成果詳細介紹

1、成果詳細介紹綜合介紹隨著人們生活節(jié)奏的加快和飲食結構的變化，罹患癌癥的人群增多，對癌癥的前期診斷和術后的監(jiān)控尤為重要。前期研究發(fā)現(xiàn)miR-196a-5p和miR-125a-5p在肺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，它們的表達水平被應用于臨床檢驗，有望成為肺癌早期診斷及區(qū)分肺癌不同分期的客觀指標?；诤Ｄ憼罱鸺{米粒子的表面增強拉曼散射技術（SERS）和側向層析分析技術（GICA）的各自特點，我們通過結合 SERS 和側向層析技術來建立一種新型的miRNA 檢測方法-SERS-GICA 技術。該方法充分發(fā)揮了 SERS 和 GICA 各自的優(yōu)勢，利用海膽狀金納米粒子的SERS技術可實現(xiàn)對病例樣本中目標 mi

2、RNA 的高靈敏、定量化檢測，減少主觀因素的影響，有利于監(jiān)測病人病情變化及治療情況。GICA中硝酸纖維（NC）膜不僅成本低、易操作、簡便、快捷，而且SERS標記探針高度集中在約 150 mm 寬的檢測線（T 線），可采集到更為均勻的信號。本課題研究開展的重點工作，主要是：（1）基于海膽狀金納米粒子和金納米多巴胺樹脂（PDRGNPs）復合微球構建“三明治”結構SERS傳感器，對水溶液中 miR-196a-5p進行定量檢測。（2）制備多線多重SERS-GICA核酸試紙條，將其用于檢測皮下異種腫瘤移植的小鼠肺癌發(fā)生發(fā)展階段外周血中miR-196a-5p和miR-125a-5p的表達變化。（3）為了進

3、一步鑒定這兩種miRNA作為肺癌標志物的潛力，基于多線多重SERS-GICA核酸試紙條檢測miR-196a-5p和 miR-125a-5p在肺癌患者和健康人外周血、 尿液和痰液中的表達水平。 研究這兩種miRNA 在不同分期肺癌患者外周血、 尿液和痰液中表達情況，并分析兩者之間的相關性。（4）建立SERS-GICA單線多重檢測miRNA的方法，實現(xiàn)單線同時檢測人肺癌細胞系中miR-196a-5p和miR-125a-5p的表達水平。本研究拓展了miRNA檢測方法，對實現(xiàn)肺癌早期診斷和病情監(jiān)控具有重要意義。該試紙為肺癌早期診療做出貢獻，同時也可以為其他疾病的檢測提供通用平臺。1. 研究目標（1）制

4、備形貌均一、單分散性好和表面增強拉曼散射（SERS）效應強的海膽狀金納米粒子（UGNs）。（2）選擇最優(yōu)條件，制備形貌好且SERS效應強的金納米多巴胺樹脂（PDRGNPs）復合微球。構建UGNs-SH probe-miRNA-T probe-PDRGNPs“三明治”結構的SERS傳感器，并將其用于檢測溶液中miRNA-196a-5p的濃度。（3）以海膽狀金納米粒子作為增強基底，構建多線多重和單線多重檢測miRNA的表面增強拉曼散射側向層析（SERS-GICA）核酸試紙條。建立快速、定量檢測細胞、外周血、尿液和痰液中miRNA的新方法。 探明在肺癌不同時期，肺癌患者外周血、尿液和痰液中miRNA

5、-196a-5p和miRNA-125a-5p表達水平的變化。2. 研究內容（1）采用種子介導生長法制備海膽狀金納米粒子。研究改變反應體系中反應物濃度和反應條件對產(chǎn)物的形貌、光學性質以及SERS效應的影響，從而提出最適合的合成條件。（2）以多巴胺作為反應單體來制備多巴胺樹脂（PDR）微球。接著將金納米顆粒（GNPs）通過簡單地原位吸附還原的方法成功地包裹在PDR微球的表面形成PDRGNPs復合微球。研究不同濃度的氯金酸對PDRGNPs復合微球表面形貌的影響。優(yōu)化條件，制備形貌好且SERS效應強的PDRGNPs復合微球。（3）在海膽狀金納米粒子和PDRGNPs復合微球的表面分別固定檢測探針（SH

