三氧化二砷對多發(fā)性骨髓瘤骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖及分泌細(xì)胞因子的影響

1、三氧化二砷對多發(fā)性骨髓瘤骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖及分泌細(xì)胞因子的影響(1)】 為了探討三氧化二砷（As2O3）對多發(fā)性骨髓瘤（MM）患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSC）增殖及其分泌白細(xì)胞介素-6（IL-6）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）能力的影響，用體外培養(yǎng)MM患者骨髓的方法獲得BMSC。BMSC和MM細(xì)胞株CZ-1單獨(dú)或共同培養(yǎng)，給予不同濃度As2O3（1-20.0 mol/L）處理，用MTT法檢測細(xì)胞活性，用ELISA法檢測IL-6、VEGF的分泌水平。 結(jié)果表明： As2O3對CZ-1細(xì)胞有生長抑制作用，48小時(shí)后細(xì)胞生長抑制50 %的濃度（IC50）為2.3 mol/L，但對BMSC的生長無影響；

2、 MM患者BMSC高分泌IL-6、VEGF，經(jīng)As2O3作用后BMSC分泌IL-6、VEGF降低，骨髓瘤細(xì)胞和BMSC相互作用導(dǎo)致的過量IL-6、VEGF分泌也可被As2O3抑制，其抑制程度與對照組相比有顯著性差異（P0.05）。 結(jié)論： As2O3不能抑制BMSC的生長，但可以抑制其分泌IL-6及VEGF。 【關(guān)鍵詞】 多發(fā)性骨髓瘤Effect of Arsenic Trioxide on Bone Marrow Stromal Cells of Patients with Multiple MyelomaAbstract To explore the effect of arsenic t

3、rioxide（As2O3）on growth and secretion of interleukin-6（IL-6）and vascular endothelial growth factor（VEGF）of bone marrow stroma cells (BMSC) from the patients with multiple myeloma (MM). Specimens of bone marrow aspiration from MM patients were used to establish BMSC cultures.BMSC and human MM cell li

4、ne CZ-1 were cultured togetheroralone in the absenceorpresence of As2O3 at various concentrations（1-20.0 mol/L）.Cell growth inhibition was assessed by MTT assay，cytokines in the culture supernatants were measured with ELISA.The results showed that As2O3 had cytostatic effect on CZ-1 with fifty perce

5、nt growth inhibition （IC50）for 48 hours at 2.3 mol/L.As2O3 did not inhibit the growth of BMSC.High levels of IL-6 and VEGF have been found in the culture supernatants of BMSC from MM patients.Cytokine production of BMSC treated with As2O3 significantly decreased as compared with controls（P0.05）.Exci

6、tingly，even the increased cytokine production triggered by adhesion of MM cell and BMSC was also inhibited by As2O3.It is concluded that As2O3 has no inhibitory effect on cell growth of BMSC，but inhibit the production of IL-6 and VEGF by BMSC.Key word multiple myeloma; arsenic trioxide; bone marrow

7、stromal cell; cytokine多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）目前仍不能被治愈，骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSC）在MM的發(fā)病機(jī)制中起著重作用，自分泌和旁分泌的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可促進(jìn)瘤細(xì)胞生長和參與耐藥。新近的研究表明，以骨髓瘤細(xì)胞和BMSC為靶向治療的藥物如沙利度胺、蛋白酶體抑制劑等治療骨髓瘤取得了較好的效果，已有研究證實(shí)了As2O3對骨髓瘤細(xì)胞有作用。本研究探討As2O3對BMSC的生長及分泌

8、IL-6、VEGF的影響，報(bào)道如下。材料和方法試劑As2O3（哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)公司產(chǎn)品）用PBS配制成200 mol/L的儲(chǔ)存液，過濾除菌，分裝后置4保存，使用前用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋。骨髓基質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)參考楊吉成等BMSC培養(yǎng)方法1并作了修改，于髂后上棘取MM患者骨髓5 ml，肝素抗凝，F(xiàn)icoll-Hypaque梯度法分離單個(gè)核細(xì)胞。培養(yǎng)液洗滌2次，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37、5 % CO2、飽和濕度條件下靜置培養(yǎng)。每3-4天半量換液。待貼壁的骨髓基質(zhì)細(xì)胞形成單層后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。取少量細(xì)胞加入放有滅菌蓋玻片的6孔板培養(yǎng)，待其貼玻片生

