低溫脅迫所要測的指標

1、低溫脅迫所要測的指標一、束縛水和可溶性糖1.1自由水和束縛水測量按照劉向莉等人【1】的稱重法來測，將測定糖液的濃度改為直接測定葉片的質(zhì)量。器材茶葉，稱量瓶 3只，天平，蔗糖，純凈水，搖床，濕紗布，濾紙步驟根據(jù)上述試驗結(jié)果 ,歸納稱重法的測定步驟如下: 取稱量瓶 3只 ,編號。取完整葉片去其主脈 ,剪成幾片面積相當?shù)娜~片 ,盡量保持葉片完整性 ,不破壞葉片的結(jié)構(gòu)。立即稱重后裝入稱量瓶中。 3個稱量瓶加入植物組織質(zhì)量6倍的 60 % 65 %糖液。各稱量瓶置于暗處 6 h,其間不時輕輕搖動。將葉片取出 ,用濕紗布和濾紙吸去表面糖液 ,立即稱重。植物組織中自由水含量 (% ) =(浸泡前葉片質(zhì)量 -

2、浸泡后葉片質(zhì)量 ) /浸泡前葉片質(zhì)量 100%植物組織中束縛水含量 (% ) =總含水量 -自由水含量1.2電解質(zhì)滲透率測定按照佘文琴的方法來進行測定【2】。器材茶葉，直徑0.6cm打孔器，天平，有蓋的三角錐形瓶，無離子水，量筒，恒溫箱，DDS-11型電導儀，水浴鍋步驟把各葉片置于室溫，0和4處理6h后取出,用直徑0.6cm打孔器打孔,各處理稱葉樣3g;重復3次.葉樣置于有蓋的三角錐形瓶中,加無離子水30ml,靜置于20恒溫箱中浸提12h,取出用DDS-11型電導儀測定浸提液的電導率。測畢將其放入已沸的水浴鍋中煮沸30min;再在20的恒溫中靜置12h,測定電導率。每處理測10個數(shù)據(jù),測定結(jié)果

3、按下列公式計算：電解質(zhì)滲出率 (% ) =(低溫處理電導率/煮沸后電導率 ) 100%1.3可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法【3】：材料、儀器設(shè)備以及試劑.1材料茶葉.2儀器設(shè)備分光光度計；水浴鍋；刻度試管；刻度吸管.3試劑1蒽酮乙酸乙酯試劑取分析純蒽酮1g，溶于50mL乙酸乙酯中，貯于棕色瓶中，在黑暗中可保存數(shù)星期，如有結(jié)晶析出，可微熱溶解。2濃硫酸（相對密度1.84）實驗步驟1保準曲線的制作（1）1%蔗糖標準液將分析純蔗糖在80烘至恒質(zhì)量，精確稱取1.000g。加少量水溶解，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，加入0.5mL濃硫酸，用蒸餾水定容至刻度。（2）100g/L蔗糖標準液 精確吸取1%蔗糖標準液

4、1mL，加入100mL容量瓶中，加水至刻度。取20mL刻度試管11支，從010分別編號，按表加入溶液和水。然后按順序向試管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯試劑和5mL濃硫酸，充分振蕩，立即將試管放入沸水中，逐管均準確保溫1min，取出后自然冷卻至室溫，以空白作參比，在630nm波長下測其吸光度，以糖含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，并求出標準線方程。表 蒽酮法測可溶性糖標準曲線試劑試劑量管號01、23、45、67、89、10100g/L蔗糖液/mL00.20.40.60.81.0蒸餾水量/ml2.01.81.61.41.21.0蔗糖量/g0204060801002可溶性糖的提取取茶樹葉

