第一章 細胞形態(tài)研究技術(shù)

1、第一章 細胞形態(tài)研究技術(shù) 顯微鏡擴大了人們的視野，自從18世紀人們通過顯微鏡觀察到細胞之后，生物學(xué)家利用各種各樣的顯微鏡研究細胞的形態(tài)和功能?；仡櫦毎飳W(xué)的發(fā)展歷程，我們可以看出顯微鏡的不斷改良促進了細胞生物學(xué)的發(fā)展，而細胞生物學(xué)的發(fā)展對顯微鏡的性能又不斷提出更高的要求。一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)在細胞學(xué)研究中，光學(xué)顯微鏡技術(shù)（light microscopy）發(fā)揮了重要作用。目前人們將多種現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)、計算機技術(shù)融入光鏡技術(shù)，使光學(xué)顯微鏡能顯示出更細微、更清晰的細胞結(jié)構(gòu)。（一）普通光學(xué)顯微鏡技術(shù)光學(xué)顯微鏡一般由光學(xué)部分、機械部分和照明部分組成，其中光學(xué)部分最為關(guān)鍵，它由目鏡（eyepiece）、

2、物鏡（objective lens）組成。照明部分主要包括反光鏡、聚光鏡、光闌三個部分，通過它們可以調(diào)節(jié)視野的明暗度，有時另附有各種濾光片以控制光的波長范圍。機械和支架部分主要由鏡座、鏡柱、鏡筒、調(diào)節(jié)器和載物臺等部分組成，主要起支架和靈活調(diào)控的作用。對任何顯微鏡來說，衡量其性能的主要參數(shù)有分辨率（resolution）和放大倍數(shù)（magnification）。其中，分辨率是最重要的性能參數(shù)，它是指區(qū)分開兩個質(zhì)點間的最小距離，這兩個質(zhì)點之間的距離取決于光源的波長、物鏡的鏡口角（標本在光軸的一點對物鏡鏡口的張角）和介質(zhì)折射率N，它們之間的關(guān)系是： 通常最大值可達140。，空氣中N=1，最短的可見光

3、波長=450nm，此時分辨率D=292nm，約0.3m，若在油鏡下，N可提高到1.5，D則可達0.2m，所以普通光鏡的最大分辯率是0.2m。 在光學(xué)顯微鏡中，物鏡靠近物體，進行第一次放大。目鏡靠近眼睛，將物鏡放大后的像再進行放大，物體經(jīng)兩次放大后，總的放大倍數(shù)為兩個放大倍數(shù)的乘積。這里要注意的是，是否放大倍數(shù)越大，就能看清越小的物體呢？不是。光學(xué)顯微鏡的放大倍數(shù)有一個極限，即 超過上值的放大倍數(shù)，就是無效放大（empty magnification），因為放大倍數(shù)的提高，人眼不能獲得新的細微信息。雖然普通光鏡有足夠大的放大倍數(shù)，分辨率可達0.2m，但是動物細胞一般是無色與半透明的，所以樣品在觀

4、察前要經(jīng)過染色。不同的染料對某種細胞組分有特異的吸附，這樣便能形成足夠的反差以區(qū)分該種細胞組分。如最常用的染色液蘇木精對帶負電荷的分子有較強親和力，因此可揭示出DNA、RNA和酸性蛋白質(zhì)在細胞中的分布；而伊紅和美藍能特異性地與不同蛋白結(jié)合，從而顯示出這些蛋白在細胞內(nèi)的分布情況。（二）相差和微分干涉顯微鏡技術(shù) 光線在通過染色的標本時，其波長和振幅發(fā)生變化，因此普通光學(xué)顯微鏡能觀察經(jīng)過染色的生物標本的結(jié)構(gòu)，而活細胞和未經(jīng)染色的生物標本，當光線通過它時，光的波長和振幅變化不大，所以用普通光學(xué)顯微鏡無法觀察到，只有用相差顯微鏡才能直接觀察。1932年，德國物理學(xué)家Fritz Zernicke研究發(fā)現(xiàn)光

