冷凍電鏡技術(shù)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上冷凍電鏡技術(shù)課程學(xué)習(xí)報(bào)告一、課程所講基礎(chǔ)知識(shí)回顧1、電子顯微鏡成像技術(shù)的發(fā)展歷史（1）上世紀(jì)50年代的負(fù)染技術(shù)（分辨率2mm）：該技術(shù)的原理為重金屬燃料與H結(jié)合，特點(diǎn)為對(duì)電子散射強(qiáng)，視野暗，襯度大，易觀察到生物材料。但不足之處在于染料顆粒較大，不易進(jìn)入分子內(nèi)部。此外，因樣品需要脫水處理，會(huì)造成結(jié)構(gòu)失真。（2）上世紀(jì)60年代的三維重構(gòu)技術(shù) 三維重構(gòu)的數(shù)學(xué)原理為傅里葉變換，其關(guān)鍵性質(zhì)為：三維函數(shù)投影的傅里葉變換等于該三維函數(shù)傅里葉變換在垂直于投影方向上的中央截面。因此，通過對(duì)待測(cè)立體物質(zhì)的多角度投影信息采集，可以借助數(shù)學(xué)的橋梁，重構(gòu)出該物質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。顯然，對(duì)待測(cè)物質(zhì)投影

2、采集的角度越多，越精確，重構(gòu)出的三維圖像越接近真實(shí)。 在60年代，T4噬菌體的結(jié)構(gòu)通過該方法被成功解析。（3）上世紀(jì)70年代的電子晶體學(xué) 即根據(jù)電子衍射的花樣確定物質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)。被觀測(cè)的物體通過物鏡形成衍射圖樣，而這些衍射光束的低散射角部分再通過透鏡而形成顯微像。該方法相當(dāng)于對(duì)原物體進(jìn)行兩次傅里葉變換，一為將物體轉(zhuǎn)換成衍射譜，二為逆傅里葉變換使衍射譜重構(gòu)成顯微圖像。 在70年代，電子晶體學(xué)的發(fā)展使得第1個(gè)膜蛋白結(jié)構(gòu)被成功解析。（4）上世紀(jì)80年代的快速冷凍技術(shù)（分辨率達(dá)到0.2nm） 主要原理為將樣品快速冷凍在玻璃態(tài)的水中，樣品不需脫水，結(jié)構(gòu)與在溶液中相同，呈天然狀態(tài)。因此，電鏡成像得到的更接

3、近原物質(zhì)的真實(shí)結(jié)構(gòu)，且分辨率高。2、冷凍電鏡技術(shù)介紹（1）關(guān)于玻璃態(tài)冰：冰的結(jié)構(gòu)多種多樣，包括六角形冰、立方體冰等，其物理狀態(tài)與冷凍速率有關(guān)。若要形成玻璃態(tài)（即無定形態(tài)）的冰，需要冷凍速率達(dá)到每秒鐘104攝氏度。此時(shí)，冰的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)各向同性，不會(huì)因成像角度不同導(dǎo)致圖像產(chǎn)生偏差。（2）操作步驟概要： 冷凍包埋轉(zhuǎn)移至液氮或液氦中觀測(cè)，圖像采集三維重構(gòu)（3）圖像采集的質(zhì)量要求： 應(yīng)保證樣品在玻璃態(tài)冰中的分布均一，厚度一致切適當(dāng)，避免污染。此外，特別應(yīng)注意的是，該方法對(duì)電子劑量很敏感，最適為10e/A2，明顯超過最適劑量即容易因受到過量電子輻射而破壞物理結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致冰迅速汽化，出現(xiàn)氣泡，造成圖像采集不成功

4、。 因此，必須采用低劑量技術(shù)（20e/A2），用1k3k倍的低倍鏡尋找，在目標(biāo)域的臨近區(qū)聚焦，使記錄區(qū)域僅在拍攝時(shí)（1s左右）受到電子輻射，保證樣品不被損壞。二、課外補(bǔ)充學(xué)習(xí)：冷凍電鏡技術(shù)難點(diǎn)的擴(kuò)展閱讀1、冰晶污染冰晶污染是冷凍電鏡的主要問題和最重要的難點(diǎn)，可發(fā)生在冷凍電鏡的各個(gè)步驟。在每個(gè)步驟中，冰晶污染的形成的主要原因不同。在冷凍制樣階段，冰晶污染形成的原因主要有三點(diǎn)：（1）冷凍速率不夠；（2）冷卻劑的溫度未接近凝點(diǎn)；（3）容器邊緣的小冰晶墜入液氮中黏附在樣品上，或在樣品轉(zhuǎn)移過程，空氣中的水分子凝結(jié)在樣品表面。2、電子輻射損傷電子輻射損傷的原因幾乎均可歸結(jié)為熱效應(yīng)，被輻照區(qū)域的損傷大致可分

