生物技術制藥復習資料 (熊宗貴)

1、2011級生物工程 2013-2014學年復習資料第二章 生物藥物概論一、生物藥物生產(chǎn)原料選擇的主要原則、生物藥物的特性及種類。主要原則：有效成分含量高，原料新鮮；來源豐富，易得；原料產(chǎn)地較近；雜質(zhì)含量少；原料成本低；易提取。特性：（1）藥理學特性：治療的針對性強；藥理學活性高；毒副作用小，營養(yǎng)價值高；生理副作用常有發(fā)生。（2）生產(chǎn)、制備中的特殊性：原料中的有效物質(zhì)含量低；穩(wěn)定性差；易腐敗；注射用藥有特殊要求。（3）檢驗上的特殊性：要有理化檢驗指標，和生物活性檢驗指標。分類：按藥物化學本質(zhì)和化學特性分類：（1）氨基酸及基衍生物類（2）多肽和蛋白質(zhì)類（3）酶和輔酶類（4）核酸及其降解物和衍生物類

2、（5）糖類（6）脂類（7）細胞生長因子類（8）生物制品類（9）小動物制劑（10）動物器官或組織制劑。按原料來源分類：（1）人體組織（2）動物組織（3）植物組織（4）微生物（5）海洋生物來源的藥物。按生理功能和用途分類：（1）治療藥物（2）預防藥物（3）診斷藥物（4）其他。2、 生物藥物提取分離制備方法的工藝過程。在對生物藥物進行提取操作時，選擇提取試劑需注意的問題。 工藝流程：1、生物藥物原料的選擇、預處理與保存（保存方法：冷凍法，-40；有機溶劑脫水法；防腐劑保鮮，多用于液體）。2、生物藥物的提?。海?）生物組織與細胞破碎：磨切法，壓力法，反復凍融法，超聲波震蕩破碎法，自溶法，酶溶法（2）選

3、擇合適的溶劑進行提?。紤]提取劑的用量、提取時間、提取次數(shù)，注意溫度、變性劑等因素）。3、生物藥物的分離純化：（1）蛋白質(zhì)類藥物的分離純化：沉淀法，親和層析法，疏水層析法（2）核酸類藥物的分離純化：提取法，發(fā)酵法（3）糖類：沉淀法，離子交換層析法（4）脂類：沉淀法，吸附層析法，離子交換層析法（5）氨基酸類：沉淀法，吸附法，離子交換法。試劑的選擇：1、對所需要提取的活性成分溶出度較高，對雜質(zhì)較低。2、不破壞活性成分。3、利于后續(xù)預處理。4、對環(huán)境影響較小，有利于回收和處理。5、對設備要求不高。6、成本較低。7、最好對人體無害。第三章 基因工程制藥一、基因工程制藥的主要工藝過程。獲得目的基因組建重

4、組質(zhì)粒構建基因工程菌（或細胞）培養(yǎng)工程菌產(chǎn)物的分離純化質(zhì)量控制產(chǎn)品檢驗包裝2、 什么是目的基因？有幾種獲取方法？用于構建基因工程菌的目的基因應該達到什么要求？目的基因既是人們所需要的特定基因，一般也是接受目的基因的細胞或個體原本沒有的基因。獲取方法：（1）直接從生物體中提取總DNA，構建基因文庫，從中調(diào)用目的基因；（2）以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補的DNA片段；（3）利用聚合酶鏈式反應（PCR）特異性地擴增所需要的目的基因片段（4）化學合成法；逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR法合成cDNA?；疽?不含多余干擾成分，純度高；片段大小適合重組操作；結構、序列正確，達到一定數(shù)量。三、基因工程克隆細胞和

