第一章 細(xì)胞形態(tài)研究技術(shù)

1、第一章 細(xì)胞形態(tài)研究技術(shù) 顯微鏡擴(kuò)大了人們的視野，自從18世紀(jì)人們通過(guò)顯微鏡觀察到細(xì)胞之后，生物學(xué)家利用各種各樣的顯微鏡研究細(xì)胞的形態(tài)和功能?；仡櫦?xì)胞生物學(xué)的發(fā)展歷程，我們可以看出顯微鏡的不斷改良促進(jìn)了細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，而細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展對(duì)顯微鏡的性能又不斷提出更高的要求。一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)在細(xì)胞學(xué)研究中，光學(xué)顯微鏡技術(shù)（light microscopy）發(fā)揮了重要作用。目前人們將多種現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)融入光鏡技術(shù)，使光學(xué)顯微鏡能顯示出更細(xì)微、更清晰的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。（一）普通光學(xué)顯微鏡技術(shù)光學(xué)顯微鏡一般由光學(xué)部分、機(jī)械部分和照明部分組成，其中光學(xué)部分最為關(guān)鍵，它由目鏡（eyepiece）、

2、物鏡（objective lens）組成。照明部分主要包括反光鏡、聚光鏡、光闌三個(gè)部分，通過(guò)它們可以調(diào)節(jié)視野的明暗度，有時(shí)另附有各種濾光片以控制光的波長(zhǎng)范圍。機(jī)械和支架部分主要由鏡座、鏡柱、鏡筒、調(diào)節(jié)器和載物臺(tái)等部分組成，主要起支架和靈活調(diào)控的作用。對(duì)任何顯微鏡來(lái)說(shuō)，衡量其性能的主要參數(shù)有分辨率（resolution）和放大倍數(shù)（magnification）。其中，分辨率是最重要的性能參數(shù)，它是指區(qū)分開(kāi)兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離，這兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)之間的距離取決于光源的波長(zhǎng)、物鏡的鏡口角（標(biāo)本在光軸的一點(diǎn)對(duì)物鏡鏡口的張角）和介質(zhì)折射率N，它們之間的關(guān)系是： 通常最大值可達(dá)140。，空氣中N=1，最短的可見(jiàn)光

3、波長(zhǎng)=450nm，此時(shí)分辨率D=292nm，約0.3m，若在油鏡下，N可提高到1.5，D則可達(dá)0.2m，所以普通光鏡的最大分辯率是0.2m。 在光學(xué)顯微鏡中，物鏡靠近物體，進(jìn)行第一次放大。目鏡靠近眼睛，將物鏡放大后的像再進(jìn)行放大，物體經(jīng)兩次放大后，總的放大倍數(shù)為兩個(gè)放大倍數(shù)的乘積。這里要注意的是，是否放大倍數(shù)越大，就能看清越小的物體呢？不是。光學(xué)顯微鏡的放大倍數(shù)有一個(gè)極限，即 超過(guò)上值的放大倍數(shù)，就是無(wú)效放大（empty magnification），因?yàn)榉糯蟊稊?shù)的提高，人眼不能獲得新的細(xì)微信息。雖然普通光鏡有足夠大的放大倍數(shù)，分辨率可達(dá)0.2m，但是動(dòng)物細(xì)胞一般是無(wú)色與半透明的，所以樣品在觀

4、察前要經(jīng)過(guò)染色。不同的染料對(duì)某種細(xì)胞組分有特異的吸附，這樣便能形成足夠的反差以區(qū)分該種細(xì)胞組分。如最常用的染色液蘇木精對(duì)帶負(fù)電荷的分子有較強(qiáng)親和力，因此可揭示出DNA、RNA和酸性蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的分布；而伊紅和美藍(lán)能特異性地與不同蛋白結(jié)合，從而顯示出這些蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。（二）相差和微分干涉顯微鏡技術(shù) 光線(xiàn)在通過(guò)染色的標(biāo)本時(shí)，其波長(zhǎng)和振幅發(fā)生變化，因此普通光學(xué)顯微鏡能觀察經(jīng)過(guò)染色的生物標(biāo)本的結(jié)構(gòu)，而活細(xì)胞和未經(jīng)染色的生物標(biāo)本，當(dāng)光線(xiàn)通過(guò)它時(shí)，光的波長(zhǎng)和振幅變化不大，所以用普通光學(xué)顯微鏡無(wú)法觀察到，只有用相差顯微鏡才能直接觀察。1932年，德國(guó)物理學(xué)家Fritz Zernicke研究發(fā)現(xiàn)光