5、為晶化、升華、起泡和漂移4種類型。（1）晶化與電子束的加速電壓和電子劑量有關(guān)，一般發(fā)生在樣品表面，玻璃態(tài)的冰晶化形成立方晶相，失去各向同性。（2）升華也發(fā)生在樣品表面，本身現(xiàn)象與電子劑量無關(guān)，但是升華速率與電子劑量有關(guān)電子輻射會(huì)增加樣品表面分子的動(dòng)能，從而增加樣品表面分子脫離樣品表面的幾率。（3）起泡對(duì)于較厚的含水樣品。非彈性散射將造成能量沉積，大部分發(fā)生在接近樣品表面的內(nèi)層，此外，水是熱的不良導(dǎo)體，因此會(huì)出現(xiàn)起泡現(xiàn)象。隨電子劑量的增加，起泡的范圍和形態(tài)也會(huì)有所不同。（4）漂移樣品的物理漂移來自于樣品本身的形變，而樣品的象漂移原因?yàn)殡娮釉跇悠穬?nèi)的沉積，對(duì)電子束的偏轉(zhuǎn)方向產(chǎn)生影響。一般來說，使用

6、盡可能低的電子劑量和盡可能小的照明光斑是避免上述四種輻射損傷的最佳方法。3、圖像去噪由于冷凍電鏡特殊的低電子劑量和低襯度成像技術(shù)，使得圖像反差弱，信噪比低，不易提取有效的結(jié)構(gòu)信息。而濾波是圖像去噪的主要方法。其原理為將信號(hào)和噪聲都視為隨機(jī)信號(hào)，利用它們不同的統(tǒng)計(jì)特征，通過最小方差估計(jì)某點(diǎn)的最似信號(hào)類型，若為噪點(diǎn)則予以除去。此外，圖像增強(qiáng)和圖像復(fù)原也可相對(duì)地減輕噪點(diǎn)對(duì)信號(hào)圖像的影響，其中圖像增強(qiáng)是將人們主觀感興趣的部分亮度提高，而圖像復(fù)原則是針對(duì)圖像中客觀存在，但受到了噪點(diǎn)干擾（稱為退化）的樣品信號(hào)，將它們的結(jié)構(gòu)性信息予以恢復(fù)。對(duì)于圖像增強(qiáng)，一般會(huì)綜合采用濾波、掩模、灰度變換、直方圖均衡化等方法

7、對(duì)感興趣區(qū)域的信息進(jìn)行增強(qiáng)；而圖像復(fù)原的典型方法是根據(jù)先前的樣品經(jīng)驗(yàn)，建立一個(gè)退化模型，以此模型為基礎(chǔ)采用濾波等手段處理，使得復(fù)原后的圖像符合一定的準(zhǔn)則，達(dá)到改善圖像質(zhì)量的目的。其中信嗓比是評(píng)價(jià)圖像復(fù)原程度的主要標(biāo)準(zhǔn)之一。三、我國(guó)冷凍電鏡技術(shù)的新應(yīng)用2011年1月，中科院生物物理所利用冷凍電鏡平臺(tái)，獲得了呼腸孤病毒科的質(zhì)型多角體病毒近原子分辨率的三維結(jié)構(gòu)，并獨(dú)立構(gòu)建了全原子模型。這是我國(guó)首次利用冷凍電鏡技術(shù)解析生物大分子原子結(jié)構(gòu)模型，也是世界上首次利用冷凍電鏡圖像獲得的生物大分子復(fù)合體的全原子模型。該研究確認(rèn)了呼腸孤病毒mRNA的流出通道，定位了該病毒的兩個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶，并揭示了該流出通道是如何

8、引導(dǎo)mRNA依次經(jīng)過這兩個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶以完成“加帽”過程的。 在論文Atomic model of a cypovirus built from cryo-EM structure provides insight into the mechanism of mRNA capping中，研究人員通過冷凍電鏡技術(shù)，得出以下結(jié)論：（1）CPV與其他呼腸孤病毒科相比，其主要衣殼蛋白缺乏特異的氨基酸序列，但它具有結(jié)構(gòu)保守的酶蛋白VP3和衣殼蛋白VP1，表明具turret蛋白的呼腸孤病毒科的mRNA轉(zhuǎn)錄機(jī)制和衣殼組裝機(jī)制有共性。（2）CPV五聚體turret蛋白頂部獨(dú)特的結(jié)構(gòu)組織區(qū)是其指導(dǎo)mRNA完成“加

9、帽”過程的關(guān)鍵區(qū)域。（3）CPV的VP5蛋白由RNA第7節(jié)段編碼，是由P50蛋白在轉(zhuǎn)譯后分裂產(chǎn)生的。四、冷凍電鏡技術(shù)的應(yīng)用前景 隨生物成像技術(shù)的發(fā)展，電鏡技術(shù)已不再限于單純的形態(tài)結(jié)構(gòu)研究，而發(fā)展為不同水平上的顯微學(xué)技術(shù)綜合應(yīng)用。同時(shí)，顯微學(xué)技術(shù)與細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等其他生命科學(xué)技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用正在成為研究熱點(diǎn)。例如，免疫細(xì)胞化學(xué)與電鏡技術(shù)相結(jié)合，使原位雜交技術(shù)已從理論走向?qū)嶋H，得到相當(dāng)普遍的應(yīng)用。因此，冷凍電鏡技術(shù)在對(duì)物質(zhì)細(xì)微結(jié)構(gòu)與功能的分析上必將極大地推動(dòng)生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展。參考資料：1 尹長(zhǎng)城老師現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)成像技術(shù)選修課內(nèi)容2 李鯤鵬 冷凍電鏡技術(shù)與冷凍電鏡圖像去噪研究D.中山大學(xué).20053 Cheng L, Sun J. et al. Atomic model of a cypovirus built from cryo-EM structure provides insigh