5、表達細胞、克隆載體和表達載體其各自特點?？寺≥d體：1、具備復制原點，在宿主細胞內(nèi)必須能夠自主復制。2、有一個或多個用于篩選的選擇標記。3、具備合適的限制性核酸內(nèi)切酶的單一識別位點。4、有較高的拷貝數(shù)。表達載體：要使克隆基因在宿主細胞中表達，就要將他放入帶有基因表達所需要的各種調(diào)控元件的載體中，這種載體就成為表達載體。表達載體的結構比克隆載體復雜，除了必須具備與克隆載體相同的復制原點，多克隆位點和篩選標記基因以外，還必須有控制目的基因表達的調(diào)控序列，包括啟動子，轉(zhuǎn)錄終止子等。四、目的基因高效表達的方式有哪些？怎樣全面提高目的基因的表達水平？有何措施？目的基因高效表達的方式：1.目的基因的不溶性高

6、效表達。表達的蛋白質(zhì)往往形成不溶性的無生物活性的包涵體，需要經(jīng)過溶解和復性才能獲得有活性的目的蛋白。2.目的基因的高效可溶性表達。可溶性的目的蛋白本身常具有生物活性，無需復雜的變性復性的后分離過程，是一種很有希望的提高目的基因表達的新策略。3.目的基因的高效分泌型表達。目的基因的分泌型表達有兩種情形：目的蛋白分泌到細胞周質(zhì)中和目的蛋白轉(zhuǎn)運到細胞周質(zhì)后再分泌到細胞外。對于能分泌到細胞外的表達系統(tǒng)，能進一步簡化產(chǎn)物分離工藝。提高目的基因表達水平的措施：1.對基因工程宿主菌進行改造。如在上游階段通過改造宿主的遺傳性能從而減少或消除乙酸的生成；通過改造大腸桿菌使之能在貧氧條件下生長。2.提高工程菌的質(zhì)

7、粒穩(wěn)定性。如在上游階段質(zhì)粒構建時插入抗生素抗性基因；在質(zhì)粒構建時應該加入稱為par和cer的位點（par位點能夠在細胞分裂過程中使質(zhì)粒分布更均勻，cer位點則能夠防止多聚體質(zhì)粒的形成，從而能從源頭上提高質(zhì)粒穩(wěn)定性）。在下游階段采用細胞生長期和誘導表達時期分開的分段培養(yǎng)策略，另外還可采用培養(yǎng)條件循環(huán)控制策略和采用固定化細胞培養(yǎng)等。 3.選擇能高密度表達的宿主菌和對重組菌進行高密度培養(yǎng)。如選擇培養(yǎng)時菌體密度和表達水平能盡可能高的宿主菌。在下游階段賦予工程菌生長和產(chǎn)物表達的最適環(huán)境條件。4.減少乙酸等抑制性副產(chǎn)物的形成。如在下游階段設計好培養(yǎng)基的組成；選取合適的比生長速率 ；適當降低培養(yǎng)溫度；限制性

8、流加葡萄糖；將基因工程菌培養(yǎng)和乙酸的分離同時進行等。5.選擇能提高目的蛋白表達質(zhì)量的宿主菌以及能提高目的蛋白表達質(zhì)量的方法。如在上游階段選擇盡可能地不產(chǎn)生或少產(chǎn)生能引起蛋白質(zhì)變性或降解的酶系的宿主細胞。而在下游階段可采用將菌體生長與蛋白表達時期分開的策略。（也可以分上、下游表述為：上游-對基因工程宿主菌進行改造；提高工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性；選擇能高密度表達的宿主菌；選擇能提高目的蛋白表達質(zhì)量的宿主菌。下游-提高工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性；對重組菌進行高密度培養(yǎng)；減少乙酸等抑制性副產(chǎn)物的形成；選擇能提高目的蛋白表達質(zhì)量的方法。）五、工程菌的穩(wěn)定性及其影響因素和考察方法?；蚬こ叹倪z傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組

