生物技術(shù)制藥復(fù)習(xí)資料 (熊宗貴)

1、2011級(jí)生物工程 2013-2014學(xué)年復(fù)習(xí)資料第二章 生物藥物概論一、生物藥物生產(chǎn)原料選擇的主要原則、生物藥物的特性及種類(lèi)。主要原則：有效成分含量高，原料新鮮；來(lái)源豐富，易得；原料產(chǎn)地較近；雜質(zhì)含量少；原料成本低；易提取。特性：（1）藥理學(xué)特性：治療的針對(duì)性強(qiáng)；藥理學(xué)活性高；毒副作用小，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高；生理副作用常有發(fā)生。（2）生產(chǎn)、制備中的特殊性：原料中的有效物質(zhì)含量低；穩(wěn)定性差；易腐敗；注射用藥有特殊要求。（3）檢驗(yàn)上的特殊性：要有理化檢驗(yàn)指標(biāo)，和生物活性檢驗(yàn)指標(biāo)。分類(lèi)：按藥物化學(xué)本質(zhì)和化學(xué)特性分類(lèi)：（1）氨基酸及基衍生物類(lèi)（2）多肽和蛋白質(zhì)類(lèi)（3）酶和輔酶類(lèi)（4）核酸及其降解物和衍生物類(lèi)

2、（5）糖類(lèi)（6）脂類(lèi)（7）細(xì)胞生長(zhǎng)因子類(lèi)（8）生物制品類(lèi)（9）小動(dòng)物制劑（10）動(dòng)物器官或組織制劑。按原料來(lái)源分類(lèi)：（1）人體組織（2）動(dòng)物組織（3）植物組織（4）微生物（5）海洋生物來(lái)源的藥物。按生理功能和用途分類(lèi)：（1）治療藥物（2）預(yù)防藥物（3）診斷藥物（4）其他。2、 生物藥物提取分離制備方法的工藝過(guò)程。在對(duì)生物藥物進(jìn)行提取操作時(shí)，選擇提取試劑需注意的問(wèn)題。 工藝流程：1、生物藥物原料的選擇、預(yù)處理與保存（保存方法：冷凍法，-40；有機(jī)溶劑脫水法；防腐劑保鮮，多用于液體）。2、生物藥物的提?。海?）生物組織與細(xì)胞破碎：磨切法，壓力法，反復(fù)凍融法，超聲波震蕩破碎法，自溶法，酶溶法（2）選

3、擇合適的溶劑進(jìn)行提取（考慮提取劑的用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)，注意溫度、變性劑等因素）。3、生物藥物的分離純化：（1）蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的分離純化：沉淀法，親和層析法，疏水層析法（2）核酸類(lèi)藥物的分離純化：提取法，發(fā)酵法（3）糖類(lèi)：沉淀法，離子交換層析法（4）脂類(lèi)：沉淀法，吸附層析法，離子交換層析法（5）氨基酸類(lèi)：沉淀法，吸附法，離子交換法。試劑的選擇：1、對(duì)所需要提取的活性成分溶出度較高，對(duì)雜質(zhì)較低。2、不破壞活性成分。3、利于后續(xù)預(yù)處理。4、對(duì)環(huán)境影響較小，有利于回收和處理。5、對(duì)設(shè)備要求不高。6、成本較低。7、最好對(duì)人體無(wú)害。第三章 基因工程制藥一、基因工程制藥的主要工藝過(guò)程。獲得目的基因組建重

4、組質(zhì)粒構(gòu)建基因工程菌（或細(xì)胞）培養(yǎng)工程菌產(chǎn)物的分離純化質(zhì)量控制產(chǎn)品檢驗(yàn)包裝2、 什么是目的基因？有幾種獲取方法？用于構(gòu)建基因工程菌的目的基因應(yīng)該達(dá)到什么要求？目的基因既是人們所需要的特定基因，一般也是接受目的基因的細(xì)胞或個(gè)體原本沒(méi)有的基因。獲取方法：（1）直接從生物體中提取總DNA，構(gòu)建基因文庫(kù)，從中調(diào)用目的基因；（2）以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的DNA片段；（3）利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）特異性地?cái)U(kuò)增所需要的目的基因片段（4）化學(xué)合成法；逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR法合成cDNA?；疽?不含多余干擾成分，純度高；片段大小適合重組操作；結(jié)構(gòu)、序列正確，達(dá)到一定數(shù)量。三、基因工程克隆細(xì)胞和