6、probe）和捕獲探針（T probe），待測物miR-196a-5p與SH probe和T Probe部分雜交構建一種“三明治”結構的SERS傳感器，用于檢測不同濃度的miR-196a-5p。（4）在傳統(tǒng)的側向層析核酸試紙條的基礎上，通過在試紙中間的硝酸纖維素膜（NC膜）上的不同位置固定相應的捕獲探針T probe，即增加檢測線（T 線）的數(shù)量，將海膽狀金納米粒子表面修飾拉曼信號分子對巰基苯甲酸（4-MBA）和檢測探針SH probe，利用“三明治”結構檢測模型，構建多線多重檢測肺癌患者外周血、尿液和痰液中miR-196a-5p和miR-125a-5p的SERS-GICA核酸試紙條。根據(jù)試紙

7、條中T線的位置可知待測miRNA的種類。通過不同T線處4-MBA特征峰的強度間接檢測miRNA的表達水平。研究在不同分期肺癌患者外周血、尿液和痰液中這兩種miRNA表達水平的差異，分析它們的表達水平與病程進展的相關性。（5）為了能夠同時檢測幾種miRNA，建立SERS-GICA單線多重檢測miRNA的方法。選擇兩種具有可區(qū)分特征峰的拉曼信號分子硫堇和尼羅藍A（NBA），標記到海膽狀金納米粒子的表面。在NC膜上設計一條質控線（C線）和一條T線，而T線上同時固定捕獲探針T-196a-5p和T-125a-5p。根據(jù)拉曼特征峰的位置和信號強度檢測肺癌細胞中miR-196a-5p和miR-125a-5p

8、的種類和表達水平。3. 研究方案（1）海膽狀金納米粒子的制備和表征：采用種子介導生長法制備海膽狀金納米粒子，首先合成金種子，然后以金種子為生長核，利用還原劑對苯二酚和檸檬酸鈉還原氯金酸，以金種子作為生長位點，在金種子表面生長出多個枝角最終形成海膽狀金納米粒子。通過透射電子顯微鏡（TEM）、掃描電子顯微鏡（SEM）、紫外-可見-近紅外（UV-vis-NIR）分光光度計等表征海膽狀金納米粒子的形貌和光學性質。改變反應體系中反應物（包括金種用量、氯金酸與還原劑濃度配比）的比例和反應條件（包括pH、反應溫度、反應時間），調控海膽狀金納米粒子的LSPR峰的位置使SERS信號最優(yōu)化。制備形貌均一、單分散性

9、好和SERS效應強的海膽狀金納米粒子。（2）PDRGNPs復合微球的制備和表征：在不加模板和表面活性劑的條件下，通過凝膠-溶膠法制備PDR微球。在水和乙醇的反應溶液中，多巴胺生物分子和甲醛在氨水的催化作用下發(fā)生聚合反應，形成PDR微球。研究多巴胺生物分子的量對PDR微球形貌的影響。通過紅外光譜和電子能譜證實PDR微球上含有豐富的化學活性基團（如氨基、羥基、羧基和羰基等），為后續(xù)在PDR微球上修飾金屬納米顆粒、信號分子和堿基序列等打下基礎（前期工作基礎部分圖7E）。將PDR微球分散到含有氯金酸的溶液中攪拌一定的時間，帶正電荷的金離子通過靜電吸引作用被修飾到樹脂微球表面。在還原劑存在的條件下，金離

10、子被還原成金納米顆粒吸附在樹脂微球上。研究不同濃度的氯金酸對PDR微球上金納米顆粒形貌的影響。通過TEM、SEM和共聚焦拉曼光譜儀研究PDRGNPs復合微球的形貌和SERS活性。選取最適濃度的氯金酸，用于制備形貌好且SERS效應強的PDRGNPs復合微球。（3）基于UGNs-SH probe-miRNA-T probe-PDRGNPs“三明治”結構SERS傳感器檢測miR-196a-5p：在制備海膽狀金納米粒子和PDRGNPs復合微球的基礎上，首先在海膽狀金納米粒子表面修飾拉曼信號分子4-MBA后再在其表面固定檢測探針SH-probe，接著捕獲探針NH2-T-probe可以通過氨基與復合微球表