9、質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式：1.結構不穩(wěn)定性：重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾導致其表觀生物學功能的喪失。2.分配不穩(wěn)定性：整個重組DNA分子從受體細胞中逃逸。影響基因工程菌穩(wěn)定性的因素：遺傳特性：1.載體的選擇 2.宿主的選擇 3.外源基因整合到宿主染色體上 發(fā)酵工藝：1.培養(yǎng)基 2.生長速率 3.限制性機制 4.溫度 5.pH和溶氧 6.外源基因表達六、基因工程菌的常見培養(yǎng)方式及其各自特點有哪些？連續(xù)式發(fā)酵對基因工程產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)有什么優(yōu)勢？影響基因工程菌發(fā)酵的因素?；蚬こ叹鷺嫿ê突蚬こ叹a(chǎn)其發(fā)酵研究各自的目的、意義及相應研究內(nèi)容。培養(yǎng)方式：分批培

10、養(yǎng)，補料分批培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)，透析培養(yǎng)，固定化培養(yǎng)。補料分批培養(yǎng) 將種子接人發(fā)酵反應器中進行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間后，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進一步生長的培養(yǎng)方法。連續(xù)培養(yǎng) 將種子接人發(fā)酵反應器中，攪拌培養(yǎng)至一定菌體濃度后，開動進料和出料的蠕動泵，以控制一定稀釋率進行不間斷的培養(yǎng)。透析培養(yǎng) 透析培養(yǎng)是利用膜的半透性原理使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分離，通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對生產(chǎn)菌的不利影響。固定化培養(yǎng) 即將固定化技術應用于基因工程菌培養(yǎng)，基因工程菌經(jīng)固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高，便于進行連續(xù)培養(yǎng)，特別是對分泌型菌更為有利。連續(xù)培養(yǎng)可為微生物提供恒定的生活環(huán)境，控制其比生長速率，可為研

11、究基因工程菌的發(fā)酵動力學、生理生化特性、環(huán)境因素對基因表達的影響等創(chuàng)造良好條件。 在連續(xù)式培養(yǎng)中，還可以將工程菌的生長階段和基因表達階段分開進行兩階段連續(xù)培養(yǎng)，并通過優(yōu)化誘導水平、稀釋率和細胞比生長速率這3個參數(shù)，可以保證在第一階段培養(yǎng)時質(zhì)粒穩(wěn)定，在第二階段可獲得最高表達水平或最大產(chǎn)率。影響基因工程菌發(fā)酵的主要因素：1、培養(yǎng)基的影響。2、接種量的影響。3、溫度的影響。4、溶解氧的影響。5、誘導時機的影響。6、誘導表達程序的影響。7、pH的影響基因工程菌發(fā)酵研究內(nèi)容：1、選擇宿主菌：研究不同宿主菌對外源基因表達的影響 2、基因工程菌的生長曲線測定 3發(fā)酵條件對外源基因表達的影響 4、重組質(zhì)粒穩(wěn)定

12、性研究。七、以包涵體表達形式的基因工程藥物的分離純化過程和方法，分離純化出具有活性的蛋白質(zhì)的一般步驟及其操作要點。進行分離純化研究涉及到的研究項目及內(nèi)容。 過程方法及操作要點：1、 菌體細胞的收集與破碎（既要使菌體破碎率盡可能高，又要保持包涵體的完整性）。2、 包涵體的分離、洗滌與溶解（通過離心法使包涵體與上清液中的碎片及雜質(zhì)蛋白分開，包涵體洗滌的基本原則是雜質(zhì)去除率盡可能高而不溶解包涵體中的目的蛋白。溶解包涵體的試劑選擇基本原則是對目的蛋白的溶解性強、選擇性好；保護蛋白質(zhì)的生物活性；安全性；適合后續(xù)各種操作；成本低）。3、 變性蛋白的純化（對包涵體抽提物采用柱層析、凝膠過濾、離子交換層析和H

13、PLC等方法進一步分離純化）。4、 蛋白質(zhì)的復性（恢復可溶性和生物活性，應考慮影響因素：蛋白質(zhì)濃度、雜質(zhì)含量、沖折疊速度、氧化還原劑用量和比例、重折疊配體的摻入、溫度、pH、離子強度等）。分離純化研究：1、 破菌研究：破菌方法及其條件研究，鏡檢評價其破碎效果，原則是使菌體破碎率盡可能高，又要保持包涵體的完整性2、 包涵體的分離和洗滌研究：（1）分離包涵體時的離心力和時間的考察；（2）洗滌劑及其他濃度、用量研究；（3）洗滌時間和溫度研究。 包涵體洗滌操作的基本原則：（1）洗滌劑雜質(zhì)去除率盡可能高，而不溶解包涵體中的目的蛋白；（2）分離包涵體時的離心力和離心時間盡可能滿足將包涵體與細胞碎片等雜質(zhì)很