5、線在通過生物標本時，除了波長和振幅的變化外，還有相位的差異，只有將這種相位差轉(zhuǎn)變成振幅差時，才能被人眼分辨出來，即相差理論。將這一理論應(yīng)用于顯微鏡，從而發(fā)明了相差顯微鏡（phase congtrast microscope）。相差顯微鏡最主要的特點就是在其物鏡后裝有一塊“相差板”（phase plate），偏轉(zhuǎn)的光線分別通過相差板的不同區(qū)域，由于相差板上不同區(qū)域有吸光物質(zhì)，所以又使兩組光線之間增添了新的光程差，從而對樣品不同密度造成的相位差起“夸大”作用，最后這兩組光線經(jīng)過透鏡又會聚成一束，發(fā)生互相疊加或抵消的干涉現(xiàn)象，使活細胞的各種結(jié)構(gòu)出現(xiàn)清晰的反差而被觀察到。因為進入物鏡的大部分光線被吸收

6、，所以需要一個強光源，也正因此要盡量避免長時間照射，以免傷害活細胞。在實驗中，通常應(yīng)用的是倒置相差顯微鏡（inverted phase-contrast microscope），它的光源和聚光鏡裝在載物臺上方，相差物鏡在載物臺下方，這樣更便于觀察培養(yǎng)瓶中的活細胞。微分干涉顯微鏡(differential-interference microscope)采用平面偏振光，這些光經(jīng)棱鏡折射后分成兩束，在不同時間經(jīng)過樣品的相鄰部位，然后再經(jīng)過另一棱鏡將這兩束光匯合，從而將樣品厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化為名暗區(qū)別，并且具有很強的立體感。將微分干涉顯微鏡接上錄象機，可以觀察活細胞中的顆粒及細胞器的運動。錄像增差

7、顯微鏡技術(shù)(video-enhanced contrast microscop，VEC)是將計算機輔助系統(tǒng)應(yīng)用于微分干涉顯微鏡的產(chǎn)物，利用此顯微鏡可以得到很高的反差，其分辨率比普通光鏡提高了一個數(shù)量級，這不僅填充了普通光鏡與電鏡之間分辨率范圍的的間隙，而且使在高分辨率下研究活細胞成為可能，例如我們可以利用這種技術(shù)來觀察微管上顆粒的運動。（三）熒光顯微鏡技術(shù)熒光顯微鏡（fluorescence microscope）是以紫外線為光源來激發(fā)生物標本中的熒光物質(zhì)，產(chǎn)生能觀察到的各種顏色熒光的一種光學(xué)顯微鏡，它是研究特異蛋白質(zhì)等生物大分子定性定位的最有力的工具之一。在某些自然生物體如葉綠體等中，存在某

8、些天然的特異性蛋白質(zhì)，它們受到紫外線照射后即可發(fā)出可見光，即熒光。我們將細胞本身存在的物質(zhì)經(jīng)紫外線照射后發(fā)出的熒光稱自發(fā)熒光。另一些細胞內(nèi)成分經(jīng)紫外線照射后不發(fā)熒光，但若用熒光染料進行染色后，就能在熒光顯微鏡下觀察到熒光，這種熒光稱為誘發(fā)熒光。目前可供選擇的熒光染料很多，如DAPI（聯(lián)脒基苯吲哚）可以染DNA；亞啶橙（acridine orange）可以染DNA、RAN；碘化丙啶（propidium iodide）可以染DNA；Hoechest33258、Hoechest33342可以染染色體；四環(huán)素可以染骨骼、牙齒等。將熒光染料和抗體共價結(jié)合，被標記的抗體和相應(yīng)的抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，

9、經(jīng)激光激發(fā)后發(fā)射熒光，從而可以觀察了解抗原在細胞內(nèi)的分布。熒光顯微鏡常以高壓汞燈或弧光燈作為紫外線發(fā)生的光源，在光源和反光鏡之間置有濾光裝置，用來吸收可見光，只讓紫外線通過；在目鏡前裝有另一個濾光片，只容許熒光及可見光通過，將紫外線擋住。（圖1）有的熒光顯微鏡的熒光照明附件能選四種熒光濾色鏡，并與分光鏡、吸收濾色鏡、激發(fā)濾色鏡組合，使四個熒光波長之間可快速轉(zhuǎn)換，熒光顯微鏡便可達到高亮度、高清晰度和高對比度。 圖1 熒光顯微鏡原理（四）激光共焦點掃描顯微鏡技術(shù) 激光共焦點掃描顯微鏡(laser scanning confocal microscope)是20世紀80年代出現(xiàn)的一種新型的顯微鏡，它

