中

37、國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所信息，此類試劑盒已開發(fā)成功。目前國(guó)內(nèi)主要采用ELISA作為篩選法，該法快速、簡(jiǎn)便，可定性或半定量，只能檢查出克倫特羅及其同類藥物(腎上腺受體激活劑)的存在，不能確定其各自化學(xué)本質(zhì)，假陽(yáng)性率高，需用GCMS確證，但該儀器價(jià)格昂貴，一般實(shí)驗(yàn)室不易普及；另外國(guó)內(nèi)試劑質(zhì)量不過(guò)關(guān)，而國(guó)外試劑盒較貴，成本大。新開發(fā)國(guó)產(chǎn)鹽酸克倫特羅檢測(cè)方法屬于ELISA，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.5x10-9。達(dá)到農(nóng)業(yè)部監(jiān)督檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)(1xl0-9)的需要；且試劑盒采用單克隆抗體技術(shù)，在特異性方面優(yōu)于國(guó)外產(chǎn)品。葉妮等對(duì)中國(guó)獸藥監(jiān)察所研制的試劑盒進(jìn)行了測(cè)試.結(jié)果表明該試劑盒與德國(guó)rbiopharm

38、公司生產(chǎn)的鹽酸克倫特羅ELISA檢測(cè)試劑盒有相當(dāng)?shù)目杀刃?；?shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，ELISA作為鹽酸克倫特羅殘留量的篩選方法具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)，適用于大量樣品的測(cè)定；缺點(diǎn)是不能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)而且假陽(yáng)性率高17。 放射免疫分析法(RIA) 早在1976年，Kopitar和Zimmer18 就報(bào)道用RIA分析腎上腺素能激動(dòng)劑的放射免疫測(cè)定程序和動(dòng)物組織中鹽酸克倫特羅的藥理學(xué)研究。Delahaut等建立了更為特異的RIA法，其鹽酸克倫特羅抗血清與其他p一腎上腺素能激動(dòng)劑的交叉反應(yīng)小于10，檢測(cè)限可達(dá)到0.5ng/mL(g)的水平。目前國(guó)外已有RIA測(cè)定CLB的試劑盒產(chǎn)品，還建立了放射受體分析法。放

39、射受體分析法(RRA)類似于RIA，是通過(guò)受體與B興奮劑結(jié)合，基于放射性追蹤者(3H 二氫阿普洛爾)和苯胺型興奮劑之間競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合來(lái)自血漿膜的受體，可對(duì)多種B興奮劑進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)到2.4ng/mL(g)。用于目前國(guó)外已生產(chǎn)出運(yùn)用RIA測(cè)定鹽酸克倫特羅的試劑盒產(chǎn)品，還建立了類似RIA的放射受體分析法。RIA具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確、快速、操作簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)；但是必須要先標(biāo)記鹽酸克倫特羅，技術(shù)難度大，難于普及；由于RIA需要較昂貴的液體閃爍儀或Y放射儀，且放射性同位素對(duì)人員有一定的傷害，廢棄物又不易處理，這些都限制了此種方法的廣泛應(yīng)用。國(guó)內(nèi)研究在此方面研究尚屬空白。 滴金免疫分析法(D

40、IGFA)金標(biāo)免疫檢測(cè)技術(shù)是90年代在免疫滲濾法基礎(chǔ)上建立的一種快速簡(jiǎn)單的方法，它是膠體金標(biāo)記技術(shù)與快速免疫斑點(diǎn)結(jié)合技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。其關(guān)鍵技術(shù)是CLB單克隆抗體的制備、膠體金的制備、膠體金標(biāo)記的單克隆抗體的制備、免疫滲濾裝置的制備。該方法具有與ELISA相似的特異性和靈敏性，且快速簡(jiǎn)便，特別是操作無(wú)需任何儀器，不經(jīng)過(guò)特殊訓(xùn)練就可得到正確的結(jié)果。DIGFA的關(guān)鍵技術(shù)是抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備、膠體金的制備、膠體金標(biāo)記的單克隆抗體的制備、免疫滲濾裝置(如硝酸纖維抗體包被膜)的制備，后3種關(guān)鍵技術(shù)已比較成熟，最關(guān)鍵的是制備出特異性強(qiáng)、純度高的抗鹽酸克倫特羅的單克隆抗體2。目前，DIGFA已成