11、面羧基發(fā)生縮合反應而固定T-probe。利用miRNA與檢測探針、捕獲探針雜交形成“三明治”結構復合體，如圖1所示。將miR-196a-5p溶解在雙蒸水中，制成不同濃度的miR-196a-5p溶液。通過SERS檢測miR-196a-5p。當待測miR-196a-5p濃度越大，T-probe功能化的PDRGNPs復合微球捕獲的SERS探針的數(shù)目越多，從而可通過SERS信號的強弱來間接檢測miR-196a-5p的濃度。得到SERS傳感器的相應檢測指標，包括檢測靈敏度及線性范圍。圖1 “三明治”結構SERS傳感器的構建及其用于檢測miR-196a-5p的示意圖。（4）基于多線多重SERS-GICA核

12、酸試紙條檢測肺癌患者外周血、尿液和痰液中兩種miRNA：如圖2所示，以miR-196a-5p和miR-125a-5p為檢測對象，在NC膜上的不同位置分別固定質控線（C線）捕獲探針C probe，以及與兩種miRNA相對應的T線捕獲探針T-196a-5p和T-125a-5p，其中T線捕獲探針的一端可與對應的目標miRNA部分堿基互補配對。接著在海膽狀金納米粒子上標記4-MBA，并分別修飾了兩種不同的檢測探針SH-196a-5p和SH-125a-5p，形成金標復合物并將其滴涂在金標墊上，兩種檢測探針的一端也可與其相應的目標miRNA另一端進行堿基互補配對。具體步驟：合成目標miRNA和其它核酸探針

13、（表1）。利用點膜儀將T-196a-5p和T-125a-5p包被于NC膜的T線上，C線捕獲探針包被于NC膜的質控線上，干燥至完全，使其牢固的吸附在硝酸纖維素膜上。使用微量注射器將海膽狀金納米粒子標記的SH-196a-5p和SH-125a-5p滴加在金標墊上，干燥至完全。檢測時，將樣品溶液滴加到樣品墊上，當待測樣品中有目標miRNA存在時，隨著樣品在試紙條上遷移，miRNA先與金標墊上的金標復合物中檢測探針進行部分雜交，隨著樣品帶動金標復合物在NC膜上繼續(xù)遷移，待測樣品中的miRNA又會與相應的T probe部分雜交，形成“三明治”結構，從而將海膽狀金納米粒子捕獲并滯留在相應的檢測線位置。當待測

14、樣品中目標miRNA達到一定濃度時，被捕獲的海膽狀金納米粒子的量也就越多，顯線的顏色越強，即可觀察到紅色條帶。如果待測樣品中不含目標miRNA，則無法形成上述的“三明治”夾心結構，金納米粒子也就無法在檢測線上滯留聚集，因此無法在檢測區(qū)域觀察到紅色條帶。當樣品中含有miR-196a-5p和miR-125a-5p中的任意一種時，則會在對應的檢測線位置出現(xiàn)紅色條帶，即可觀察到C線和一條T線。觀察T線的出現(xiàn)位置，可以判斷目標miRNA的種類，但是無法辨別目標miRNA的濃度。因此，通過共聚焦拉曼儀檢測不同位置的T線，根據(jù)拉曼信號分子特征峰的強度測得樣品中miR-196a-5p和miR-125a-5p的