10、是在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上裝有激光掃描裝置，以單色激光作為光源，使樣品被激發(fā)出熒光，利用計算機進行圖像處理，從而得到細胞或組織內(nèi)部微細結(jié)構(gòu)的熒光圖像。對于一般的熒光顯微鏡，來自焦平面以外的熒光使觀察到的圖像分辨率和反差降低，而激光共焦點掃描顯微鏡利用激光掃描束經(jīng)照明針孔形成點光源，經(jīng)雙色鏡反射后，通過物鏡匯聚到樣品某一焦點，該焦點發(fā)射的熒光（樣品一般經(jīng)免疫熒光標記）經(jīng)透鏡，在檢測器的檢測針孔處成像，由檢測器收集，其他來自焦平面以外的光則被小孔擋住（圖2）。這樣形成的圖像異常清晰，其分辨率比普通熒光顯微鏡提高1.41.7倍。 圖2 激光共焦點掃描顯微鏡的原理圖A：激光束（光源）經(jīng)雙色鏡反射后，通

11、過物鏡匯聚到樣品某一焦點；B：從焦點發(fā)射的熒光（樣品一般經(jīng)免疫熒光標記）經(jīng)透鏡匯聚成像，被檢出；C：通過樣品其他部位的激光即激光發(fā)出的熒光不會聚焦成像，因而檢測器不能檢出所謂共焦點是指物鏡和聚光鏡同時聚焦到同一個小點，即它們互相共焦點。由于可自動改變觀察的焦平面，而且縱向分辨率（axial resolution）得到改善，因此可以通過“光學(xué)切片”觀察較厚樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。將改變焦點獲得一系列細胞不同切面上的圖像，經(jīng)疊加后便可重構(gòu)出樣品的三維結(jié)構(gòu)。激光共焦點掃描顯微鏡在研究亞細胞結(jié)構(gòu)與組分等方面的應(yīng)用十分廣泛。二、電子顯微鏡技術(shù)（一）透射電子顯微鏡 1.基本原理與結(jié)構(gòu)利用光學(xué)顯微鏡無法看清小于0.

12、2m的細微結(jié)構(gòu)，我們把這些細微結(jié)構(gòu)稱為亞顯微結(jié)構(gòu)(submicroscopic structures)或超微結(jié)構(gòu)(ultramicroscopic structures；ultrastructures)。要看清這些結(jié)構(gòu)，就必須選擇波長更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。1932年Ruska發(fā)明了以電子束為光源的透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM），電子束的波長要比可見光和紫外光短得多，并且電子束的波長與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比，也就是說電壓越高波長越短，目前TEM的分辯力可達0.2nm，放大倍數(shù)最高可達近百萬倍。電子顯微鏡主要由四部分組成

13、（圖3）：電子束照明系統(tǒng)：包括電子槍、聚光鏡。由高頻電流加熱鎢絲發(fā)出電子，經(jīng)高壓使電子加速，經(jīng)過聚光鏡匯聚成電子束；成像系統(tǒng)：包括物鏡、中間鏡與投影鏡等。它們是若干精密加工的中空圓柱體，里面裝置線圈，通過改變線圈的電流大小，調(diào)節(jié)圓柱體空間的磁場強度。電子束經(jīng)過磁場時發(fā)生螺旋式運動，最終的結(jié)果如同光線通過玻璃透鏡時一樣，聚焦成像；真空系統(tǒng)：用兩級真空泵不斷抽氣，保持電子槍、鏡筒及紀錄系統(tǒng)內(nèi)的高真空；記錄系統(tǒng)：電子成像須通過熒光屏顯示用于觀察，或用感光膠片記錄下來。 圖3 透射電子顯微鏡的結(jié)構(gòu)組成示意圖另外，由于電子在空氣里穿透力很弱，所以電鏡的鏡筒必須抽成真空，否則高速運動的電子核氣體分子相互碰