14、好地分離。3、 目的蛋白的變性（抽提）研究：（1）變性劑及其濃度、用量的研究（2）變性操作時間和溫度研究（3）變性操作后的固液分離（離心力和離心時間）研究。4、 變性蛋白的純化研究：對包涵體抽提物可采取柱層析、凝膠過濾、離子交換層析和HPLC等方法進一步分離純化。 Ps：重組蛋白的純化可以在包涵體溶解后進行，也可以在復性后進行，因此還應進行兩種方法的對比研究。5、 變性蛋白的復性研究：考察比較不同復性方法對目的蛋白復性效果的影響。主要考察其對蛋白回收率和復性程度的影響；另外，還需要考察復性時間的影響因素，如蛋白質(zhì)濃度、雜質(zhì)的含量、重折疊速度、氧化還原劑的用量和比例、重折疊配體的摻入、溫度、pH

15、值和離子強度等對復性效果的影響。6、 目的蛋白的高度純化研究：對經(jīng)復性后得到的目的蛋白進行進一步高度純化，以滿足不同的需要。八、基因工程藥物質(zhì)量控制的必要性及其質(zhì)控要點，基因工程藥物最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制特點及要點。必要性：1、 它是利用獲得細胞作為表達系統(tǒng)來制備產(chǎn)品，所獲得的蛋白質(zhì)往往分子量較大，并且具復雜的表達結構；2、 許多基因工程藥物都是參與人體一些生理功能精密的蛋白質(zhì)，在極微量的差別的情況下產(chǎn)生顯著效應；3、 宿主細胞中表達的外源基因在翻譯、轉(zhuǎn)錄及工藝放大的過程中會產(chǎn)生變化。質(zhì)控要點：1、 原料的質(zhì)量控制。確保編碼藥品的DNA序列正確性，重組微生物來自單一克隆，所用的質(zhì)粒純而穩(wěn)定。2、生

16、產(chǎn)的質(zhì)量控制。原始細胞庫生產(chǎn)、有限代次的生產(chǎn)、連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)、分離純化。3、最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制。產(chǎn)品的鑒別、純度分析、生物活性測定、安全性穩(wěn)定性考察和產(chǎn)品一致性的保證。質(zhì)控特點：任何單一的分析方法都無法滿足對該類產(chǎn)品的檢測要求，它需要綜合生物化學、免疫學、微生物學、細胞生物學和分子生物學等多門學科的理論和技術，才能切實保證基因工程產(chǎn)品的安全有效。第四章 酶工程制藥一、酶工程制藥的主要內(nèi)容1、藥用酶的生產(chǎn)：發(fā)酵生產(chǎn)，分離純化，分子修飾2、酶法制藥：酶催化反應、固定化、非水相催化二、酶法制藥研究中涉及到的研究項目及內(nèi)容1、 原料的選擇及反應的研究。 2、酶或酶系的選擇研究。 3、酶催化反應最佳工藝條

17、件研究。 4、產(chǎn)物的分離純化研究第五章 植物細胞培養(yǎng)制藥一、植物細胞的生理特性，植物細胞培養(yǎng)的基本流程和技術。生理特性：1、 比微生物細胞大得多；2、具有群體生長特性，單細胞難以生長，繁殖；3、對剪切力敏感，抗張力強度大，抗剪切力??；4、生長速度慢，操作周期長；5、容易結成細胞團；6、大多植物細胞的生長及次級代謝物的生產(chǎn)都要求一定的光照和時間，且不同波長的光具有不同的效果。基本流程：1、外植體的獲得及預處理； 2、獲得懸浮細胞株 3、懸浮細胞株篩選 4、植物細胞的擴大培養(yǎng)； 5、大規(guī)模培養(yǎng)基本技術：1、植物細胞的獲得技術； 2、植物細胞的選育與改良技術； 3、植物細胞培養(yǎng)技術； 4、植物細胞培