5、線(xiàn)在通過(guò)生物標(biāo)本時(shí)，除了波長(zhǎng)和振幅的變化外，還有相位的差異，只有將這種相位差轉(zhuǎn)變成振幅差時(shí)，才能被人眼分辨出來(lái)，即相差理論。將這一理論應(yīng)用于顯微鏡，從而發(fā)明了相差顯微鏡（phase congtrast microscope）。相差顯微鏡最主要的特點(diǎn)就是在其物鏡后裝有一塊“相差板”（phase plate），偏轉(zhuǎn)的光線(xiàn)分別通過(guò)相差板的不同區(qū)域，由于相差板上不同區(qū)域有吸光物質(zhì)，所以又使兩組光線(xiàn)之間增添了新的光程差，從而對(duì)樣品不同密度造成的相位差起“夸大”作用，最后這兩組光線(xiàn)經(jīng)過(guò)透鏡又會(huì)聚成一束，發(fā)生互相疊加或抵消的干涉現(xiàn)象，使活細(xì)胞的各種結(jié)構(gòu)出現(xiàn)清晰的反差而被觀察到。因?yàn)檫M(jìn)入物鏡的大部分光線(xiàn)被吸收

6、，所以需要一個(gè)強(qiáng)光源，也正因此要盡量避免長(zhǎng)時(shí)間照射，以免傷害活細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)中，通常應(yīng)用的是倒置相差顯微鏡（inverted phase-contrast microscope），它的光源和聚光鏡裝在載物臺(tái)上方，相差物鏡在載物臺(tái)下方，這樣更便于觀察培養(yǎng)瓶中的活細(xì)胞。微分干涉顯微鏡(differential-interference microscope)采用平面偏振光，這些光經(jīng)棱鏡折射后分成兩束，在不同時(shí)間經(jīng)過(guò)樣品的相鄰部位，然后再經(jīng)過(guò)另一棱鏡將這兩束光匯合，從而將樣品厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化為名暗區(qū)別，并且具有很強(qiáng)的立體感。將微分干涉顯微鏡接上錄象機(jī)，可以觀察活細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)。錄像增差

7、顯微鏡技術(shù)(video-enhanced contrast microscop，VEC)是將計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)應(yīng)用于微分干涉顯微鏡的產(chǎn)物，利用此顯微鏡可以得到很高的反差，其分辨率比普通光鏡提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，這不僅填充了普通光鏡與電鏡之間分辨率范圍的的間隙，而且使在高分辨率下研究活細(xì)胞成為可能，例如我們可以利用這種技術(shù)來(lái)觀察微管上顆粒的運(yùn)動(dòng)。（三）熒光顯微鏡技術(shù)熒光顯微鏡（fluorescence microscope）是以紫外線(xiàn)為光源來(lái)激發(fā)生物標(biāo)本中的熒光物質(zhì)，產(chǎn)生能觀察到的各種顏色熒光的一種光學(xué)顯微鏡，它是研究特異蛋白質(zhì)等生物大分子定性定位的最有力的工具之一。在某些自然生物體如葉綠體等中，存在某