5、表達(dá)細(xì)胞、克隆載體和表達(dá)載體其各自特點(diǎn)。克隆載體：1、具備復(fù)制原點(diǎn)，在宿主細(xì)胞內(nèi)必須能夠自主復(fù)制。2、有一個(gè)或多個(gè)用于篩選的選擇標(biāo)記。3、具備合適的限制性核酸內(nèi)切酶的單一識(shí)別位點(diǎn)。4、有較高的拷貝數(shù)。表達(dá)載體：要使克隆基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)，就要將他放入帶有基因表達(dá)所需要的各種調(diào)控元件的載體中，這種載體就成為表達(dá)載體。表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)比克隆載體復(fù)雜，除了必須具備與克隆載體相同的復(fù)制原點(diǎn)，多克隆位點(diǎn)和篩選標(biāo)記基因以外，還必須有控制目的基因表達(dá)的調(diào)控序列，包括啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄終止子等。四、目的基因高效表達(dá)的方式有哪些？怎樣全面提高目的基因的表達(dá)水平？有何措施？目的基因高效表達(dá)的方式：1.目的基因的不溶性高

6、效表達(dá)。表達(dá)的蛋白質(zhì)往往形成不溶性的無(wú)生物活性的包涵體，需要經(jīng)過(guò)溶解和復(fù)性才能獲得有活性的目的蛋白。2.目的基因的高效可溶性表達(dá)?？扇苄缘哪康牡鞍妆旧沓＞哂猩锘钚裕瑹o(wú)需復(fù)雜的變性復(fù)性的后分離過(guò)程，是一種很有希望的提高目的基因表達(dá)的新策略。3.目的基因的高效分泌型表達(dá)。目的基因的分泌型表達(dá)有兩種情形：目的蛋白分泌到細(xì)胞周質(zhì)中和目的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞周質(zhì)后再分泌到細(xì)胞外。對(duì)于能分泌到細(xì)胞外的表達(dá)系統(tǒng)，能進(jìn)一步簡(jiǎn)化產(chǎn)物分離工藝。提高目的基因表達(dá)水平的措施：1.對(duì)基因工程宿主菌進(jìn)行改造。如在上游階段通過(guò)改造宿主的遺傳性能從而減少或消除乙酸的生成；通過(guò)改造大腸桿菌使之能在貧氧條件下生長(zhǎng)。2.提高工程菌的質(zhì)

7、粒穩(wěn)定性。如在上游階段質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)插入抗生素抗性基因；在質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)應(yīng)該加入稱(chēng)為par和cer的位點(diǎn)（par位點(diǎn)能夠在細(xì)胞分裂過(guò)程中使質(zhì)粒分布更均勻，cer位點(diǎn)則能夠防止多聚體質(zhì)粒的形成，從而能從源頭上提高質(zhì)粒穩(wěn)定性）。在下游階段采用細(xì)胞生長(zhǎng)期和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)期分開(kāi)的分段培養(yǎng)策略，另外還可采用培養(yǎng)條件循環(huán)控制策略和采用固定化細(xì)胞培養(yǎng)等。 3.選擇能高密度表達(dá)的宿主菌和對(duì)重組菌進(jìn)行高密度培養(yǎng)。如選擇培養(yǎng)時(shí)菌體密度和表達(dá)水平能盡可能高的宿主菌。在下游階段賦予工程菌生長(zhǎng)和產(chǎn)物表達(dá)的最適環(huán)境條件。4.減少乙酸等抑制性副產(chǎn)物的形成。如在下游階段設(shè)計(jì)好培養(yǎng)基的組成；選取合適的比生長(zhǎng)速率 ；適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度；限制性

8、流加葡萄糖；將基因工程菌培養(yǎng)和乙酸的分離同時(shí)進(jìn)行等。5.選擇能提高目的蛋白表達(dá)質(zhì)量的宿主菌以及能提高目的蛋白表達(dá)質(zhì)量的方法。如在上游階段選擇盡可能地不產(chǎn)生或少產(chǎn)生能引起蛋白質(zhì)變性或降解的酶系的宿主細(xì)胞。而在下游階段可采用將菌體生長(zhǎng)與蛋白表達(dá)時(shí)期分開(kāi)的策略。（也可以分上、下游表述為：上游-對(duì)基因工程宿主菌進(jìn)行改造；提高工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性；選擇能高密度表達(dá)的宿主菌；選擇能提高目的蛋白表達(dá)質(zhì)量的宿主菌。下游-提高工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性；對(duì)重組菌進(jìn)行高密度培養(yǎng)；減少乙酸等抑制性副產(chǎn)物的形成；選擇能提高目的蛋白表達(dá)質(zhì)量的方法。）五、工程菌的穩(wěn)定性及其影響因素和考察方法?；蚬こ叹倪z傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組

9、質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式：1.結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性：重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失。2.分配不穩(wěn)定性：整個(gè)重組DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸。影響基因工程菌穩(wěn)定性的因素：遺傳特性：1.載體的選擇 2.宿主的選擇 3.外源基因整合到宿主染色體上 發(fā)酵工藝：1.培養(yǎng)基 2.生長(zhǎng)速率 3.限制性機(jī)制 4.溫度 5.pH和溶氧 6.外源基因表達(dá)六、基因工程菌的常見(jiàn)培養(yǎng)方式及其各自特點(diǎn)有哪些？連續(xù)式發(fā)酵對(duì)基因工程產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)有什么優(yōu)勢(shì)？影響基因工程菌發(fā)酵的因素?；蚬こ叹鷺?gòu)建和基因工程菌生產(chǎn)其發(fā)酵研究各自的目的、意義及相應(yīng)研究?jī)?nèi)容。培養(yǎng)方式：分批培