9、長后，取出爬片進(jìn)行堿性磷酸酶（ALP）染色。光學(xué)顯微鏡下觀察ALP陽性細(xì)胞。細(xì)胞系的培養(yǎng)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株CZ-1（第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院侯建教授饋贈(zèng)）用含10 %小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液于37、5 % CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，3-4天傳代1次。細(xì)胞生長抑制檢測96孔板接種細(xì)胞3104/孔，加入終濃度分別為1、2、5、10、20 mol/L的As2O3，每一濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加入5 mg/ml的MTT（Sigma公司）液10 l，繼續(xù)孵育4小時(shí)，離心去上清，加入二甲亞砜（DMSO）50 l/well，振蕩10分鐘，酶標(biāo)儀（Bio-Rad 550）測定570 nm

10、處吸光度（A）值。根據(jù)A值計(jì)算細(xì)胞活性，并計(jì)算細(xì)胞生長抑制50%的As2O3濃度，即IC50值。培養(yǎng)上清細(xì)胞因子檢測將BMSC以2.5 g/L胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，種入24孔板，2104/孔。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)求加入As2O3，使體系的體積為450 l/well，As2O3終濃度為1、5、10 mol/L，對照組不加As2O3。按同種方法接種CZ-1及CZ-1 BMSC細(xì)胞，CZ-1 BMSC組每孔加入CZ-1和BMSC各2104個(gè)，加入As2O3使終濃度為1、5、10 mol/L。細(xì)胞于37、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24小時(shí)后，取離心后的培養(yǎng)上清于-20保存、待測。用ELISA法測定IL

11、-6、VEGF水平。在酶標(biāo)儀（Bio-Rad 680）上讀取每孔的吸光度（A）值。取復(fù)孔濃度的平均值。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，藥物處理前后的顯著性差異用Mann-Whitney U檢驗(yàn)確定。結(jié) 果光學(xué)顯微鏡觀察培養(yǎng)所得到的BMSC中ALP陽性細(xì)胞為（75.24.5）%。骨髓基質(zhì)細(xì)胞由細(xì)胞群體組成，主包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，它們均表達(dá)堿性磷酸酶，我們所獲得的細(xì)胞ALP陽性率為（75.24.5）%，說明所得細(xì)胞主為骨髓基質(zhì)細(xì)胞。As2O3對骨髓瘤細(xì)胞株CZ-1及BMSC的生長影響用MTT法檢測細(xì)胞活性顯示：經(jīng)不同濃度As2O3作用48小時(shí)后的CZ-

12、1，細(xì)胞生長受抑制，抑制作用隨濃度增加而增強(qiáng)，與對照組比較有顯著差異（P均0.05）。48小時(shí)后細(xì)胞生長抑制50%的濃度（IC50）為2.3 mol/L（圖1）。以同樣的方法檢測As2O3對MM患者及健康人BMSC生長的影響，發(fā)現(xiàn)As2O3作用48小時(shí)后MM患者及健康人BMSC均未受到明顯的抑制，即使在較高的濃度（20 mol/L）下對生長的抑制20%，與對照組細(xì)胞活性比較無顯著性差異（P=0.45）。作者：譚競，劉霆，朱煥玲，孟文彤，余江 【摘】為了探討三氧化二砷（As2O3）對多發(fā)性骨髓瘤（MM）患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞（ 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論

13、文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。As2O3對BMSC及CZ-1細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響MM患者及正常人BMSC均分泌IL-6、VEGF，MM患者BMSC分泌IL-6、VEGF的水平明顯高于正常人。CZ-1細(xì)胞能分泌少量的VEGF，未檢測出有IL-6分泌。MM患者BMSC與CZ-1細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)VEGF及IL-6分泌均增加，大于它們單獨(dú)培養(yǎng)分泌量的總和。經(jīng)As2O3處理后BMSC分泌IL-6及VEGF受抑制，抑制程度隨As2O3濃度增加而增強(qiáng)，并且MM細(xì)胞和BMSC共培養(yǎng)引起增加的細(xì)胞因子分泌增加也可以被As2O3抑制（

