電化學(xué)傳感器完

1、酪氨酸酶的提取催化活性及生物電化學(xué)傳感器的構(gòu)建與應(yīng)用顧新 0909401008蘇州大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)部 09級化學(xué)類摘要：通過測定在不同濃度酪氨酸酶的作用下多巴紅的生成速率測定酶的活性。用加入Na2EDTA觀察抑制劑對酶活性的影響。酶電極的制作以及對酚的測定。結(jié)果表明：加入抑制劑后酶的催化活性降低。在鄰苯二酚加入的瞬間有明顯的峰電流產(chǎn)生，說明酪氨酸酶促進(jìn)酚的氧化。關(guān)鍵詞：酪氨酸酶 多巴紅酶電極電化學(xué)傳感器Abstract: Measuring the enzymatic activity through measuring the produce rate under different d

2、ensity of tyrosinase .Adding the Na2EDTA to the liquor and observing the effect. Making the enzymatic electrode pole and measuring the effect to the phenol. The results showed that tyrosinase promote the oxidation of phenol.Key words: tyrosinase dopamine red enzyme electrode electrochemical sensor1、

3、前言生物體內(nèi)由于生物催化劑酶的存在許多復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)可以在溫和條件下進(jìn)行得十分順利和迅速，且酶催化反應(yīng)具有高效性，選擇性，反應(yīng)條件溫和等特性。生物傳感器是利用生物物質(zhì)作為識別元件，將被測物質(zhì)的濃度與可測量的電信號關(guān)聯(lián)起來，其中研究最多的是酶傳感器。生物電化學(xué)傳感器的構(gòu)建主要包括酶，碳納米管的應(yīng)用。生物傳感器具有不需樣品處理操作簡便，體積小可實現(xiàn)連續(xù)在線監(jiān)測等特點。本實驗通過土豆提取酪氨酸酶，并測定其活性，并將酶進(jìn)一步固定于電極表面，制成酶電極，可用于酚的測定。2、實驗部分2.1儀器和藥品 儀器：分光光度計；離心機(jī)；粉碎機(jī)；超聲波清洗器；鉑電極；飽和甘汞電極；玻碳電極 藥品：L-多巴；磷酸氫二鈉；

4、氫氧化鈉；鹽酸；Na2EDTA；鹽酸；多壁碳納米管；酚 材料：土豆2.2實驗步驟2.2.1 酶的提取 12.5g經(jīng)過冰凍切碎的土豆，加入冰冷的25mL磷酸緩沖溶液（pH=7.0）,用粉碎機(jī)粉碎均勻。倒出提取液，立即離心分離。傾出上層清夜保存于冰箱。提取液為棕色，在放置過程中不斷變黑。2.2.2酶的活性測量 取0.4mL土豆提取液，加2.6mL pH=7.0的緩沖液。加2mL0.010mol/L的多巴溶液，搖勻。反應(yīng)約10min后，使用比色皿中，加入m的比色皿，使用自動掃描分光光度計掃描獲取多巴紅得吸收光譜。并可從混合開始以時間間隔1min進(jìn)行連續(xù)掃描，觀察吸光度隨時間增加的現(xiàn)象。 取2.5mL

5、提取液用pH=7.0的緩沖溶液稀釋至10mL,搖勻。取0.1mL稀釋過的提取液于2.9mL pH=6.0的緩沖液，再加2mL多巴溶液，同時開始計時，用分光光度計在475nm處測定吸光度。開始6min內(nèi)每分鐘讀1個數(shù)，以后隔2min讀1個數(shù)，直至吸光度變化不大為止。 取0.2mL、0.3mL、0.4mL已稀釋過的提取液重復(fù)上述實驗，（注意總體積為5mL，每次換溶液洗比色皿只能倒很少量溶液洗1次）。 以吸光度對時間作圖，從直線斜率求出酶的活性。2.2.3抑制劑的影響 取0.4mL稀釋過的提取液，加入少量固體Na2EDTA振動混合，反應(yīng)一段時間后，配成測定溶液觀察現(xiàn)象。并按上述實驗方法，測定酶的活性

6、，并對實驗結(jié)果進(jìn)行對比。1.2.4酶電極以及樣品中酚的測定 將酶電極置于0.05mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）中，電磁攪拌溶液，在極化電位-0.1V下記錄電流-時間曲線，待基本電流穩(wěn)定后，多次加入一定量的酚溶液，并觀察所得曲線。2.2.4酶電極的制備將玻碳電極用3000目的進(jìn)口細(xì)砂紙濕磨拋光，然后依次用稀HCl，無水乙醇，去離子水清洗各3min，干燥后備用。取6L碳納米管懸濁液滴加于預(yù)處理后的玻碳電極表面，紅外燈烘干，再取一定量的酪氨酸酶溶液滴在電極表面，室溫下放置干燥3h即可。酶電極不使用時可存放于冰箱中。2.2.5樣品中酚的測定將酶電極置于0.05mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（p

