酵母發(fā)酵液催化不對稱還原反應(yīng)合成(S)

1、    【關(guān)鍵詞】  酵母發(fā)酵液；不對稱還原反應(yīng)；4Optimization for the asymmetric synthesis of (S)ethyl 4chloro3hydroxybutanoate directly catalyzed by yeast fermentation broth【Abstract】 AIM: To optimize the asymmetric reduction of ethyl 4chloro3oxobutanoate (COBE) to (S)ethyl 4chloro3hydroxybutanoa

2、te (S)CHBE directly catalyzed by yeast (Saccharomyces cerevisiae) fermentation broth. METHODS: The variation of COBE, (S)CHBE and reductive sugar in reaction course and the influence of some reaction conditions (substrate, energy source) on asymmetric synthesis of (S)CHBE directly catalyzed by yeast

3、 fermentation broth were examined respectively, and the optimal conditions of asymmetric synthesis of (S)CHBE were optimized by orthogonal test design. RESULTS：The consumption of substrate and formation of product were mostly in the initial reaction course as well as consumption of reductive sugar.

4、Repeated feeding strategy of substrate and energy source was favored for the formation of (S)CHBE. The optimum reaction conditions were sucrose repeated feeding strategy (feeding 5 g/120 mL after 2 h of reaction), substrate feeding strategy 0.5(3), buffer concentration 2 g/120 mL, cyclodextrin conce

5、ntration 2 g/120 mL. CONCLUSION: Optically active (S)CHBE is synthesized by yeast fermentation broth with 96% yield and 100% ee (enantiometric excess) under the optimum reaction conditions.【Keywords】 yeast fermentation broth; asymmetric reduction; ethyl 4chloro3oxobutanoate; (S)ethyl 4Chloro3hydroxy

6、butanoate; orthogonal text【摘要】 目的：優(yōu)化酵母發(fā)酵液直接催化4氯乙酰乙酸乙酯(COBE)合成(S)4氯3羥基丁酸乙酯(S)CHBE)的反應(yīng)條件. 方法：考察酵母發(fā)酵液催化該反應(yīng)過程中基質(zhì)變化的規(guī)律，研究底物和能源供體對反應(yīng)的影響，并通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化反應(yīng)條件. 結(jié)果：在酵母發(fā)酵液催化COBE不對稱還原反應(yīng)的過程中，底物和還原糖消耗、產(chǎn)物合成相對集中在反應(yīng)的前期；反復(fù)分批式添加底物和蔗糖有利于反應(yīng)效率的提高；正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化反應(yīng)條件的結(jié)果表明：酵母發(fā)酵液直接催化COBE不對稱還原反應(yīng)合成(S)CHBE的最佳反應(yīng)條件為：蔗糖添加方式（反應(yīng)開始2 h后添加5 g/120

7、 mL），底物添加方式0.5(3)，緩沖劑添加量2 g/120 mL，環(huán)糊精添加量為2 g/120 mL，反應(yīng)后測定產(chǎn)物的產(chǎn)率達(dá)96%，ee(對映體過量值)達(dá)100%. 結(jié)論：通過反應(yīng)條件優(yōu)化提高了酵母發(fā)酵液的催化效果.【關(guān)鍵詞】 酵母發(fā)酵液；不對稱還原反應(yīng)；4氯乙酰乙酸乙酯；(S)4氯3羥基丁酸乙酯；正交實(shí)驗(yàn)0引言近年來，通過生物催化劑1-3催化羰基化合物的不對稱還原反應(yīng)合成光學(xué)活性醇的相關(guān)研究備受關(guān)注. 其中，(S)CHBE是合成降血脂、降膽固醇、心血管藥及抗生素等藥物的光學(xué)活性中間體，市場需求很大. 有關(guān)利用酵母干細(xì)胞和基因工程菌催化COBE不對稱還原反應(yīng)合成(S)CHBE的報(bào)道多為基礎(chǔ)