5、片，擦干凈表面污物，剪碎混勻，稱取0.100.30g共3份。分別放入3支刻度試管中，加入510mL蒸餾水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液過濾入25mL容量瓶中，用蒸餾水反復漂洗試管及殘渣并定容至刻度。3顯色測定吸取樣品提取液0.5mL于20mL刻度試管中（重復3次），加蒸餾水1.5mL,以下步驟與標準曲線測定相同，測定樣品的吸光度，計算可溶性糖的含量。4結(jié)果計算由標準曲線方程求出糖的量（g），按下式計算測試樣品的糖含量。可溶性糖含量（%）=(C VTN)/(WVS106) 100C：從標準曲線查得的糖量（g）；VT：提取液總體積（mL）；VS：測定時取用的樣品提取液體

6、積（mL）；N：稀釋倍數(shù)；W：樣品質(zhì)量（g）。2茶樹葉片的酶活性測定2.1粗酶液的制備取上述待測樣品一份，加入3.0mL 0.05mol/L pH7.0磷酸緩沖液（內(nèi)含1%不可溶聚乙烯吡咯烷酮）和少量石英砂，冰浴下研磨至勻槳。10,000g低溫離心15min，取上清液，冰凍保存?zhèn)溆谩４舜置敢嚎捎糜赑OD活性、SOD活性、CAT活性、PAL活性的測定。取上述待測樣品一份，加入2.0mL 0.05mol/L pH 5.0乙酸鈉緩沖液和少許石英砂，冰浴下研磨至勻漿。10,000g低溫離心15min，取上清液，冰凍保存?zhèn)溆?。此粗酶液可用?1,3-葡聚糖酶的活性測定。取上述待測樣品一份，加入5.0mL

7、 0.1mol/L pH 5.0檸檬酸鈉緩沖液和少許石英砂，冰浴下研磨至勻漿。10,000g低溫離心15min，取上清液，冰凍保存?zhèn)溆谩４舜置敢嚎捎糜谕馇袔锥≠|(zhì)酶的活性測定。2.2粗酶液的活性測定超氧物歧化酶（SOD）的活力測定采用氮藍四唑（NBT）光還原法。取3支試管標號，各管均加入反應液3.9mL（加入待測酶液后各試劑終濃度為13mmol/L甲硫氨酸溶液、75mol/L氮藍四唑溶液、100mol/L EDTA-Na2溶液、4mol/L核黃素溶液）；其中1、2號試管各加入30l待測粗酶液，3號試管只加對應量50mmol/L磷酸緩沖液（pH7.0）作為對照，在4000 Lux光照下10 min

8、，黑暗終止反應。以不光照的對照管作為參比管，在560 nm波長處測定各吸光值（A），記錄結(jié)果。按公式計算出：SOD酶活力 = (Amax - A樣品) * V酶液總體積 / (50% * Amax * W(g) * V進樣量 * T光照時間)，以抑制NBT光化還原的50%定義為1個酶活性單位（U1）。過氧化物酶（POD）的活力測定采用愈創(chuàng)木酚比色法。取比色杯2只，在一只中加入反應混合液（100 mmol/L pH6.0磷酸緩沖液50mL于燒杯中，加入愈創(chuàng)木酚28l，于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，加入30%過氧化氫19l混合均勻，現(xiàn)用現(xiàn)配，可短期保存于冰箱中）4.0ml

9、，作為校零對照；另一只加入反應混合液3.0mL，再加入蒸餾水980l，再加入待測粗酶液20l，立即開啟秒表記錄時間，用分光光度計在470nm波長下每隔1min測量吸光值，并計錄結(jié)果。按公式計算出：POD酶活力 = A470 * V酶液總體積 / (W(g) * V進樣量 * T反應時間 * 0.01)，以每分鐘內(nèi)A470變化0.01定義為1個酶活性單位（U2）。過氧化氫酶（CAT）的活力測定采用比色法。將基質(zhì)液（0.05mol/L pH7.0磷酸緩沖液，含65mo1/L H2O2）于37水浴5min。然后在空白管（B1）分別加入1.0mL基質(zhì)液、1.0mL 32.4mmol/L鉬酸銨和0.3m