41、功地實(shí)現(xiàn)了現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)若研制出特異性強(qiáng)、靈敏度高的CLB單克隆抗體，就能開發(fā)出具有市場(chǎng)潛力的檢測(cè)試紙條，檢測(cè)CLB的滴金免疫試紙條或滴金免疫測(cè)試盒可實(shí)現(xiàn)CLB的高效現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。中國(guó)農(nóng)大和南京農(nóng)大正積極進(jìn)行CLB單克隆抗體的研制。原理：過(guò)鹽酸克倫特羅與鹽酸克倫特羅一牛血清白蛋白偶聯(lián)物(CLBBSA偶聯(lián)物)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體一膠體金復(fù)合物，使試紙上反應(yīng)線顏色變化，以判定樣品中鹽酸克倫特羅的含量。當(dāng)檢樣中鹽酸克倫特羅濃度低于最低檢測(cè)水平時(shí)，膠體金中的抗鹽酸克倫特羅單抗一膠體金復(fù)合物與T線上的CLBBSA偶聯(lián)物結(jié)合，T線呈色與C線相近；當(dāng)檢樣中CLBE濃度0.5ng/mL時(shí)，抗鹽酸克倫特羅單抗

42、膠體金復(fù)合物與鹽酸克倫特羅結(jié)合，T線顯色比C線淺或完全看不到線，且鹽酸克倫特羅濃度越高T線顯色越淺，從而作出判定。測(cè)定步驟：采集新鮮尿樣放于4冰箱中待檢，無(wú)菌采集的尿樣可直接用于檢測(cè)；尿樣中有雜質(zhì)或沉淀物時(shí)，4000轉(zhuǎn)/min離心10min后取上清液進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)試劑應(yīng)保存于4冰箱中，檢測(cè)時(shí)從包裝袋中取出試劑，并打開后在1 h內(nèi)盡快使用。用滴管吸取待檢樣品溶液，滴加3滴于加樣孔中，加樣后開始計(jì)時(shí)，在35 min內(nèi)讀取結(jié)果16。2.4.4 時(shí)間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)采用時(shí)間分辨熒光免疫分析建立快速、高靈敏度的鹽酸克倫特羅(CLB)全自動(dòng)檢測(cè)方法。用三價(jià)稀土離子及其螯合物作為示蹤物，代替

43、熒光物質(zhì)、同位素、酶和化學(xué)發(fā)光物質(zhì).標(biāo)記抗原、抗體、核酸探針等物質(zhì)。以CLBOVA包被96微孔板作為固相抗原，與游離CLB競(jìng)爭(zhēng)限量的以Eu3+ 標(biāo)記的抗CLB單克隆抗體，建立解離增強(qiáng)模式的熒光免疫分析體系檢測(cè)CLB。當(dāng)免疫反應(yīng)發(fā)生后.根據(jù)熒光強(qiáng)度和相對(duì)熒光強(qiáng)度比值.判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度。達(dá)到定量分析的目的。該方法的靈敏度為0.03ng/mL，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為2.0和8.9，平均回收率為105.8，與沙丁胺醇、萊克多巴胺的交叉反應(yīng)率分別為0.96和0.77，結(jié)果表明，用TRFIA法檢測(cè)CLB，該方法具有測(cè)量靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、示蹤物穩(wěn)定、定量分析量程寬、無(wú)放射性污染和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)

44、點(diǎn)，因此越來(lái)越多地應(yīng)用于疾病診斷、療效觀察等醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。但在農(nóng)獸藥殘留監(jiān)控方面的應(yīng)用甚少。因此，采用Eu3+ 標(biāo)記的抗CLB單克隆抗體，開展了CLB時(shí)間分辨熒光免疫分析方法的研究。具有良好的應(yīng)用前景19。2.5 毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(CE)隨著毛細(xì)管區(qū)帶電泳技術(shù)(CE)自動(dòng)化操作的實(shí)現(xiàn)，由于其具有靈活性高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便、所需樣品量極少(一般只需幾納升)、許多分離參數(shù)如緩沖液的組成和pH值、毛細(xì)管的類型以及所使用的電場(chǎng)的波形等都可以調(diào)節(jié)的優(yōu)點(diǎn)，CE非常適用于那些難以用傳統(tǒng)的液相色譜法分離的離子化樣品的分離與分析，為快速、批量分離和分析離子化樣品提供了一個(gè)很好的選擇性手段。黃可龍等19人以羥丙

