分子發(fā)光分析法

1、第7章分子發(fā)光分析法 7.1 內(nèi)容提要 基本概念分子發(fā)光分析法分子吸收一定的能量躍遷到較高的電子激發(fā)態(tài)后，在返回基態(tài)的過程中伴隨有光輻射，這種現(xiàn)象稱為分子發(fā)光，以此建立起來的分析方法稱為分子發(fā)光分析法。光致發(fā)光物質(zhì)吸收光能而激發(fā)發(fā)光的現(xiàn)象，稱為光致發(fā)光。電致發(fā)光物質(zhì)吸收電能而激發(fā)發(fā)光的現(xiàn)象，稱為電致發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光物質(zhì)若吸收化學(xué)反應(yīng)能激發(fā)發(fā)光，稱為化學(xué)發(fā)光。生物發(fā)光發(fā)生在生物體內(nèi)有酶類物質(zhì)參與的化學(xué)發(fā)光稱為生物發(fā)光。單重態(tài)一個(gè)所有電子自旋都配對的分子的電子態(tài)稱為單重態(tài)，用“S”表示。三重態(tài)在激發(fā)態(tài)分子中，兩個(gè)價(jià)電子自旋平行的電子態(tài)稱為三重態(tài)，用“T”表示。 圖7-1   &#

2、160; 單重態(tài)系三重態(tài)激發(fā)示意圖無輻射躍遷當(dāng)激發(fā)態(tài)分子返回基態(tài)時(shí)，如果不伴隨發(fā)光現(xiàn)象，則此過程稱為無輻射去激或無輻射躍遷。它包括：振動(dòng)馳豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換和系間竄躍。振動(dòng)馳豫同一電子能級(jí)內(nèi)，激發(fā)態(tài)分子以熱能交換形式將多余的能量傳遞給周圍的分子，并由高能級(jí)回到低能級(jí)的躍遷，稱為振動(dòng)馳豫。內(nèi)轉(zhuǎn)換同一多重態(tài)的不同電子能級(jí)間發(fā)生的無輻射躍遷稱為內(nèi)轉(zhuǎn)換（或內(nèi)轉(zhuǎn)移）。系間竄躍不同多重態(tài)之間的無輻射躍遷稱為系間竄躍。分子熒光分子從S1態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷至S0態(tài)各振動(dòng)能級(jí)時(shí)所產(chǎn)生的輻射光稱為分子熒光。 圖7-2分子熒光、磷光光譜產(chǎn)生過程示意圖斯托克斯位移分子發(fā)射熒光的波長總比激發(fā)光長，能量比激發(fā)光小，這

3、種現(xiàn)象稱為斯托克斯位移。分子磷光當(dāng)受激分子降至S1的最低振動(dòng)能級(jí)后，如果經(jīng)系間竄躍至T1態(tài)，并經(jīng)T1態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回到S0態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)，此過程輻射的光稱為分子磷光。延遲熒光某些物質(zhì)的分子躍遷至T1態(tài)后，因相互碰撞或通過激活作用又回到S1態(tài)，經(jīng)振動(dòng)馳豫(VR)到達(dá)S1態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再發(fā)射熒光，這種熒光稱為延遲熒光，也叫慢速熒光。熒光激發(fā)光譜固定發(fā)射光（第二單色器）波長，改變第一單色器（激發(fā)光）波長，獲得以激發(fā)光波長為橫坐標(biāo)，熒光發(fā)射光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)的譜圖，即為熒光激發(fā)光譜。熒光發(fā)射光譜固定激發(fā)光（第一單色器）波長，使激發(fā)光波長和強(qiáng)度保持不變，然后改變第二單色器（熒光發(fā)射）波長，從200700