15、濃度。 在SERS-GICA核酸試紙條的制備過程中，需要對一些條件進行處理和優(yōu)化。（1）樣品墊和金標墊需要進行預處理，使其具有更好的表面活性和親水性，增強了樣品在其中的分散性，有利于釋放。（2）選取不同種類NC膜進行對比實驗。選擇孔徑合適、層析能力好的NC膜，使待測樣品在NC膜上更快速的流動。（3）SH probe的濃度和用量是實驗可行性的關鍵因素，選擇不同濃度的SH probe進行了對比和優(yōu)化。（4）通過miRNA單堿基錯配、兩個堿基錯配、隨機序列分別進行特異性測試，通過SERS及PCR分別檢測待測miRNA，驗證核酸試紙條的特異性和準確性，排除可能出現(xiàn)假陰性或者假陽性。圖2 多線雙重SER

16、S-GICA核酸試紙條的構建及其對肺癌患者外周血、尿液和痰液中miR-196a-5p和miR-125a-5p檢測的原理圖。收集適齡健康患者200例（來源：揚州大學附屬醫(yī)院），肺癌患者200例（來源：揚州大學臨床醫(yī)院胸外科），實驗分組：A組：健康組；B組：肺癌患者組。對患者情況，如年齡、體重、性別進行校對。將收集的外周血、尿液和痰液樣本滴到SERS-GICA核酸試紙條上。通過SERS對比各組體液樣本中兩種miRNA的表達水平差異。數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件包進行統(tǒng)計分析，miRNA-196a-5p和miRNA-125a-5p在肺癌不同時期的表達水平采用c2和t檢驗進行單因素分析，隨后采用log

17、istic回歸進行多因素分析。正常組和肺癌組之間miRNA-196a-5p和miRNA-125a-5p差異性分析采用t檢驗及c2檢驗。miRNA-196a-5p、miRNA-125a-5p與肺癌關系采用logistic回歸進行分析。通過繪制ROC曲線判斷miRNA-196a-5和miRNA-125a-5p診斷早期肺癌的臨界值及預測價值，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 基于單線多重SERS-GICA核酸試紙檢測肺癌細胞中兩種miRNA：上一部分根據(jù)不同位置T線處拉曼信號的強度，得到兩個miRNA的表達水平。為了能夠更加快速、高靈敏、定量的同時檢測miR-196a-5p和miR-125a-

18、5p，設計單線多重miRNA檢測技術。選擇兩種具有可區(qū)分特征峰的拉曼信號分子硫堇和NBA，標記到海膽狀金納米粒子的表面，同時在海膽狀金納米粒子上通過銀巰鍵分別修飾上SH-196a-5p和SH-125a-5p兩種檢測探針，形成兩種拉曼標記復合物后混合并滴涂在結合墊上。檢測探針的一段可與相應的目標miRNA的一部分進行堿基互補配對。在NC膜上設計一條質控線和一條檢測線，而檢測線上同時固定捕獲探針T-196a-5p和T-125a-5p，其中T probe的一端可與對應的目標物miRNA另一部分堿基互補配對。利用顯微共聚焦拉曼儀檢測T線位置拉曼信號分子的信號。由于目標物濃度不同，被捕獲的納米粒子的量不

19、同，所以產(chǎn)生的拉曼信號強度也有區(qū)別；且檢測探針SH-196a-5p 和SH-125a-5p所對應的拉曼信號分子不同，因此產(chǎn)生的拉曼特征峰不同，硫堇和NBA的特征峰分別位于592 cm-1和1420 cm-1處。根據(jù)不同信號分子拉曼特征峰的位置和拉曼信號強度可以得知待測樣品中miRNA的種類和濃度。通過SERS檢將肺癌細胞裂解并把裂解物滴加到試紙上，檢測肺癌細胞中miRNA的表達水平（圖3）。使用PCR驗證SERS-GICA技術的特異性和準確性。圖3基于單線雙重SERS-GICA核酸試紙條檢測肺癌細胞中miR-196a-5p和miR-125a-5p的表達水平的原理圖。表1 核酸探針序列名稱探針序

20、列miR-196a-5p5-UAGUAAGUUUCACUGUGAUUCGGG-3miR-125a-5p5-UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA-3C probe5-ACACGGTGTCTAGGGGG-3T-196a-5p5-TGAAACTTACTACCCCC-3T-125a-5p5-GGGTCTCAGGGACCCCC-3SH-196a-5p5-thiol-CCCCCTAGACACCGTGTCCCGAATCACAG-3SH-125a-5p5-thiol-CCCCCTAGACACCGTGTTCACAGGTTAAA-3創(chuàng)新要點（1）在不添加表面活性劑的條件下，優(yōu)化反應條件，采用種子介導生