18、養(yǎng)次級代謝產(chǎn)物技術； 5、植物細胞培養(yǎng)生物轉(zhuǎn)化技術二、植物細胞獲取的主要方法及其操作過程，植物細胞培養(yǎng)制藥的培養(yǎng)方法。愈傷組織培養(yǎng)的基本過程和操作。主要方法：從外植體直接分離，愈傷組織誘導獲取，原生質(zhì)體再生操作過程：1、 外植體的選擇與預處理。選擇時需綜合考慮的因素有外植體大小、同一植物不同部位的選取、不同物種的選擇、植物年齡以及取材季節(jié)。注意滅菌劑和滅菌時間選擇以及滅菌后無菌水洗。2、 直接分離：（1） 機械搗碎法：先將外植體輕輕搗碎，然后通過過濾和離心分離細胞；（2）酶解法：利用果膠酶，纖維素酶等處理，分離出具有代謝活性的細胞。3、 愈傷組織誘導法：（1）誘導培養(yǎng)基的制備 （2）外植體植入

19、誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)生成愈傷組織 （3）愈傷組織繼代培養(yǎng) （4）從愈傷組織分離得到植物細胞。4、 原生質(zhì)體再生法（不要求）。培養(yǎng)方法：按培養(yǎng)對象分：愈傷組織培養(yǎng)，原生質(zhì)體培養(yǎng)，小細胞團培養(yǎng)按培養(yǎng)基類型分：固體培養(yǎng)，液體培養(yǎng)按培養(yǎng)方式：懸浮細胞培養(yǎng)，固定化細胞培養(yǎng)基本操作和過程：1、 愈傷組織培養(yǎng)基的配制。 配制液體培養(yǎng)基 配制含有各種所需營養(yǎng)成分的液體培養(yǎng)基，其濃度是所需培養(yǎng)基濃度的2倍。 瓊脂的配制與熔化 按照1.5%瓊脂的比例稱取瓊脂，加入所需培養(yǎng)基體積一半的蒸餾水，放置一段時間，待瓊脂吸水膨脹后加熱使瓊脂完全熔化。 分裝 將上述熔化的瓊脂趁熱與液體培養(yǎng)基按照1:1的比例混合均勻，用稀酸或稀堿

20、調(diào)節(jié)至所需的pH值，分裝于培養(yǎng)皿、三角瓶或試管等培養(yǎng)容器中。 滅菌 在120的條件下，滅菌1520min，冷卻后備用。2、愈傷組織的選擇。通常在愈傷組織誘導的10-15d左右進行繼代培養(yǎng)，在繼代培養(yǎng)的第10-15d進行新一輪的繼代培養(yǎng)。3、接種。首先在無菌條件下，用鑷子或小刀將選擇好的愈傷組織塊分割成若干小塊，剔除附著在愈傷組織塊上的原有培養(yǎng)基，必要時可以用無菌水清洗幾次，然后在無菌條件下將處理好的愈傷組織小塊轉(zhuǎn)移到含有新鮮固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。4、培養(yǎng)。將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中，在一定條件下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)一定時間后，適時地進行下一輪的繼代培養(yǎng)或接種到液體培養(yǎng)基中進行細胞懸浮培養(yǎng)。例：從愈傷組織獲