8、些天然的特異性蛋白質(zhì)，它們受到紫外線(xiàn)照射后即可發(fā)出可見(jiàn)光，即熒光。我們將細(xì)胞本身存在的物質(zhì)經(jīng)紫外線(xiàn)照射后發(fā)出的熒光稱(chēng)自發(fā)熒光。另一些細(xì)胞內(nèi)成分經(jīng)紫外線(xiàn)照射后不發(fā)熒光，但若用熒光染料進(jìn)行染色后，就能在熒光顯微鏡下觀察到熒光，這種熒光稱(chēng)為誘發(fā)熒光。目前可供選擇的熒光染料很多，如DAPI（聯(lián)脒基苯吲哚）可以染DNA；亞啶橙（acridine orange）可以染DNA、RAN；碘化丙啶（propidium iodide）可以染DNA；Hoechest33258、Hoechest33342可以染染色體；四環(huán)素可以染骨骼、牙齒等。將熒光染料和抗體共價(jià)結(jié)合，被標(biāo)記的抗體和相應(yīng)的抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，

9、經(jīng)激光激發(fā)后發(fā)射熒光，從而可以觀察了解抗原在細(xì)胞內(nèi)的分布。熒光顯微鏡常以高壓汞燈或弧光燈作為紫外線(xiàn)發(fā)生的光源，在光源和反光鏡之間置有濾光裝置，用來(lái)吸收可見(jiàn)光，只讓紫外線(xiàn)通過(guò)；在目鏡前裝有另一個(gè)濾光片，只容許熒光及可見(jiàn)光通過(guò)，將紫外線(xiàn)擋住。（圖1）有的熒光顯微鏡的熒光照明附件能選四種熒光濾色鏡，并與分光鏡、吸收濾色鏡、激發(fā)濾色鏡組合，使四個(gè)熒光波長(zhǎng)之間可快速轉(zhuǎn)換，熒光顯微鏡便可達(dá)到高亮度、高清晰度和高對(duì)比度。 圖1 熒光顯微鏡原理（四）激光共焦點(diǎn)掃描顯微鏡技術(shù) 激光共焦點(diǎn)掃描顯微鏡(laser scanning confocal microscope)是20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的一種新型的顯微鏡，它

10、是在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上裝有激光掃描裝置，以單色激光作為光源，使樣品被激發(fā)出熒光，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像。對(duì)于一般的熒光顯微鏡，來(lái)自焦平面以外的熒光使觀察到的圖像分辨率和反差降低，而激光共焦點(diǎn)掃描顯微鏡利用激光掃描束經(jīng)照明針孔形成點(diǎn)光源，經(jīng)雙色鏡反射后，通過(guò)物鏡匯聚到樣品某一焦點(diǎn)，該焦點(diǎn)發(fā)射的熒光（樣品一般經(jīng)免疫熒光標(biāo)記）經(jīng)透鏡，在檢測(cè)器的檢測(cè)針孔處成像，由檢測(cè)器收集，其他來(lái)自焦平面以外的光則被小孔擋?。▓D2）。這樣形成的圖像異常清晰，其分辨率比普通熒光顯微鏡提高1.41.7倍。 圖2 激光共焦點(diǎn)掃描顯微鏡的原理圖A：激光束（光源）經(jīng)雙色鏡反射后，通

11、過(guò)物鏡匯聚到樣品某一焦點(diǎn)；B：從焦點(diǎn)發(fā)射的熒光（樣品一般經(jīng)免疫熒光標(biāo)記）經(jīng)透鏡匯聚成像，被檢出；C：通過(guò)樣品其他部位的激光即激光發(fā)出的熒光不會(huì)聚焦成像，因而檢測(cè)器不能檢出所謂共焦點(diǎn)是指物鏡和聚光鏡同時(shí)聚焦到同一個(gè)小點(diǎn)，即它們互相共焦點(diǎn)。由于可自動(dòng)改變觀察的焦平面，而且縱向分辨率（axial resolution）得到改善，因此可以通過(guò)“光學(xué)切片”觀察較厚樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。將改變焦點(diǎn)獲得一系列細(xì)胞不同切面上的圖像，經(jīng)疊加后便可重構(gòu)出樣品的三維結(jié)構(gòu)。激光共焦點(diǎn)掃描顯微鏡在研究亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與組分等方面的應(yīng)用十分廣泛。二、電子顯微鏡技術(shù)（一）透射電子顯微鏡 1.基本原理與結(jié)構(gòu)利用光學(xué)顯微鏡無(wú)法看清小于0.

