實(shí)驗(yàn)一質(zhì)粒提取

1、 使蛋白質(zhì)或脂類等菌體成分變性 基因組DNA產(chǎn)生缺刻，變成線狀，并解離成單鏈（變性） 由于質(zhì)粒DNA較小，仍為環(huán)狀變性區(qū)雖大，但不分離 中和或恢復(fù)至室溫中和或恢復(fù)至室溫 變性的質(zhì)粒DNA按原互補(bǔ)配對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)性 基因組DNA隨機(jī)復(fù)性，與蛋白質(zhì)等菌體成分結(jié)合在一起離心分離離心分離 質(zhì)粒DNA存在于上清中，回收 苯酚/氯仿/異戊醇抽提，乙醇沉淀純化純化1、取1.0ml培養(yǎng)液倒入1.5ml EP管中,4下6000g離心2min。 2、棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥。 3、菌體沉淀重懸浮于200l溶液中(需劇烈振蕩,充分搖勻)。 4、加入新配制的400l溶液(新鮮配置：

2、 0.4M NaOH和2%SDS 儲(chǔ)液各取等體積混勻后加入), 蓋緊管口，溫和顛倒離心管數(shù)次,以混勻內(nèi)容物(千萬(wàn)不要振蕩),冰浴3分鐘。 5、加入300l預(yù)冷的溶液,蓋緊管口，溫和顛倒離心管振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4下12000g離心5-10分鐘。 四、操作步驟四、操作步驟 q對(duì)數(shù)期菌體對(duì)數(shù)期菌體溶液溶液IIIIII中和中和溶液溶液I I充分重懸充分重懸溶液溶液IIII裂解裂解上清液上清液抽提抽提離心洗滌離心洗滌酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀質(zhì)粒質(zhì)粒DNA溶液溶液 使用處于對(duì)數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加） 培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟

3、失 盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量 菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失） 菌體量適當(dāng)。 培養(yǎng)基去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分懸浮。 變性的時(shí)間不要過長(zhǎng)（5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷。 復(fù)性時(shí)間也不宜過長(zhǎng)，否則會(huì)有基因組DNA的污染。 對(duì)于細(xì)胞壁較厚的菌（如酵母菌）質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁。 采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔 離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間 針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法 當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分 沉淀時(shí)加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 沉淀后應(yīng)用70的乙醇洗滌，以除去鹽離子等 晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥） 若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解 （TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase；pH值為8.0，可防止DN