10、L待測粗酶液；在空白管（B2）中分別加入1.0mL基質(zhì)液、1.0mL 32.4mmol/L鉬酸銨和0.3mL緩沖液；在空白管（B3）中加1.3mL基質(zhì)液和1.0mL 32.4mmol/L鉬酸銨。在測定樣品管（U）中分別加入0.3mL待測粗酶液和1.0mL基質(zhì)液，37水浴保溫1min后立即加入1.0mL 32.4mmol/L鉬酸銨，搖勻，10min后在405 nm波長下以水調(diào)零比色，記錄吸光度值（A）。按公式計算出：CAT酶活力 = (AB1 - AU)/(AB2 - AB3) * 65 * 1 * (V酶液總體積 / V進樣量) / W(g)，以每分鐘每毫升反應混合液分解1mmolH2O2定義

11、為1個酶活性單位（U3）。苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活力測定取0.3mL待測粗酶液加入1.0mL 0.02mol/L L-苯丙氨酸，并用蒸餾水補足至4.0ml；對照不加待測粗酶液，直接加4.0ml蒸餾水；反應液置30恒溫水浴中保溫30min，在290nm波長處測吸光值（A），記錄結(jié)果。計算出待測樣品的PAL活力，以每小時每毫升反應混合液形成1mg肉桂酸（即A290變化0.01）定義為1個酶活性單位（U4）。-1,3-葡聚糖酶的活力測定標準還原糖測定：將500g/mL的葡萄糖溶液準確稀釋至150g/mL，把此溶液再稀釋成數(shù)種不同濃度的溶液。然后取幾支干凈試管，分別加入不同濃度的葡萄糖溶液0.5m

12、L和0.5mL堿性銅試劑，置沸水溶解10min后，自來水冷卻。加入0.5mL砷鉬酸試劑，混勻，再加入3.5mL蒸餾水，于分光光度計660nm波長處測定光密度，并作光密度-還原糖濃度標準曲線。在0.4mL檸檬酸磷酸緩沖液（pH5.6，內(nèi)含1.0 mg/ml昆布多糖）中，加入0.1mL待測粗酶液，37恒溫水浴15min。接著加入0.5mL堿性銅試劑，沸水浴10min。冷卻后，加入0.5mL砷鉬酸試劑，在出現(xiàn)藍色時加入3.0mL水，搖勻后再稀釋10倍。在660nm波長處測光吸收值（A）。在10020010-3mol/L葡萄糖濃度范圍內(nèi)，還原糖的產(chǎn)生量與酶的活力呈線性關(guān)系。以每秒鐘內(nèi)從昆布多糖中釋放出

13、110-3mol葡萄糖量定義為1個酶活性單位（U5）。外切幾丁質(zhì)酶的活力測定分別吸取各種濃度（0，0.5，1.0，1.5，2.0mg/kg）的N-乙酰葡萄糖胺溶液0.4mL于10mL刻度試管中，加入0.2mL飽和硼砂溶液，沸水中煮7min。冷卻后再加入2.0mL冰醋酸和1.0mL l% 對二甲氨基苯醛（DMAB）溶液，37保溫15min。冷卻后立即在585nm波長處測定其吸光值（A），繪制標準曲線。配制1.2mL反應混合液，其中含0.4mL待測粗酶液，0.4mL醋酸緩沖液（0.1mol/L，pH5.8）和0.4mL膠狀幾丁質(zhì)。37下反應2h后，5,000rpm離心6min，終止反應。然后取0.