45、基環(huán)糊精(HPCD)作為手性添加劑，采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)成功分離了克倫特羅(CLBenbuterol，CLB)對(duì)映體。研究了CD種類與濃度，緩沖液PH 值及濃度，操作溫度等對(duì)分離的影響。結(jié)果表明，以30mmol/L的HPCD為手性添加劑，50mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PH =2.5)為緩沖液，分離電壓24 kV，操作溫度20，可使CLB對(duì)映體實(shí)現(xiàn)基線分離，其分離度為6.78。對(duì)拆分機(jī)理也進(jìn)行了探討，測(cè)定了HP CD與兩對(duì)映體的結(jié)合常數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)；對(duì)CZE定量能力(線性，精度)進(jìn)行了考察，R和S型的線性相關(guān)系數(shù)都大于0.998，兩者的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均低于2.2 %。Gaus

46、epohl C等17應(yīng)用CE技術(shù)檢測(cè)人尿中鹽酸克倫特羅的殘留， 最低檢測(cè)限達(dá)到0.5ng/mL，而且精確度、準(zhǔn)確度均已符合生物樣品中殘留物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。缺點(diǎn)是檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，不能滿足在線檢測(cè)，儀器復(fù)雜，缺乏配套的檢測(cè)器，目前使用范圍不廣。盡管CE分析樣品還存在著一些亟待解決的問(wèn)題，如目前尚缺乏合適的、配套的檢測(cè)器等，但是其仍具有較高的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。2.6 生物傳感器技術(shù)(BS)生物傳感技術(shù)是當(dāng)今世界上倍受關(guān)注的一門綜合性很強(qiáng)的技術(shù)領(lǐng)域，是“邁向21世紀(jì)的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)”之一。所謂BS即由生物活性物質(zhì)作為敏感元件，即生物識(shí)別系統(tǒng)感受器，再配上適當(dāng)?shù)膿Q能器及輸出顯示裝置所構(gòu)成的分析工具，其原理為分

47、子識(shí)別部分與被識(shí)別物質(zhì)相接觸，將生物技術(shù)與微電子技術(shù)相結(jié)合，利用生物體內(nèi)抗原、抗體專一性結(jié)合而導(dǎo)致電化學(xué)變化設(shè)計(jì)而成的免疫傳感器，實(shí)質(zhì)上也是一種電化學(xué)傳感器?？砂l(fā)生化學(xué)變化、熱變化、光變化以及直接誘導(dǎo)電信號(hào)，即將激素的單克隆抗體微型化膜(感受器或分子識(shí)別物)固定于換能器(如工作電極)表面，測(cè)定時(shí)在待測(cè)的激素溶液中加入已知濃度經(jīng)酶標(biāo)記的激素、待測(cè)抗原與標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合電極上的抗體，使經(jīng)洗滌后的電極與底物溶液接觸.標(biāo)記酶催化底物發(fā)生相應(yīng)的化學(xué)變化，而后利用電學(xué)測(cè)量方法進(jìn)行檢測(cè)、控制及顯示輸出直接顯示測(cè)得殘留物的含量或濃度值，從而成倍的突破了微量檢測(cè)的“極限”，大大加快檢測(cè)過(guò)程，使得全自動(dòng)無(wú)試劑

48、檢測(cè)成為可能21。國(guó)外已有生物傳感器技術(shù)檢測(cè)CLB殘留的報(bào)道，最早研制成功的是1967年Updike等研制的葡萄糖傳感器.它是一種酶?jìng)鞲衅?。Pizzariello Andrea應(yīng)用分子印記聚合膜(MIP)作為分子識(shí)別系統(tǒng)，選擇固相基質(zhì)復(fù)合電極（SBMCE)作為換能器，微分脈沖電壓電流表(DPV)作為輸出顯示裝置檢測(cè)牛肝中CLB殘留，證明此方法特異性強(qiáng)，與其他同類物質(zhì)交叉反應(yīng)低，但反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，靈敏度還有待于提高。肖紅玉等利用生物體內(nèi)抗原抗體專一性結(jié)合而導(dǎo)致電化學(xué)變化的原理設(shè)計(jì)成了免疫生物傳感器，線性范圍為0.18.1g/L，檢出限為0.1g/L。通過(guò)對(duì)100個(gè)已知陽(yáng)性樣品和100個(gè)已知陰性樣品