21、得植物細胞有哪兩種操作方式？將愈傷組織接種到新鮮的固體培養(yǎng)基中是怎樣操作的？（10分）答：方法1：對誘導獲得的愈傷組織用鑷子或小刀分割得到植物小細胞團；方法2：將愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中，加入經(jīng)過殺菌處理的玻璃珠進行振蕩培養(yǎng)，使愈傷組織分散成為小細胞團或單細胞，然后用適當孔徑的不銹鋼篩網(wǎng)過濾，除去大細胞團和殘渣，得到一定體積的小細胞團或單細胞懸浮液。 操作：在無菌條件下，首先用鑷子或小刀將選擇好的愈傷組織塊分割成若干小塊，將原培養(yǎng)基清洗干凈，然后將處理好的愈傷組織小塊轉(zhuǎn)移到含有新鮮固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿中。三、植物細胞培養(yǎng)中提高植物次生代謝物生產(chǎn)的途徑。（具例見教材）1、添加誘導因子：引起植物

22、過敏反應，誘導植物特定基因表達，進而激活特定次生代謝途徑，積累特定的目的次生代謝物，具有種屬專一性；2、前體飼喂：在植物細胞培養(yǎng)中加入次生代謝物合成的前體物質(zhì)； 3、兩相法培養(yǎng)：細胞在其中一相中生長并合成次生代謝物，而這些產(chǎn)物又通過主動或被動運輸方式釋放到細胞外，并被另一相所吸收，達到富集產(chǎn)物的目的； 4、培養(yǎng)條件的控制：通過優(yōu)化培養(yǎng)基、光照、溫度、通氣等條件的調(diào)控，使細胞次級產(chǎn)物分泌變多； 5、在培養(yǎng)基中添加代謝產(chǎn)物合成抑制劑； 6、其他，如選育高產(chǎn)細胞株，二步法培養(yǎng)，新型生物反應器等。四、植物細胞培養(yǎng)次級代謝物生產(chǎn)的基本工藝過程，過程涉及到哪些研究內(nèi)容？如何進行研究？工藝過程：1、 外植體

23、的選擇與處理； 2、植物細胞的獲得； 3、植物細胞的擴大培養(yǎng)； 4、植物細胞懸浮培養(yǎng)； 5、次級代謝物的分離純化研究的內(nèi)容：1、外植體的選擇和處理研究； 2、愈傷組織誘導； 3、植物細胞的誘變、篩選； 4、細胞懸浮培養(yǎng)的研究； 5、提取分離與純化方法研究五、植物細胞培養(yǎng)生物轉(zhuǎn)化制藥的基本工藝過程，過程涉及到哪些研究內(nèi)容？如何進行研究？生物轉(zhuǎn)化基本過程：1. 轉(zhuǎn)化反應植物細胞篩選 2.外植體的選擇和處理 3.培養(yǎng)基的選擇和配置 4.細胞的獲取 5.穩(wěn)定細胞系的建立 6.加入底物進行生物轉(zhuǎn)化 7.轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的提取分離 8.產(chǎn)物檢測研究內(nèi)容：1.轉(zhuǎn)化持續(xù)時間的研究 2.底物濃度的研究 3.不同細胞密度

24、的研究 4.培養(yǎng)體系pH值的研究 5.溫度光照的研究六、植物細胞培養(yǎng)代謝物生產(chǎn)制藥和生物轉(zhuǎn)化制藥其過程的影響因素。植物細胞培養(yǎng)代謝物影響因素：1.外植體的選擇。不同外植體的懸浮細胞培養(yǎng)物，其最大次級代謝產(chǎn)物的累計時間各異。2.培養(yǎng)條件的影響 培養(yǎng)環(huán)境的內(nèi)在因素： a。接種和誘導 b。基本培養(yǎng)基的組成： 1.磷 2.氮 3.碳源 4.植物生長調(diào)節(jié)劑 5.O2和pH值 6.滲出物 兩步培養(yǎng)法 培養(yǎng)環(huán)境的外部因素： 溫度 2.攪拌頻率 3.培養(yǎng)容器的影響 4.光的影響生物轉(zhuǎn)化制藥其過程的影響：1、植物細胞的影響 1.轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的影響 2.細胞系的影響 3.細胞生長階段的影響2、外源底物的影響（1）外源