14、4mL上清液于10mL刻度試管中，按上述測定步驟進行測定上清中的N-乙酰葡糖胺量，以不含酶液的混合液作參比。以每小時分解膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)生1 g N-乙酰葡糖胺定義為1個酶活性單位（U6）。Cu/Zn SOD和 ApxNaCl處理葉圓盤和植株 選取生長七周的植株的第五片到第七葉的葉盤泡在NaC1濃度為0，0.5和1.OmolL的溶液中，然后在25連續(xù)光照下照射采樣進行樣品葉綠素含量的測定。按照Porra等(1989)的方法用1毫升80的丙酮從葉盤中提取葉綠素。體外培養(yǎng)的植株繁殖的高3 cm的莖桿被移栽到含20 ml的基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基中，直到采樣進行發(fā)芽率測定，再用80，100 和 120mmolL

15、NaC1處理。酶活性分析葉盤用05molL NaCl處理0 和 60 h后存放在液氮中，泡在適當?shù)木鶆蚓彌_液里。測定SOD 活性的緩沖液是0.05mol/L pH7.0磷酸緩沖液（內(nèi)含1%不可溶聚乙烯吡咯烷酮EDTA）和少量石英砂，測定APX的是0.05mol/L pH7.0 Hepes（內(nèi)含ImmoLL抗壞血酸和1 (vv) 活性劑Triton X- 100。分別按照Beauchamp Fridovich(1971)and Mittler Zilinskas (1994)的方法來鑒定SOD酶和APX的活性分析。2.28GPx活力測定.1試劑與儀器1.NaN3-Tris|緩沖液(pH74|)

16、內(nèi)含NaN3 5.0mmolL，TrisO.5molL，EDTA25mmolL(04 保存)。2.GSH底物液含NADPH0.2mmolL，GSH12mmolL，GR 6105UL，當日用NaN3Tris(pH74)緩沖液配制。3.PCOOH底物液自行合成，方法見衛(wèi)生研究1995年第3期。4.20% Tritonx-100 5.Tris蔗糖組織勻漿液(pH74) 內(nèi)含蔗糖25molL，Tris 20mmolL。6.LKB 4053型動力學分光光度計；蕾國產(chǎn)SDT一1810型組織勻漿器；Beckman L7-65超速離心機.2測定方法1勻漿上清液的制備用預冷的蔗糖-Tris勻漿液1：6稀釋，冰浴

17、勻漿后，4 ，1OOO0g離心15min，取勻漿上清液進行PHGPx活力測定。2 PHGPx活力測定方法測定步驟樣品 樣品管 非酵管勻漿上清液(m1) 0050 一GSH底物液(m1) 0500 050020 Triton 100(m1) 0015 0015三蒸水(m1) 0385 0|3525放置5min，加入0050ml PCOOH(在反應體系中的終濃度為75umolL)促發(fā)反應，立即在340nm波長下(1cm 光徑)讀光吸收值，反應時間Imin，延遲時間lmin 6杯同時測定。1.葉綠素含量采用丙酮乙醇混合法測定682.SOD用NBT(硝基四氮哇藍)法測定69 713.POD用愈創(chuàng)木酚氧

18、化法測定704.CAT用KmnO4滴定法715.GSH一Px活性測定用DTNB(5，5一二硫代二硝基苯甲酸)分光光度法726.GSH含量測定用DTNB分光光度法737.MDA用TBA反應法74參考文獻：1 劉向莉,高麗紅,劉明池,等. 植物組織中自由水和束縛水含量測定方法的改進J. 中國蔬菜, 2005 (4) : 9-112 佘文琴,劉星輝. 荔枝葉片膜透性和束縛水/自由水與耐寒性的關(guān)系J.福建農(nóng)業(yè)大學學報,1995,24(1):14-183 王學奎,等.植物生理生化實驗原理和技術(shù)M.北京:高等教育出版社,2006,5Apx測定GSX測定1. 谷胱甘肽過氧化酶的提取采用 DTNB (5 ,5- 二硫代對二硝基苯甲酸)染色法提取。稱取新鮮茶葉葉片材料加入 5倍體積的0.1 mol/ L pH 值為 7.4 的磷酸緩沖液 1 mmol/ L EDTA2Na ,1 %的水溶性 PVP (聚乙烯吡咯烷酮) ,研磨成勻漿 ,在溫度 4 下離心 ,取上清液用于 GSH Px活