49、的測(cè)試，準(zhǔn)確率為97 ；通過(guò)對(duì)批內(nèi)和批間的多個(gè)重復(fù)，儀器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性都較好，檢測(cè)時(shí)間在20min以內(nèi)，檢測(cè)成本低，可以滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要22。酶標(biāo)免疫傳感技術(shù)是酶標(biāo)免疫技術(shù)與光電分析技術(shù)相結(jié)合而產(chǎn)生的一種電化學(xué)免疫分析技術(shù)，是利用生物傳感器進(jìn)行免疫測(cè)定的一種實(shí)驗(yàn)手段。其特點(diǎn)是利用酶的化學(xué)放大作用，通過(guò)測(cè)定抗原或抗體標(biāo)記酶作為示蹤酶，將酶與底物反應(yīng)的化學(xué)變化用換能器轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，從而輸出待測(cè)物質(zhì)的含量。目前酶標(biāo)免疫傳感技術(shù)的靈敏度可達(dá)0.0lng/g，而且可在幾分鐘之內(nèi)完成檢測(cè)全過(guò)程，比ELISA法更靈敏、更簡(jiǎn)便和快速。而且可用于各種抗原物質(zhì)的測(cè)定，尤其對(duì)體液中的藥物和激素的檢測(cè)更為適用。所

50、以。如果研制成功測(cè)定鹽酸克倫特羅殘留的酶標(biāo)免疫傳感技術(shù).則可使鹽酸克倫特羅的監(jiān)測(cè)及檢測(cè)工作變得簡(jiǎn)單、高效。國(guó)內(nèi)未見(jiàn)有開發(fā)成功的相關(guān)報(bào)道17。2.7 生物芯片技術(shù)生物芯片的一個(gè)突出優(yōu)點(diǎn)是能平行快速分析上百個(gè)或數(shù)千個(gè)多態(tài)性樣品.如農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥和獸藥殘留的檢測(cè)、微生物的檢測(cè)和動(dòng)植基因突變的檢測(cè)等，都可以通過(guò)生物芯片和生物傳感器來(lái)實(shí)現(xiàn)。程京博士提出的微陣列芯片技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、高通量和適用范圍廣等特點(diǎn)，可為獸藥殘留的控制提供科學(xué)、準(zhǔn)確、公證的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)。北京博奧生物芯片有限責(zé)任公司已開發(fā)基于免疫原理的蛋白質(zhì)芯片和配套的通用樣品制備方法及裝置，該芯片可用于重點(diǎn)獸藥殘留的檢測(cè)23,24。雖然科學(xué)工作

51、者已提出多種檢測(cè)CLB的方法，但都不夠理想。上述幾種CLB殘留檢測(cè)方法中，HPLC、GCMS、CE的最低檢測(cè)限都在0.01 mg/kg以上，而且檢測(cè)過(guò)程繁瑣，難于操作，不能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；EIA法靈敏度較高，但假陽(yáng)性率也高，只能作為“篩選法”。金標(biāo)免疫檢測(cè)技術(shù)(DIGFA)和生物傳感技術(shù)(BS)是現(xiàn)在新發(fā)展的兩門能精確檢測(cè)殘留的技術(shù)，可以克服上述方法的缺點(diǎn)，使鹽酸克倫特羅的監(jiān)測(cè)和檢驗(yàn)變得簡(jiǎn)單、高效，并且從定性和定量?jī)蓚€(gè)方面實(shí)現(xiàn)CLB殘留的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)，所以研制和開發(fā)測(cè)定CLB的DIGFA試紙條和生物傳感器是完成CLB殘留監(jiān)控規(guī)劃較為理想的方法和途徑，值得深入探討和開發(fā)。2.8 微懸臂梁傳感測(cè)量法微懸

52、臂梁傳感是在原子力顯微鏡和微機(jī)電系統(tǒng)出現(xiàn)后迅速發(fā)展起來(lái)的一種新型傳感方法，在生化傳感中有著很好的應(yīng)用前景。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)微懸臂梁的單側(cè)表面(一般為鍍金面)有分子吸附或生化反應(yīng)發(fā)生時(shí)，微懸臂梁的表面應(yīng)力會(huì)發(fā)生變化，由于微懸臂梁上下表面化學(xué)性質(zhì)不同，其上下表面應(yīng)力會(huì)產(chǎn)生一個(gè)差值，從而導(dǎo)致微懸臂梁產(chǎn)生彎曲變形，利用光杠桿原理可以檢測(cè)微懸臂梁的彎曲變形。近年來(lái), 這項(xiàng)新型技術(shù)應(yīng)用于分子自組裝、蛋白質(zhì)分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變、DNA雙鏈雜交、癌癥檢測(cè)和轉(zhuǎn)錄因子等方面的研究。黃淵等25將巰基化的瘦肉精抗體通過(guò)自組裝修飾到微懸臂梁的金面，在加入不同濃度的瘦肉精標(biāo)準(zhǔn)樣品的過(guò)程中，通過(guò)光杠桿原理監(jiān)測(cè)微懸臂梁的實(shí)時(shí)彎曲信號(hào)。巰