12、2m的細(xì)微結(jié)構(gòu)，我們把這些細(xì)微結(jié)構(gòu)稱(chēng)為亞顯微結(jié)構(gòu)(submicroscopic structures)或超微結(jié)構(gòu)(ultramicroscopic structures；ultrastructures)。要看清這些結(jié)構(gòu)，就必須選擇波長(zhǎng)更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。1932年Ruska發(fā)明了以電子束為光源的透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM），電子束的波長(zhǎng)要比可見(jiàn)光和紫外光短得多，并且電子束的波長(zhǎng)與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比，也就是說(shuō)電壓越高波長(zhǎng)越短，目前TEM的分辯力可達(dá)0.2nm，放大倍數(shù)最高可達(dá)近百萬(wàn)倍。電子顯微鏡主要由四部分組成

13、（圖3）：電子束照明系統(tǒng)：包括電子槍、聚光鏡。由高頻電流加熱鎢絲發(fā)出電子，經(jīng)高壓使電子加速，經(jīng)過(guò)聚光鏡匯聚成電子束；成像系統(tǒng)：包括物鏡、中間鏡與投影鏡等。它們是若干精密加工的中空?qǐng)A柱體，里面裝置線(xiàn)圈，通過(guò)改變線(xiàn)圈的電流大小，調(diào)節(jié)圓柱體空間的磁場(chǎng)強(qiáng)度。電子束經(jīng)過(guò)磁場(chǎng)時(shí)發(fā)生螺旋式運(yùn)動(dòng)，最終的結(jié)果如同光線(xiàn)通過(guò)玻璃透鏡時(shí)一樣，聚焦成像；真空系統(tǒng)：用兩級(jí)真空泵不斷抽氣，保持電子槍、鏡筒及紀(jì)錄系統(tǒng)內(nèi)的高真空；記錄系統(tǒng)：電子成像須通過(guò)熒光屏顯示用于觀察，或用感光膠片記錄下來(lái)。 圖3 透射電子顯微鏡的結(jié)構(gòu)組成示意圖另外，由于電子在空氣里穿透力很弱，所以電鏡的鏡筒必須抽成真空，否則高速運(yùn)動(dòng)的電子核氣體分子相互碰

14、撞，會(huì)使高速電子散射而偏離軌道，使電鏡不能正常工作。電鏡鏡筒的真空度越高，其使用性能也就越好。2.主要電鏡制樣技術(shù)（1）超薄切片的制備由于電子束的穿透能力有限，為了獲得較高分辨率，需要使用超薄切片機(jī)制成厚度一般僅為4050nm的超薄切片。這就需要樣品有一定的剛性和韌性，為此，樣品需要包埋在特殊的介質(zhì)中。但包埋的過(guò)程會(huì)破壞樣品的結(jié)構(gòu)，因此超薄切片樣品制備的第一步就是固定，以便更好地保存細(xì)胞地精細(xì)結(jié)構(gòu)。固定：固定是電鏡樣品制備過(guò)程中最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，若固定方法選得適當(dāng)，樣品的超微結(jié)構(gòu)盡能十分接近活體狀態(tài)。目前常用的固定劑為四氧化鋨（OsO4）和戊二醛等。由于單一的固定劑并不能固定細(xì)胞內(nèi)所有的組分，