14、圖2、圖3、）。無論單獨(dú)培養(yǎng)還是與CZ-1細(xì)胞共培養(yǎng)，BMSC經(jīng)As2O3作用24小時(shí)后其IL-6、VEGF分泌較對照組有顯著性差異（P均0.05）（附表）。Table.Effect of As2O3 on cytokine secretion（略）討 論我們的實(shí)驗(yàn)中，3例難治性MM患者BMSC都高分泌VEGF、IL-6，分別是正常人的3-4倍和2.8-5.9倍。IL-6參與腫瘤克隆形成和瘤細(xì)胞抗凋亡，包括對抗地塞米松的促凋亡作用，通過抑制體液免疫及活化破骨細(xì)胞引起相應(yīng)的臨床表現(xiàn)。在MM患者血清中也發(fā)現(xiàn)IL-6水平增高?？笽L-6單克隆抗體可以減少M(fèi)M細(xì)胞增生而降低瘤細(xì)胞負(fù)荷。所以，IL-6被

15、認(rèn)為是MM發(fā)病中重的細(xì)胞因子。VEGF能和瘤細(xì)胞表面VEGFR-1/Flt-1結(jié)合，通過促分裂活化蛋白激酶（MAPK）途徑促進(jìn)MM增生，通過蛋白激酶C（PKC）途徑促進(jìn)MM遷徙，提示VEGF參與調(diào)節(jié)瘤細(xì)胞的生長和疾病發(fā)展2。BMSC與CZ-1細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)VEGF分泌量明顯增加，超過二者單獨(dú)培養(yǎng)的總和，共培養(yǎng)情況下IL-6的分泌也較單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)顯著地增加，證實(shí)了細(xì)胞間的相互作用對分泌細(xì)胞因子的促進(jìn)作用。其機(jī)制可能是細(xì)胞間黏附及細(xì)胞傳導(dǎo)激活了編碼細(xì)胞因子的啟動(dòng)因子3。這和Dankbar等4提出的MM細(xì)胞分泌VEGF刺激BMSC分泌IL-6，反過來IL-6又刺激MM細(xì)胞分泌VEGF相符。MM過度分泌I

16、L-6的來源有MM細(xì)胞自身分泌及旁分泌學(xué)說，也有MM細(xì)胞和BMSC共同分泌IL-6假設(shè)。在本實(shí)驗(yàn)CZ-1的培養(yǎng)上清中未檢測出IL-6。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，健康人BMSC與CZ-1共培養(yǎng)其分泌IL-6的能力也有增加，這也提示MM細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子及細(xì)胞接觸觸發(fā)信號傳導(dǎo)，使細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和分泌增加。近年來出現(xiàn)的以MM細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞為靶點(diǎn)的新藥物，如沙利度胺及其衍生物和蛋白酶體抑制劑等，治療復(fù)發(fā)和難治性MM取得了較好的效果，促進(jìn)了針對MM及基質(zhì)細(xì)胞的治療研究。已有研究證實(shí)，As2O3能抑制MM細(xì)胞生長，促其凋亡，包括對阿霉素及馬法蘭耐藥的細(xì)胞株5。本研究顯示，在臨床可達(dá)到濃度的條件下，As2

17、O3能抑制CZ-1細(xì)胞的生長，50%生長抑制濃度（IC50）為2.3 mol/L，證實(shí)了臨床血藥濃度的As2O3對骨髓瘤細(xì)胞的生長抑制作用。在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)As2O3對健康人及MM患者的BMSC均未表現(xiàn)出生長抑制作用，即使在較高的濃度（20.0 mol/L）下作用48小時(shí)，細(xì)胞活性與對照組相比依然大于80%，這說明BMSC對As2O3不敏感。我們對As2O3處理后細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子做了檢測。發(fā)現(xiàn)無論單獨(dú)或共同培養(yǎng)，As2O3均可抑制BMSC過度分泌的細(xì)胞因子，提示As2O3可以打破BMSC和MM之間的旁分泌環(huán)，抑制細(xì)胞間相互作用導(dǎo)致的IL-6、VEGF過度分泌。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，As2O3對BMSC生長無明顯抑制作用，但明顯影響其細(xì)胞因子的分泌，無論單獨(dú)培養(yǎng)還是和MM細(xì)胞共培養(yǎng)，As2O3對BMSC的作用不是直接破壞細(xì)胞，而是對其功能的調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF可以介導(dǎo)MM細(xì)胞遷徙和BM血管新生2，提示As2O3可能通過減少VEGF的分泌而阻斷該過程。IL-6和VEGF通過阻滯單個(gè)核細(xì)胞分化為DC及抑制DC成