7、H=7.0）中，電磁攪拌溶液，在極化電位-0.1V下記錄電流-時間（i-t）曲線，待基本電流穩(wěn)定后，多次加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)酚溶液，以電流增量對酚的濃度作工作曲線。3.結(jié)果和討論3.1吸光度隨時間的變化表1 不同時間吸光度的變化時間吸光度12345678910110.6110.65907100.7330.7430.7520.7470.7330.7330.733圖1吸光度隨時間的變化由圖可得，吸光度隨時間變化先變大后變小然后趨于平臺。先變大是因為反應(yīng)逐漸進(jìn)行多巴紅濃度逐漸變大，最大后反應(yīng)完全，然后逆反應(yīng)，到達(dá)平臺時反應(yīng)平衡。3.2最大吸收波長的測定表2 不同波長處的吸光度波長/nm吸光度A40041

8、04204304404504554604654704754804854905005105205305405505605705805906000.7340.7340.7460.7550.7530.7620.7650.7660.7680.7790.7910.7860.7840.7760.7670.7530.7220.6920.6560.6290.5830.5720.5610.5790.565圖2不同波長下多巴紅的吸光度由圖2可以得出多巴紅在475nm波長處有最大吸收。3.3酪氨酸酶的活性測量加入不同濃度酪氨酸酶時溶液吸光度隨時間的變化情況的記錄，并以吸光度對時間作圖，從直線斜率求出酶的活性。表3

9、不同濃度酪氨酸酶時溶液吸光度隨時間的變化時間t/min加入0.1mL釋后提取液加入0.2mL釋后提取液加入0.3mL釋后提取液加入0.4mL釋后提取液0.4mL釋后提取液加抑制劑10.0260.0570.0830.1100.10920.0380.0610.0890.1160.12330.0470.0720.1030.1350.13640.0520.0760.1140.1510.14750.0540.0790.1200.1630.15160.05600820.1240.1700.15680.0590.0830.1270.1760.158100.0600.0830.1290.1800.160120

10、.0610.0830.1290.1810.161140.06200830.1290.1820.162160.0620.183180.062圖3加入0.1ml酪氨酸酶時溶液吸光度隨時間的變化由圖可知加入0.1mL稀釋后的提取液時，產(chǎn)物的生成速率v1=0.002圖4加入0.2ml酪氨酸酶時溶液吸光度隨時間的變化由圖可知加入0.2mL稀釋后的提取液時，產(chǎn)物的生成速率v2=0.008圖5加入0.3ml酪氨酸酶時溶液吸光度隨時間的變化由圖可知加入0.3mL稀釋后的提取液時，產(chǎn)物的生成速率v3=0.01圖6加入0.4ml酪氨酸酶時溶液吸光度隨時間的變化由圖可知加入0.4mL稀釋后的提取液時，產(chǎn)物的生成速率

11、v4=0.013圖7加入0.4ml酪氨酸酶和抑制劑時溶液吸光度隨時間的變化根據(jù)米氏方程 ,以1/vi對1/S作圖，由直線斜率和截距可求得km值。由圖可知加入0.4mL稀釋后的提取液以及抑制劑時，產(chǎn)物的生成速率v1=0.014，說明加入抑制劑后反應(yīng)速率明顯降低，抑制劑降低了酶的活性。3.4反應(yīng)速率與酶濃度的關(guān)系表4 反應(yīng)速率與酶濃度的關(guān)系v1/vS1/S0.0040.0080.0100.013250125100770.10.20.30.41053.32.5對1/vi對1/S作圖得圖7反應(yīng)速率與酶濃度的關(guān)系直線方程為1/vi=km/(vmaxS)+1/vmax，即1/vmax=19.08，vmax=0.0524, km/vmax=22.87，所以km=1.20mol·L-1.3.5酚對酪氨酸酶的影響圖8酚對酪氨酸酶的影響4.參考文獻(xiàn)(1).卞國慶，紀(jì)順俊.綜合化學(xué)實驗M.蘇州：蘇州大學(xué)出版社，2007(2).王尊本主編.綜合化學(xué)實驗M.北京：科學(xué)出版社，2003:161 166.(3).浙江大學(xué)，南京大學(xué)，北京大學(xué)，蘭州大學(xué)主編. 綜合化學(xué)實驗M.北京：高等教育出版社，2001：p183 187.(4).古練權(quán)主編.生物化學(xué)M.