4、nm進(jìn)行掃描，獲得以發(fā)射光波長為橫坐標(biāo)，發(fā)射光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)的譜圖，即為熒光發(fā)射光譜。熒光猝滅熒光分子與容劑或其他物質(zhì)作用使熒光強(qiáng)度減弱的現(xiàn)象稱為熒光猝滅，能使熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為熒光猝滅劑。瑞利散射光、拉曼散射光溶劑分子吸收能量較低的光線后，不足以使分子中的電子躍遷到較高的電子激發(fā)態(tài)，而只是上升到基態(tài)中較高的振動(dòng)能級(jí)，如果在極短的時(shí)間內(nèi)（10-1510-12s）返回到原來的振動(dòng)能級(jí)，發(fā)出與激發(fā)光波長完全相同的光稱為瑞利散射光(Rayleigh scattering)。如果返回到稍高或稍低于原來的振動(dòng)能級(jí)，則產(chǎn)生分布在瑞利線兩邊的稍長（紅伴線）或稍短（藍(lán)伴線）的拉曼散射光。電生化學(xué)發(fā)光靠電極過

5、程誘發(fā)溶液的化學(xué)發(fā)光稱為電生化學(xué)發(fā)光（ECL）。重原子效應(yīng)熒光分子的芳環(huán)上被F，Cl，Br，I取代后，使系間竄躍加強(qiáng)，其熒光強(qiáng)度隨鹵素相對原子質(zhì)量的增加而減弱，磷光相應(yīng)增強(qiáng)，這種效應(yīng)稱為重原子效應(yīng)。 基本內(nèi)容1. 分子熒光激發(fā)光譜的特征熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜反映了激發(fā)光波長與熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系，為熒光分析選擇最佳激發(fā)光提供依據(jù)。激發(fā)光譜具有以下特征：（1）第二單色器不論怎樣改變固定波長，同一熒光物質(zhì)激發(fā)光譜的性質(zhì)在其他條件一定時(shí)并不改變，變化的只是曲線高低，即測定的靈敏度發(fā)生變化。（2）同一物質(zhì)的最大激發(fā)波長與最大吸收波長一致，這是因?yàn)槲镔|(zhì)吸收具有特定能量的光而激發(fā)，吸收強(qiáng)度高的波長正是激發(fā)作用強(qiáng)

6、的波長。2. 分子熒光光譜的特性熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)，由于分子無論被激發(fā)到高于S1的哪一個(gè)激發(fā)態(tài)，都經(jīng)過無輻射的振動(dòng)馳豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換等過程，最終回到S1態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，然后產(chǎn)生分子熒光。因此，熒光光譜與熒光物質(zhì)被激發(fā)到哪一個(gè)電子能級(jí)無關(guān)。3. 熒光量子產(chǎn)率ff熒光量子產(chǎn)率ff反映了熒光物質(zhì)發(fā)射熒光的能力，其值越大物質(zhì)的熒光越強(qiáng)。 ff =發(fā)射的光子數(shù)/吸收的光子數(shù)熒光物質(zhì)的ff通常大于0小于1。4. 熒光強(qiáng)度的主要影響因素（1）熒光強(qiáng)度與濃度 熒光物質(zhì)濃度很稀時(shí)，所發(fā)射的熒光相對強(qiáng)度If可用下式表示： 當(dāng)測定體系和測定條件確定之后，以及摩爾吸收系數(shù)k和液層厚度L均為常數(shù)，設(shè)，則 熒光分析

7、是微量組分或痕量組分分析法，當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度增至吸光度A(A=kcL)0.05時(shí)將產(chǎn)生顯著的濃度效應(yīng)，使熒光強(qiáng)度If與濃度c的關(guān)系偏離線性。（2）熒光與分子結(jié)構(gòu) 通常，強(qiáng)熒光分子都有大的共軛p鍵結(jié)構(gòu)、給電子取代基和剛性平面結(jié)構(gòu)等，而飽和的化合物及只有孤立雙鍵的化合物，不呈現(xiàn)顯著的熒光。（3）熒光猝滅 熒光猝滅分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅。靜態(tài)猝滅的特征是基態(tài)熒光分子M和猝滅劑Q發(fā)生反應(yīng)，生成非熒光性物質(zhì)MQ，使M失去熒光特性： M + Q MQ動(dòng)態(tài)猝滅的特征是激發(fā)態(tài)M*和Q碰撞，發(fā)生能量或電子轉(zhuǎn)移從而失去熒光性，或生成瞬時(shí)激發(fā)態(tài)復(fù)合物MQ*，使熒光分子M的熒光猝滅。與靜態(tài)猝滅不同，動(dòng)態(tài)猝滅通常并不改