25、底物濃度的影響：外源底物對培養(yǎng)的植物細胞一般都是有毒性的（2）外源底物結構的影響（3）外源底物添加方式的影響 不溶性的底物，先溶解后再加入；活用細粉末；用吐溫或環(huán)糊精來促溶3、培養(yǎng)條件的影響培養(yǎng)基的組成、植物激素、刺激劑、抑制劑以及pH值、溫度、光照等培養(yǎng)條件。第六章 動物細胞培養(yǎng)制藥一、動物細胞的生理特點，生產(chǎn)用動物細胞的種類及其特點，生產(chǎn)用動物細胞的獲得，工程細胞庫的種類及要求，細胞的冷凍保存與復蘇技術及其操作要領。生理特點：1、動物細胞的分裂周期長； 2、細胞生長需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象； 3、正常二倍體細胞的生長壽命有限； 4、對環(huán)境敏感； 5、對培養(yǎng)基要求高； 6、蛋白質(zhì)的合成

26、途徑和修飾功能與細菌不同。細胞種類及特點：1、 原代細胞：增殖能力有限，需大量動物。2、 二倍體細胞體：2n型染色體組，傳代壽命有限，具有明顯的貼壁依賴和接觸抑制特點，無致癌性。3、 轉(zhuǎn)化細胞系：具有無限繁殖超額能力，倍增時間較短，對培養(yǎng)條件和生長因子要求較低。4、 融合細胞系：雜交特性。5、 重組工程細胞系工程細胞庫的種類及要求：1、 原始細胞庫（MCB）:儲存于MCB的細胞應該是單一來源的均質(zhì)細胞，對二倍體細胞應該是群體倍增水平盡可能低的細胞。儲存時需有該細胞的詳細檔案，包括該細胞系的歷史，和對各種有害因子的檢查結果。2、 生產(chǎn)用細胞（MWCB）儲存于MWCB的細胞應該是從MCB來的，或從

27、單一安瓿來，或從多個安瓿在融化即刻混合在一起的然后經(jīng)培養(yǎng)擴增達一定數(shù)量后，再分裝儲存形成的細胞庫。該細胞庫同樣需要建檔案，而且需進行無菌性的無細胞交叉污染的檢查。細胞的冷凍保存與復蘇技術及其操作要領：常用技術是液氮冷凍保存法，主要采用加入適量保護劑的緩慢冷凍法保存細胞。步驟：細胞懸液制備加保護劑分裝和封口液氮凍存。復蘇一般采用快速融化法，以保證細胞外結晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結晶損傷細胞。二、動物細胞體外培養(yǎng)的生長與增殖過程，動物細胞與微生物細胞和植物細胞在培養(yǎng)上的區(qū)別，動物細胞培養(yǎng)的方法和操作方式及其特點。生長與增殖過程：原代培養(yǎng)期傳代培養(yǎng)期衰退期。培養(yǎng)區(qū)別：1

28、、動物細胞無細胞壁，且大多哺乳動物細胞附著在固體或半固體的表面才能生長；2、對營養(yǎng)要求嚴格，除氨基酸，維生素，鹽類，葡萄糖或半乳糖外，還需要血清；3、動物細胞對環(huán)境敏感，包括pH，溶氧，溫度，剪切應力都比微生物有更嚴的要求，一般需嚴格地監(jiān)測和控制。培養(yǎng)方法及特點：1、 懸浮培養(yǎng)：適用于一切各類的懸浮細胞和兼性貼壁細胞。優(yōu)點：操作簡便，培養(yǎng)條件較均一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易擴大規(guī)模培養(yǎng)。缺點：較難采用灌流培養(yǎng)，細胞密度一般較低（即不適于高密度培養(yǎng)）。2、 貼壁培養(yǎng)：適用于一切貼壁細胞和兼性貼壁細胞。優(yōu)點：適用的細胞各類廣，較易采用灌流培養(yǎng)，細胞密度高，缺點：操作比較麻煩，需要合適的貼附材料和足夠的