14、撞，會使高速電子散射而偏離軌道，使電鏡不能正常工作。電鏡鏡筒的真空度越高，其使用性能也就越好。2.主要電鏡制樣技術(shù)（1）超薄切片的制備由于電子束的穿透能力有限，為了獲得較高分辨率，需要使用超薄切片機制成厚度一般僅為4050nm的超薄切片。這就需要樣品有一定的剛性和韌性，為此，樣品需要包埋在特殊的介質(zhì)中。但包埋的過程會破壞樣品的結(jié)構(gòu)，因此超薄切片樣品制備的第一步就是固定，以便更好地保存細胞地精細結(jié)構(gòu)。固定：固定是電鏡樣品制備過程中最重要的一個環(huán)節(jié)，若固定方法選得適當，樣品的超微結(jié)構(gòu)盡能十分接近活體狀態(tài)。目前常用的固定劑為四氧化鋨（OsO4）和戊二醛等。由于單一的固定劑并不能固定細胞內(nèi)所有的組分，

15、因此通常需聯(lián)合使用不同的固定劑，這樣可取得較好的固定效果。戊二醛是一種化學(xué)交聯(lián)劑，其滲透速率較四氧化鋨快，它不但能固定蛋白，而且還能固定一些糖類，特別是糖原，因此一般用戊二醛進行前固定。但是戊二醛對大多數(shù)脂類的固定作用并不強，而且樣品僅用戊二醛固定后，其反差不好，最好再用四氧化鋨進行后固定。四氧化鋨是一種重金屬化合物，能與不飽和脂肪酸反應(yīng)，是膜結(jié)構(gòu)的最佳固定劑，在隨后的脫水過程中四氧化鋨被還原形成鋨黑，可以使樣品的反差增強，但它的缺點是滲透緩慢，對酶活性和抗原活性的破壞較大。固定方法一般采用組織快沉浸固定法，但對于血管豐富、質(zhì)地較軟的組織，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、視網(wǎng)膜等，一般采用灌注固定法，該方法可

16、使固定液迅速均勻地滲透到組織的各個部分。包埋：包埋的目的是要使樣品中各種細微結(jié)構(gòu)在切片中得到均勻良好的支撐，使切成的超薄切片仍能保持連續(xù)完整并且有足夠的強度，并可耐受干燥以及電子轟擊、高溫和真空揮發(fā)。理想的包埋劑應(yīng)符合以下幾點：第一，在鏡下不顯示其本身結(jié)構(gòu)；第二，在聚合時不發(fā)生明顯的收縮，以防止樣品中細微結(jié)構(gòu)的損壞和移位；第三，應(yīng)具有良好的剛性和韌性以利于切片；第四，包埋劑還應(yīng)易被電子穿透。目前常用的包埋劑是環(huán)氧樹脂和丙烯酸樹脂等。生物樣品固定后通常仍含有大量水分，而包埋劑又多于水不相溶，所以在包埋前通常要經(jīng)過濃度遞增的乙醇或丙酮進行脫水。切片：包埋好的組織需用超薄切片機切成超薄切片，其厚度一

17、般是4050nm，以熱膨脹或螺旋推進的方式推進樣品切片。切片刀以玻璃或鉆石為材料，最常用的是玻璃刀。切片通常收集在覆有支持膜（如透明塑膠膜）的載網(wǎng)（銅網(wǎng)或鎳網(wǎng)）上才能在電鏡下觀察。染色：由于生物樣品多是由C、H、O、N等元素組成，這些元素原子序數(shù)低，散射電子能力弱，在電鏡下的反差很弱，因此通常需用高分子量的金屬鹽對超薄切片進行染色，以形成明暗反差。用此種方法染色的標本通過電子束振幅的改變觀察到黑白圖像，而不能像光鏡切片染色那樣通過改變波長而獲得彩色圖像。常用的染色液是醋酸雙氧鈾（易染核酸）和鉛鹽（易染蛋白質(zhì)）。（2）負染色技術(shù) 一些細小的顆粒標本如線粒體基粒、核糖體、纖維蛋白、病毒等可以通過負