8、變M的吸收光譜。 lexMM* + Q MQ* MQ(無輻射躍遷) 或 MQ + lem(熒光)（4）溫度、酸度和溶劑的影響 溫度降低，和If均增大。熒光物質(zhì)如果是弱酸或弱堿，pH的改變會(huì)影響其形體分布和熒光強(qiáng)度，因此，可以用控制酸度的辦法提高熒光分析的靈敏度和選擇性。溶劑的改變會(huì)使熒光物質(zhì)的發(fā)生變化，或?qū)е缕渌狈磻?yīng)的發(fā)生，既是有利因素也是不利因素。（5）表面活性劑的影響 在水溶液中，當(dāng)單體表面活性劑濃度增大到臨界膠束濃度（CMC）時(shí)，便會(huì)締合為球狀膠束，它的存在使熒光分子處在膠束溶液更有序的微環(huán)境中，對熒光質(zhì)點(diǎn)起到了保護(hù)作用，降低了熒光猝滅和非輻射去激，使明顯增大。膠束增敏作用具有較強(qiáng)的選

9、擇性。5. 熒光分析儀器熒光分析儀器通常由光源、單色器、樣品池、狹縫、光電倍增管（PMT）等部件組成。常用的光源是高壓汞燈和氙弧燈。大多數(shù)熒光分光光度計(jì)采用光柵作為單色器，它具有較高的靈敏度、較寬的波長范圍，能掃描光譜。樣品池通常是石英方形池，四面都透光。圖7-3 熒光分析基本裝置方框圖熒光分光光度計(jì)多采用光電倍增管（PMT）為檢測器。讀出裝置包括記錄儀、陰極示波器和顯示器等。熒光物質(zhì)的量子產(chǎn)率和摩爾吸收系數(shù)k的乘積表示的靈敏度稱為儀器的絕對靈敏度，用b表示。 b = kb值越大，方法的靈敏度越高。目前，儀器的靈敏度趨向于用純水的拉曼峰信噪比（S/N）表示。6. 化學(xué)發(fā)光分析法的基本理論一個(gè)反

10、應(yīng)要成為化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，必須滿足如下基本要求：（1）化學(xué)反應(yīng)必須提供足夠的化學(xué)能，且被發(fā)光物質(zhì)吸收形成電子激發(fā)態(tài)。（2）吸收化學(xué)能處于電子激發(fā)態(tài)的分子返回到基態(tài)時(shí)，能以光的形式釋放出能量，或把能量轉(zhuǎn)移到一個(gè)合適的接受體上，該接受體能以光的形式釋放能量，產(chǎn)生敏化化學(xué)發(fā)光，用于分析上的液相化學(xué)發(fā)光體系很多，但研究和應(yīng)用的比較廣泛的有魯米諾(Luminol)、光澤精(lucigenin)和過氧草酰類(peroxyoxalate)。7. 影響化學(xué)發(fā)光的主要因素主要影響因素有溶液的酸度、試液的注入速率和干擾物質(zhì)。酸度影響待測物質(zhì)和發(fā)光體的存在形態(tài)，或發(fā)生其他副反應(yīng)，對發(fā)光體系產(chǎn)生嚴(yán)重影響。每個(gè)發(fā)光體系的最

11、佳控制酸度應(yīng)該通過實(shí)驗(yàn)確定，并嚴(yán)加控制。試液的注入速率越大，發(fā)光強(qiáng)度變化也越大。微量干擾物質(zhì)存在就會(huì)引起污染，導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光測定失敗。8. 生物發(fā)光分析的特點(diǎn)生物發(fā)光分析將酶反應(yīng)的專一性和化學(xué)發(fā)光的高靈敏性巧妙結(jié)合，在溫和的自然條件下能以較高量子產(chǎn)率產(chǎn)生連續(xù)的冷光輻射，具有靈敏度高、選擇性好的顯著特點(diǎn)。9. 分子發(fā)光分析法的應(yīng)用（1）無機(jī)化合物的熒光分析 目前，利用各種有機(jī)試劑和各種熒光分析技術(shù)可對Ca2+、Mg2+、K+、Na+、Zn2+、Cd2+、Pb2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、F-、Cl-、Br-、I-等近70種元素進(jìn)行靈敏的測定，也可以分析氮化物、氰化物、硫化物以及氧、臭氧及過氧