15、因此通常需聯(lián)合使用不同的固定劑，這樣可取得較好的固定效果。戊二醛是一種化學(xué)交聯(lián)劑，其滲透速率較四氧化鋨快，它不但能固定蛋白，而且還能固定一些糖類(lèi)，特別是糖原，因此一般用戊二醛進(jìn)行前固定。但是戊二醛對(duì)大多數(shù)脂類(lèi)的固定作用并不強(qiáng)，而且樣品僅用戊二醛固定后，其反差不好，最好再用四氧化鋨進(jìn)行后固定。四氧化鋨是一種重金屬化合物，能與不飽和脂肪酸反應(yīng)，是膜結(jié)構(gòu)的最佳固定劑，在隨后的脫水過(guò)程中四氧化鋨被還原形成鋨黑，可以使樣品的反差增強(qiáng)，但它的缺點(diǎn)是滲透緩慢，對(duì)酶活性和抗原活性的破壞較大。固定方法一般采用組織快沉浸固定法，但對(duì)于血管豐富、質(zhì)地較軟的組織，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、視網(wǎng)膜等，一般采用灌注固定法，該方法可

16、使固定液迅速均勻地滲透到組織的各個(gè)部分。包埋：包埋的目的是要使樣品中各種細(xì)微結(jié)構(gòu)在切片中得到均勻良好的支撐，使切成的超薄切片仍能保持連續(xù)完整并且有足夠的強(qiáng)度，并可耐受干燥以及電子轟擊、高溫和真空揮發(fā)。理想的包埋劑應(yīng)符合以下幾點(diǎn)：第一，在鏡下不顯示其本身結(jié)構(gòu)；第二，在聚合時(shí)不發(fā)生明顯的收縮，以防止樣品中細(xì)微結(jié)構(gòu)的損壞和移位；第三，應(yīng)具有良好的剛性和韌性以利于切片；第四，包埋劑還應(yīng)易被電子穿透。目前常用的包埋劑是環(huán)氧樹(shù)脂和丙烯酸樹(shù)脂等。生物樣品固定后通常仍含有大量水分，而包埋劑又多于水不相溶，所以在包埋前通常要經(jīng)過(guò)濃度遞增的乙醇或丙酮進(jìn)行脫水。切片：包埋好的組織需用超薄切片機(jī)切成超薄切片，其厚度一

17、般是4050nm，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式推進(jìn)樣品切片。切片刀以玻璃或鉆石為材料，最常用的是玻璃刀。切片通常收集在覆有支持膜（如透明塑膠膜）的載網(wǎng)（銅網(wǎng)或鎳網(wǎng)）上才能在電鏡下觀察。染色：由于生物樣品多是由C、H、O、N等元素組成，這些元素原子序數(shù)低，散射電子能力弱，在電鏡下的反差很弱，因此通常需用高分子量的金屬鹽對(duì)超薄切片進(jìn)行染色，以形成明暗反差。用此種方法染色的標(biāo)本通過(guò)電子束振幅的改變觀察到黑白圖像，而不能像光鏡切片染色那樣通過(guò)改變波長(zhǎng)而獲得彩色圖像。常用的染色液是醋酸雙氧鈾（易染核酸）和鉛鹽（易染蛋白質(zhì)）。（2）負(fù)染色技術(shù) 一些細(xì)小的顆粒標(biāo)本如線(xiàn)粒體基粒、核糖體、纖維蛋白、病毒等可以通過(guò)負(fù)

18、染色（negative staining）電鏡技術(shù)觀察其精細(xì)結(jié)構(gòu)，其分辨率可達(dá)1.5nm左右，它的制備過(guò)程如下：首先將樣品制成懸液，滴于載網(wǎng)上；其次再用重金屬物質(zhì)將樣品包繞起來(lái)。由于重金屬物質(zhì)散射電子的能力較樣品本身強(qiáng)，所以在電鏡下這兩者就顯示出明顯的明暗對(duì)比，樣品將呈亮色，而周?chē)谋尘皩⒊拾瞪?，這樣樣品表面的微細(xì)結(jié)構(gòu)就被襯托出來(lái)。最常用的染色劑是2磷鎢酸水溶液。（3）冷凍蝕刻技術(shù)冷凍蝕刻（freeze etching）的基本操作過(guò)程是將樣品用液氮固定后，然后裝入專(zhuān)門(mén)的冷凍蝕刻儀中，在低溫真空狀態(tài)下進(jìn)行斷裂。這時(shí)樣品往往從其結(jié)構(gòu)相對(duì)“脆弱”的部位（如膜脂雙分子層的疏水端）斷裂。然后稍稍升溫，使