53、基化瘦肉精抗體的活性和微懸臂梁上抗原抗體的結(jié)合得到酶聯(lián)免疫吸附( ELISA)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。該系統(tǒng)能夠檢測(cè)至少1 g/L濃度的瘦肉精標(biāo)準(zhǔn)樣品,而且具有很強(qiáng)的選擇性，在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中加入不含瘦肉精的1 mg/L氯霉素溶液沒(méi)有響應(yīng)。另外，瘦肉精抗原抗體的結(jié)合導(dǎo)致微懸臂梁產(chǎn)生壓應(yīng)力，而且微懸臂梁表面應(yīng)力的改變與樣品濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。我國(guó)在CL檢測(cè)技術(shù)方面較為落后，快速檢測(cè)基本上依賴價(jià)格昂貴的進(jìn)口試劑盒，若能研制開發(fā)出國(guó)產(chǎn)的高效、方便、穩(wěn)定的CL檢測(cè)試紙條和試劑盒，降低檢測(cè)成本，具有潛在巨大的市場(chǎng)需求和市場(chǎng)價(jià)值，既適應(yīng)了我國(guó)現(xiàn)代化經(jīng)濟(jì)發(fā)展的需要，也是我國(guó)加入WTO，與國(guó)際接軌的要求。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)

54、展，人們的消費(fèi)習(xí)慣與食物結(jié)構(gòu)都發(fā)生了很大的變化，食品安全的重要性日趨顯現(xiàn)，關(guān)注食品安全就是關(guān)注生命，近年來(lái)人類食用含有鹽酸克倫特羅殘留的肉食所致的中毒事件越來(lái)越嚴(yán)重，已成為重大食品安全問(wèn)題；此外，我國(guó)進(jìn)入WTO之后，由于衛(wèi)生條件和藥物殘留等問(wèn)題，導(dǎo)致禽肉產(chǎn)品出口歐盟屢屢受阻，為此應(yīng)加強(qiáng)殘留監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)，保證我國(guó)經(jīng)濟(jì)建設(shè)的順利進(jìn)行，增加經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，提高我國(guó)在國(guó)際上的政治地位和綜合國(guó)力。參考資料1 張清安,范學(xué)輝動(dòng)物性食品中鹽酸克倫特羅(瘦肉精)殘留危害及其檢測(cè)方法研究進(jìn)展J食品與發(fā)酵工業(yè),2004,30(9):1091022 米建萍鹽酸克倫特羅檢測(cè)方法的研究進(jìn)展J中國(guó)衛(wèi)生雜志,2008,18

55、:10123 劉國(guó)艷,柴春彥如何全面認(rèn)識(shí)“瘦肉精”J動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué),2002,19(6):l34 張彩霞,董相軍瘦肉精研究綜述J養(yǎng)殖與飼料,2007,1:57585劉維紅動(dòng)物產(chǎn)品中鹽酸克倫特羅殘留危害及檢測(cè)方法J安徽農(nóng)學(xué)通報(bào) ,2009,15(23):1681706 C Crescenzl,S Bayoudh,PAG Cormack,etcDetermination of clenbuterol in bovine liver by combining matrixsolidphase dispersion and molecularly in tinted solid phase ext

56、raction followed by liquid chromatography/electraspray ion trap multiplestage mass spectrometryJAnal Chem,2001,73:217121777 楊志凌,陳杖榴,方炳虎,等高效液相色譜一電化學(xué)檢測(cè)法測(cè)定豬組織中的克倫特羅J色譜,2003,21(3):245247 8 屈穎娟,鄭行望,章竹君等鹽酸克倫特羅的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器的研究J陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào),2004,32(3):66329 James F Lawrence,Cathie MenardDetermination of clenbuterol in beef liver and muscle t