12、化物等。（2）有機(jī)化合物的熒光分析 目前，在生物活性物質(zhì)的測定方面，熒光分析顯示了它廣闊的應(yīng)用前景。如可以測定某些醇、肼、醛、酮、酯、脂肪酸、酰氯、糖類、多環(huán)芳烴、酚、醌、葉綠素、維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸、尿素、肽、有機(jī)胺類、甾類、酶和輔酶等數(shù)百種有機(jī)化合物，尤其以核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA）的熒光分析顯得極其重要，因?yàn)樗鼈兤鹬鎯?chǔ)、復(fù)制和傳遞遺傳信息的作用，決定著細(xì)胞的種類及其功能。在藥物、毒物分析方面，熒光法可以測定青霉素、四環(huán)素、金霉素、土霉素等抗菌素在飼料、蛋、奶、肉等樣品中的殘留，也可以測定糧食、油料等食物中的黃曲霉、棒曲霉素、赭曲霉等毒素。有機(jī)磷類農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥

13、，在一定條件下也可以用熒光法進(jìn)行測定。10. 化學(xué)發(fā)光分析法的特點(diǎn)及應(yīng)用化學(xué)發(fā)光分析法具有靈敏度高、線性范圍寬、設(shè)備簡單、分析速度快且易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等顯著優(yōu)點(diǎn)。已廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)、食品科學(xué)、藥物檢驗(yàn)、微生物學(xué)、臨床和免疫分析、環(huán)境檢測、農(nóng)林科研等領(lǐng)域，可以測定甲醛、甲酸、H2O2、葡萄糖、氨基酸、多環(huán)芳胺類化合物、丙酮、羥胺、果糖、維生素C、谷胱甘肽、尿素、肌酸酐、多種酶和Fe2+、Fe3+、Cr3+、Mn2+、Ag+、Pb2+、Bi3+、Zn2+、Mo6+、V5+金屬離子等大量物質(zhì)。7.2 習(xí)題解答1. 處于單重態(tài)和三重態(tài)的分子其性質(zhì)有何不同？ 為什么會(huì)發(fā)生系間竄躍？ 答：對同一物質(zhì)，所處的

14、多重態(tài)不同其性質(zhì)明顯不同。第一，S臺(tái)分子在磁場中不會(huì)發(fā)生能級(jí)分裂，具有抗磁性，而T態(tài)有順磁性；第二，電子在不同多重態(tài)間躍遷時(shí)需換向，不易發(fā)生。因此，S與T態(tài)間的躍遷概率總比單重態(tài)與單重態(tài)間的躍遷概率小；第三，單重激發(fā)態(tài)電子相斥比對應(yīng)的三重激發(fā)態(tài)強(qiáng)，所以，各狀態(tài)能量高低為：S2T2S1T1S0，T1是亞穩(wěn)態(tài)；第四，受激S態(tài)的平均壽命大約為10-8s，T2態(tài)的壽命也很短，而亞穩(wěn)的T1態(tài)的平均壽命在10-410s；第五，S0T1形式的躍遷是“禁阻”的，不易發(fā)生，但某些分子的S1態(tài)和T1態(tài)間可以互相轉(zhuǎn)換，且T1S0形式的躍遷有可能導(dǎo)致磷光光譜的產(chǎn)生。系間竄躍易于在T1和S0間進(jìn)行，發(fā)生系間竄躍的根本原