21、長法制備既空間不對稱又具有尖銳邊緣或枝角的海膽狀新型金納米結構。發(fā)展一種簡單、快速、產(chǎn)率高制備海膽狀金納米粒子的方法。（2）發(fā)展一種快速、靈敏、高效、低廉的檢測miRNA的新方法?；诤Ｄ憼罱鸺{米粒子構建多線多重和單線多重SERS-GICA核酸試紙條，用于miRNA-196a-5p、miRNA-125a-5p的檢測。在病例樣本中目標miRNA較低的情況下，充分發(fā)揮SERS技術和GICA技術各自的優(yōu)勢，能夠將miRNA的最低檢測限顯著性提高，并快速和定量測得樣本中miRNA的表達水平，這對實現(xiàn)miRNA的臨床檢測具有重要意義。（3）既往對肺癌的研究多數(shù)集中于對CEA、NSE、CK-19等蛋白質類

22、相關指標的檢測，以miRNA作為腫瘤標志物更具靈敏性和特異性。直接以外周血、尿液和痰液作為生物檢測樣本，具有取材方便、操作步驟簡單、無創(chuàng)傷性和可連續(xù)體外檢測等優(yōu)點。（4）我們從技術上率先使用SERS-GICA技術檢測外周血、尿液和痰液中miRNA-196a-5p、miRNA-125a-5p的表達水平，試圖揭示這兩種miRNA在推動肺癌病程進展中的作用及功能，對肺癌早期診斷、預后、病情監(jiān)測和治療具有重要意義。技術指標（1）使用qRT-PCR法對A549細胞和BEAS-2B細胞中miRNA-196a-5p表達水平檢測，結果顯示，A549細胞中的miRNA-196a-5p表達水平明顯高于BEAS-2

23、B細胞（圖4A）。使用qRT-PCR法對新鮮肺癌組織及癌旁組織中miRNA-196a-5p和miRNA-125a-5p表達水平檢測，結果顯示，肺癌組織中的miRNA-196a-5p表達水平明顯高于癌旁組織（圖4B），而肺癌組織中的miRNA-125a-5p表達水平明顯低于癌旁組織（圖4C）。圖4（A）A549細胞和BEAS-2B細胞中miRNA-196a-5p表達水平。肺癌組織及癌旁組織中（B）miRNA-196a-5p、（C）miRNA-125a-5p表達水平。（2）通過SEM 和TEM表征了海膽狀金納米粒子的形貌和結構，如圖5A和圖5B所示。海膽狀金納米粒子的形貌均一、單分散性好。每個海膽

24、狀金納米粒子粒徑約70 nm，由一個50 nm的中心核及6-10個10 nm的納米枝角構成。海膽狀金納米粒子表面的納米枝角使得單個納米粒子上同時具有多個“熱點”，這將顯著增強其SERS效應。圖5C是海膽狀金納米粒子的高分辨透射電鏡（HRTEM），納米粒子表面的納米枝角具有一致的晶格取向，因而為單晶結構。清晰的晶格條紋表明產(chǎn)物具有良好的結晶性和純度，其中晶格間距d=0.24 nm對應Au的(111)晶面。選區(qū)電子衍射（SAED）圖譜中明亮的衍射點也表明產(chǎn)物為單晶，衍射斑點的d值為0.275 nm，0.24 nm，0.144 nm和0.123 nm，分別對應于Au的(311)、(111)、(022)和(123)面的晶面（圖5D）。圖5E顯示海膽狀金納米粒子溶液的顏色藍綠色，LSPR吸收峰位于650 nm處。圖5F是海膽狀金納米粒子作為增強基底測得的10-7 M 4-MBA的SERS光譜。計算得到的海膽狀金納米粒子的拉曼增強因子（EF）為7.5×105，遠高