19、斷裂面上的冰少量升華，這樣埋在冰中的蛋白質(zhì)顆粒的立體結(jié)構(gòu)就會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)，這一過(guò)程稱(chēng)為蝕刻。隨后從45。方向用鉑、金等金屬進(jìn)行噴鍍，這樣整個(gè)斷裂面的微細(xì)結(jié)構(gòu)就復(fù)印在這層金屬薄膜上（又稱(chēng)復(fù)型膜），再?gòu)拇怪狈较驀娨粚犹?，加固?fù)型膜，最后用消化液把樣品本身消化掉，將剩下的復(fù)型膜撈在載網(wǎng)上，干燥后用投射電鏡直接進(jìn)行觀察。冷凍蝕刻主要用來(lái)觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)，其圖形富有立體感，并能更好地保持樣品地真實(shí)結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上發(fā)展的快速冷凍深度蝕刻技術(shù)（quick freeze deep etching）可用于觀察胞質(zhì)中地細(xì)胞骨架纖維及其結(jié)合蛋白。（三）掃描電子顯微鏡技術(shù) 1.基本原理：20世紀(jì)60

20、年掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope,SEM）逐漸引起人們的重視，其電子槍發(fā)射出的電子束被電磁透鏡匯聚成極細(xì)的電子“探針”，在樣品表面進(jìn)行“掃描”，電子束可激發(fā)樣品表面放出二次電子，二次電子產(chǎn)生的多少與樣品的形狀有關(guān)。二次電子由探測(cè)器收集，并被轉(zhuǎn)化成光信號(hào)，再經(jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變成電壓信號(hào)來(lái)控制熒光屏上電子束的強(qiáng)度。這樣，樣品不同部位上產(chǎn)生二次電子多或少的差異，直接反映在熒光屏相應(yīng)部位亮或暗的差別，從而得到一幅放大的立體感很強(qiáng)的圖像。（圖4） 圖4 掃描電鏡下的血細(xì)胞2.制樣技術(shù) 掃描電子顯微鏡用來(lái)觀察樣品表面的形貌，如何保持樣品表面不皺縮、不塌陷是制

21、樣的關(guān)鍵。而生物樣品在干燥過(guò)程中由于表面張力的作用極易發(fā)生變形，解決這一問(wèn)題最常用的是CO2臨界點(diǎn)干燥法。眾所周知，每一物質(zhì)存在著一個(gè)“臨界狀態(tài)”，如若將水置于密閉容器內(nèi)，當(dāng)溫度不斷上升，容器內(nèi)蒸汽壓力不斷升高時(shí)，氣態(tài)水分子不斷增多，其密度越來(lái)越大，當(dāng)氣態(tài)與液態(tài)密度達(dá)到一致，兩相界面消失，我們把這一狀態(tài)稱(chēng)為臨界狀態(tài)，此時(shí)的溫度稱(chēng)為臨界溫度，此時(shí)的壓力稱(chēng)為臨界壓力。在臨界狀態(tài)時(shí)，氣-液相界面消失，物質(zhì)的表面張力系數(shù)為零，這時(shí)的氣體無(wú)論在多大壓強(qiáng)下，都不會(huì)變成液體。含水樣品處在這樣高密度蒸汽下，緩慢放氣和減壓，最后使樣品內(nèi)的水分子全部氣化而達(dá)到干燥。由于水的臨界溫度和臨界壓力太高，所以要用一種臨界溫度和壓力都較低的有機(jī)溶劑作媒介，先將樣品中的水置換出來(lái)，再用與有機(jī)溶劑互溶性較好的CO2置換此有機(jī)溶劑來(lái)進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥。這就是C