15、因在于各電子能級(jí)中振動(dòng)能級(jí)非?？拷?，勢能面發(fā)生重疊交叉，而交叉地方的位能是一樣的。當(dāng)分子處于這一位置時(shí)，既可發(fā)生內(nèi)部轉(zhuǎn)換，也可發(fā)生系間竄躍，這決定于分子的本性和所處的外部環(huán)境條件。2. 熒光分析儀器的檢測器為什么不放在光源與液池的直線上？其第一、第二單色器各有何作用？答：這個(gè)方向可減少透射光的干擾和影響。第一單色器是為了從光源中獲得激發(fā)單色光；第二單色器是濾掉其他雜散光，而只讓發(fā)射出的熒光照射到檢測器上。3. 熒光光譜的形狀決定于什么因素？為什么與激發(fā)光的波長無關(guān)？答：熒光光譜形狀取決于熒光物質(zhì)的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，而與激發(fā)光的波長無關(guān)。這是由于分子無論被激發(fā)到高于S1的哪一個(gè)電子激發(fā)態(tài)，都經(jīng)過無輻射

16、的振動(dòng)馳豫和內(nèi)轉(zhuǎn)移等過程，最終回到S1態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，然后產(chǎn)生分子熒光。因此，熒光光譜與熒光物質(zhì)被激發(fā)到哪一個(gè)電子能級(jí)無關(guān)。4. 根據(jù)取代基對熒光性質(zhì)的影響，請解釋下列問題：苯胺和苯酚的熒光量子產(chǎn)率比苯高50倍；硝基苯、苯甲酸和碘苯是非熒光物質(zhì)；氟苯、氯苯、溴苯和碘苯的分別為0.10，0.05，0.01和0.00。答：（1）OH,NH2是加強(qiáng)熒光的給電子取代基，所以，苯胺和苯酚的熒光量子產(chǎn)率比苯高得多。（2）得電子取代基通常使熒光減弱，使磷光加強(qiáng)，如：COOH, NO2等，它們n電子的電子云并不與芳環(huán)上p電子云共平面。另外，芳環(huán)上取代上碘之后，使系間竄躍加強(qiáng)，其熒光強(qiáng)度減弱，所以，硝基苯、苯

17、甲酸和碘苯是非熒光物質(zhì)。（3）芳環(huán)上取代上F、Cl、Br、I之后，使系間竄躍加強(qiáng)，其熒光強(qiáng)度隨鹵素相對原子質(zhì)量的增加而減弱，磷光相應(yīng)加強(qiáng)，這種效應(yīng)稱為重原子效應(yīng)。所以，氟苯、氯苯、溴苯和碘苯的分別為0.10，0.05，0.01和0.00。5. 如何掃描熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光光譜？答：固定第二單色器的波長，使測定的熒光波長保持不變，然后改變第一單色器的波長由200700nm掃描。以測出的相對熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的激發(fā)光波長為橫坐標(biāo)作圖，所繪出的曲線就是該熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。固定第一單色器的波長,使激發(fā)光波長和強(qiáng)度保持不變，然后改變第二單色器波長,從200700nm進(jìn)行掃描，所獲得的光譜就是

18、熒光光譜。6. 寫出熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度間的關(guān)系式，應(yīng)用前提是什么？答：熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度之間的關(guān)系式為該式的應(yīng)用前提是熒光物質(zhì)溶液的吸光度A0.05。7. 一個(gè)化學(xué)反應(yīng)要成為化學(xué)發(fā)光反應(yīng)必須滿足哪些基本要求？答：一個(gè)反應(yīng)要成為化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，必須滿足如下基本要求：（1）化學(xué)反應(yīng)必須提供足夠的化學(xué)能，如果在280760nm的可見-紫外光區(qū)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，則要求化學(xué)反應(yīng)提供160420kJ·mol-1的能量，具有過氧化物中間產(chǎn)物的氧化還原反應(yīng)一般能滿足這種要求。（2）吸收化學(xué)能處于電子激發(fā)態(tài)的分子返回到基態(tài)時(shí)，能以光的形式釋放出能量。8. NADH的還原型是一種重要的強(qiáng)熒光性物質(zhì)，其最大激發(fā)波長為340nm，最大發(fā)射波長為465 nm，在一定條件下測得NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對熒光強(qiáng)度如下表所示。根據(jù)所測數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出相對熒光強(qiáng)度為42.3的未知液中NADH的濃度。解：以表中相對熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，以NADH的濃度為橫坐標(biāo)作圖，所繪制的