29、面積，培養(yǎng)條件不均一，傳質(zhì)和傳氧較差。3、 貼壁懸浮培養(yǎng)：將懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)兩者結合，優(yōu)勢互補，主要方法有：微載體培養(yǎng)，包埋和微囊培養(yǎng)，結團培養(yǎng)。操作方法及特點：1、 分批式操作：細胞和培養(yǎng)基一次性加入反應器進行培養(yǎng)。2、 流加式操作：不斷加入營養(yǎng)成分而不取出條件培養(yǎng)基（經(jīng)培養(yǎng)已經(jīng)含有細胞產(chǎn)物但不含細胞的培養(yǎng)基）。3、 半連續(xù)式操作：細胞和培養(yǎng)基加入反應器后，在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中每隔一段時間取出部分培養(yǎng)物，補充同樣數(shù)量新鮮培養(yǎng)基，反應器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變。4、 連續(xù)式操作：連續(xù)地加入新鮮培養(yǎng)基，同時等速地取出反應器內(nèi)的培養(yǎng)液（連同細胞）。5、 灌流式操作：不斷取出部分條件培養(yǎng)基（

30、無細胞），補充等量新鮮培養(yǎng)基。三、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的主要影響因素及其不良因素的控制。主要影響因素：1.細胞培養(yǎng)環(huán)境（營養(yǎng)條件、產(chǎn)物積累、pH、溫度和滲透壓） 2.乳酸和氨的毒性累積 3.必需營養(yǎng)物的添加 4.對細胞的剪切作用不良因素解決手段：設計適應細胞生長的無血清培養(yǎng)基；控制營養(yǎng)物的添加；減少產(chǎn)物消耗積累；剪切損害可通過反應器的優(yōu)化被減少，另外在培養(yǎng)液中添加剪切抑制劑。四、動物細胞培養(yǎng)制藥的基本工藝過程。目前用哺乳動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白工業(yè)化過程的主要通用技術平臺及其特點。如何進行動物細胞培養(yǎng)制藥的研究。動物細胞（搗碎）組織碎片（酶處理）單個細胞離心收集細胞（營養(yǎng)培養(yǎng)）培養(yǎng)瓶培養(yǎng)（酶）

31、消化處理接種擴大培養(yǎng)種子細胞液氮保存取出細胞種子種子解凍復活培養(yǎng)擴大培養(yǎng)接種大規(guī)模培養(yǎng)產(chǎn)物分離純化產(chǎn)品。技術平臺及特點：主要是以攪拌式生物反應器懸浮培養(yǎng)（70以上）作為通用技術平臺, 平臺工藝的特點是采用無血清培養(yǎng)（50以上）和成熟的流加和灌流工藝。懸浮培養(yǎng)工藝中影響細胞生產(chǎn)數(shù)量和質(zhì)量的因素,主要應考慮細胞培養(yǎng)環(huán)境(營養(yǎng)條件、產(chǎn)物積累、pH、溫度和滲透壓) ,終產(chǎn)物(乳酸和氨) 毒性累積和必需營養(yǎng)物的添加等。設計適應細胞生長的無血清培養(yǎng)基,控制營養(yǎng)物的添加,減少產(chǎn)物消耗積累是解決問題的有效手段。 對于攪拌的剪切損害可通過反應器的優(yōu)化被減少, 另外在培養(yǎng)液中添加剪切保護劑。貼壁細胞生產(chǎn)工藝,最佳的生物反應器形式是攪拌式微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng),并可提供最有效的優(yōu)化工藝和最適宜的流加工藝設計。最佳的工藝設計是高密度連續(xù)灌流培養(yǎng)。 流加培養(yǎng)和灌流培養(yǎng)是動物細胞培養(yǎng)工藝中最常用的兩種操作方式。五、為什么要研究不同宿主菌對目的蛋白表達的影響？是怎樣進行研究的？ 由于不同載體提供的不同增強子和啟動子都有自己特異的結合蛋白，而只有能為它們提供這些蛋白的宿主菌才能使目的基因得到更好的表達。此外，不同大腸桿菌的不同種和亞種所含有的宿主蛋白酶種類和數(shù)量不同，對表達的產(chǎn)物會有不同程度的降解作用。故宿主