18、染色（negative staining）電鏡技術(shù)觀察其精細結(jié)構(gòu)，其分辨率可達1.5nm左右，它的制備過程如下：首先將樣品制成懸液，滴于載網(wǎng)上；其次再用重金屬物質(zhì)將樣品包繞起來。由于重金屬物質(zhì)散射電子的能力較樣品本身強，所以在電鏡下這兩者就顯示出明顯的明暗對比，樣品將呈亮色，而周圍的背景將呈暗色，這樣樣品表面的微細結(jié)構(gòu)就被襯托出來。最常用的染色劑是2磷鎢酸水溶液。（3）冷凍蝕刻技術(shù)冷凍蝕刻（freeze etching）的基本操作過程是將樣品用液氮固定后，然后裝入專門的冷凍蝕刻儀中，在低溫真空狀態(tài)下進行斷裂。這時樣品往往從其結(jié)構(gòu)相對“脆弱”的部位（如膜脂雙分子層的疏水端）斷裂。然后稍稍升溫，使

19、斷裂面上的冰少量升華，這樣埋在冰中的蛋白質(zhì)顆粒的立體結(jié)構(gòu)就會進一步增強，這一過程稱為蝕刻。隨后從45。方向用鉑、金等金屬進行噴鍍，這樣整個斷裂面的微細結(jié)構(gòu)就復(fù)印在這層金屬薄膜上（又稱復(fù)型膜），再從垂直方向噴一層碳，加固復(fù)型膜，最后用消化液把樣品本身消化掉，將剩下的復(fù)型膜撈在載網(wǎng)上，干燥后用投射電鏡直接進行觀察。冷凍蝕刻主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)，其圖形富有立體感，并能更好地保持樣品地真實結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上發(fā)展的快速冷凍深度蝕刻技術(shù)（quick freeze deep etching）可用于觀察胞質(zhì)中地細胞骨架纖維及其結(jié)合蛋白。（三）掃描電子顯微鏡技術(shù) 1.基本原理：20世紀60

20、年掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope,SEM）逐漸引起人們的重視，其電子槍發(fā)射出的電子束被電磁透鏡匯聚成極細的電子“探針”，在樣品表面進行“掃描”，電子束可激發(fā)樣品表面放出二次電子，二次電子產(chǎn)生的多少與樣品的形狀有關(guān)。二次電子由探測器收集，并被轉(zhuǎn)化成光信號，再經(jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變成電壓信號來控制熒光屏上電子束的強度。這樣，樣品不同部位上產(chǎn)生二次電子多或少的差異，直接反映在熒光屏相應(yīng)部位亮或暗的差別，從而得到一幅放大的立體感很強的圖像。（圖4） 圖4 掃描電鏡下的血細胞2.制樣技術(shù) 掃描電子顯微鏡用來觀察樣品表面的形貌，如何保持樣品表面不皺縮、不塌陷是制

21、樣的關(guān)鍵。而生物樣品在干燥過程中由于表面張力的作用極易發(fā)生變形，解決這一問題最常用的是CO2臨界點干燥法。眾所周知，每一物質(zhì)存在著一個“臨界狀態(tài)”，如若將水置于密閉容器內(nèi)，當溫度不斷上升，容器內(nèi)蒸汽壓力不斷升高時，氣態(tài)水分子不斷增多，其密度越來越大，當氣態(tài)與液態(tài)密度達到一致，兩相界面消失，我們把這一狀態(tài)稱為臨界狀態(tài)，此時的溫度稱為臨界溫度，此時的壓力稱為臨界壓力。在臨界狀態(tài)時，氣-液相界面消失，物質(zhì)的表面張力系數(shù)為零，這時的氣體無論在多大壓強下，都不會變成液體。含水樣品處在這樣高密度蒸汽下，緩慢放氣和減壓，最后使樣品內(nèi)的水分子全部氣化而達到干燥。由于水的臨界溫度和臨界壓力太高，所以要用一種臨界溫度和壓力都較低的有機溶劑作媒介，先將樣品中的水置換出來，再用與有機溶劑互溶性較好的CO2置換此有機溶劑來進行臨界點干燥。這就是C