8、性研究4-5. 我們在前期研究酵母發(fā)酵液直接催化COBE不對稱還原反應(yīng)合成(S)CHBE反應(yīng)的基礎(chǔ)上6，進(jìn)一步考察反應(yīng)過程中基質(zhì)的變化規(guī)律和底物、能源供體及添加方式對反應(yīng)的不同影響，優(yōu)化反應(yīng)條件，為建立成熟的生產(chǎn)操作工藝條件奠定技術(shù)基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料Na2CO3為市售化學(xué)純，其他材料參照文獻(xiàn)6的實(shí)驗(yàn)部分1.1試劑.1.2方法統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用正交設(shè)計(jì)助手v3.1（專業(yè)版）統(tǒng)計(jì)軟件分析（F檢驗(yàn)）實(shí)驗(yàn)結(jié)果.2結(jié)果2.1COBE不對稱還原反應(yīng)過程中的基質(zhì)變化規(guī)律在酵母發(fā)酵液催化COBE不對稱還原反應(yīng)合成(S)CHBE的反應(yīng)過程中，底物和產(chǎn)物隨反應(yīng)時(shí)間的變化規(guī)律（圖1）顯示：在酵母發(fā)酵液催化CO

9、BE不對稱還原反應(yīng)的過程中，底物和還原糖消耗、產(chǎn)物合成相對集中在反應(yīng)的前期，在反應(yīng)開始前4 h內(nèi)，底物消耗快，產(chǎn)物生成多，在反應(yīng)后期，兩者的變化都不是很明顯；還原糖在反應(yīng)開始后的前3 h內(nèi)下降很快，后期的變化不明顯. 因此,在反應(yīng)條件控制優(yōu)化中要注意反應(yīng)過程前期工藝條件的控制，降低反應(yīng)的初始底物濃度，提高反應(yīng)效率. 從多次實(shí)驗(yàn)看，反應(yīng)時(shí)間為7 h為好.2.2底物濃度和添加方式對反應(yīng)的影響以酵母發(fā)酵液催化不同濃度COBE的不對稱還原反應(yīng)，結(jié)果（圖2）顯示，隨著COBE的濃度增大，反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)率先是增大，然后逐漸減小，產(chǎn)物光學(xué)純度隨著底物濃度的增大一直遞減；當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^一定值（1.4 g/100

10、mL）時(shí)，底物殘留量逐漸增多.為了增大底物的投放量，將1.5 mL COBE分別采用不同的方式添加后進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果顯示：一次性加入底物1.5 mL（方式）時(shí)，底物殘留59.4%，產(chǎn)物產(chǎn)率和光學(xué)純度分別為67.5%和84.0%；反復(fù)分批式補(bǔ)料的三種方式對反應(yīng)較為有利，以方式添加底物時(shí)，即反應(yīng)開始時(shí)加入1.0 mL，反應(yīng)開始4 h后補(bǔ)加0.5 mL，反應(yīng)結(jié)束后底物殘留稍多，產(chǎn)物產(chǎn)率和光學(xué)純度分別達(dá)到86.0%和89.5%；其他兩種反復(fù)分批式補(bǔ)料方式比以方式添加底物時(shí)對反應(yīng)更為有利. 為了提高底物的初始濃度，在以下的多因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，考察當(dāng)以方式和反復(fù)分批式方式和分別添加底物時(shí)對反應(yīng)的影響.- 28 焦靈利，倪孟祥，陳日，等. 頭孢唑林鈉聯(lián)合舒巴坦鈉對產(chǎn)酶和非產(chǎn)酶菌的體內(nèi)抗菌活性J. 中國藥師，2000,3(5):26629 Gavalda J, Torres C, Tenorio C, et al. Efficacy of ampicillin plus ceftriaxone in treatment of expeimental endocarditis due to Enterococcus faecalis strains highly resistant to aminoglycos