10、養(yǎng)，補(bǔ)料分批培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)，透析培養(yǎng)，固定化培養(yǎng)。補(bǔ)料分批培養(yǎng) 將種子接人發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長(zhǎng)的培養(yǎng)方法。連續(xù)培養(yǎng) 將種子接人發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至一定菌體濃度后，開(kāi)動(dòng)進(jìn)料和出料的蠕動(dòng)泵，以控制一定稀釋率進(jìn)行不間斷的培養(yǎng)。透析培養(yǎng) 透析培養(yǎng)是利用膜的半透性原理使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分離，通過(guò)去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來(lái)解除其對(duì)生產(chǎn)菌的不利影響。固定化培養(yǎng) 即將固定化技術(shù)應(yīng)用于基因工程菌培養(yǎng)，基因工程菌經(jīng)固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高，便于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，特別是對(duì)分泌型菌更為有利。連續(xù)培養(yǎng)可為微生物提供恒定的生活環(huán)境，控制其比生長(zhǎng)速率，可為研

11、究基因工程菌的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、生理生化特性、環(huán)境因素對(duì)基因表達(dá)的影響等創(chuàng)造良好條件。 在連續(xù)式培養(yǎng)中，還可以將工程菌的生長(zhǎng)階段和基因表達(dá)階段分開(kāi)進(jìn)行兩階段連續(xù)培養(yǎng)，并通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)水平、稀釋率和細(xì)胞比生長(zhǎng)速率這3個(gè)參數(shù)，可以保證在第一階段培養(yǎng)時(shí)質(zhì)粒穩(wěn)定，在第二階段可獲得最高表達(dá)水平或最大產(chǎn)率。影響基因工程菌發(fā)酵的主要因素：1、培養(yǎng)基的影響。2、接種量的影響。3、溫度的影響。4、溶解氧的影響。5、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響。6、誘導(dǎo)表達(dá)程序的影響。7、pH的影響基因工程菌發(fā)酵研究?jī)?nèi)容：1、選擇宿主菌：研究不同宿主菌對(duì)外源基因表達(dá)的影響 2、基因工程菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定 3發(fā)酵條件對(duì)外源基因表達(dá)的影響 4、重組質(zhì)粒穩(wěn)定

12、性研究。七、以包涵體表達(dá)形式的基因工程藥物的分離純化過(guò)程和方法，分離純化出具有活性的蛋白質(zhì)的一般步驟及其操作要點(diǎn)。進(jìn)行分離純化研究涉及到的研究項(xiàng)目及內(nèi)容。 過(guò)程方法及操作要點(diǎn)：1、 菌體細(xì)胞的收集與破碎（既要使菌體破碎率盡可能高，又要保持包涵體的完整性）。2、 包涵體的分離、洗滌與溶解（通過(guò)離心法使包涵體與上清液中的碎片及雜質(zhì)蛋白分開(kāi)，包涵體洗滌的基本原則是雜質(zhì)去除率盡可能高而不溶解包涵體中的目的蛋白。溶解包涵體的試劑選擇基本原則是對(duì)目的蛋白的溶解性強(qiáng)、選擇性好；保護(hù)蛋白質(zhì)的生物活性；安全性；適合后續(xù)各種操作；成本低）。3、 變性蛋白的純化（對(duì)包涵體抽提物采用柱層析、凝膠過(guò)濾、離子交換層析和H

13、PLC等方法進(jìn)一步分離純化）。4、 蛋白質(zhì)的復(fù)性（恢復(fù)可溶性和生物活性，應(yīng)考慮影響因素：蛋白質(zhì)濃度、雜質(zhì)含量、沖折疊速度、氧化還原劑用量和比例、重折疊配體的摻入、溫度、pH、離子強(qiáng)度等）。分離純化研究：1、 破菌研究：破菌方法及其條件研究，鏡檢評(píng)價(jià)其破碎效果，原則是使菌體破碎率盡可能高，又要保持包涵體的完整性2、 包涵體的分離和洗滌研究：（1）分離包涵體時(shí)的離心力和時(shí)間的考察；（2）洗滌劑及其他濃度、用量研究；（3）洗滌時(shí)間和溫度研究。 包涵體洗滌操作的基本原則：（1）洗滌劑雜質(zhì)去除率盡可能高，而不溶解包涵體中的目的蛋白；（2）分離包涵體時(shí)的離心力和離心時(shí)間盡可能滿足將包涵體與細(xì)胞碎片等雜質(zhì)很

14、好地分離。3、 目的蛋白的變性（抽提）研究：（1）變性劑及其濃度、用量的研究（2）變性操作時(shí)間和溫度研究（3）變性操作后的固液分離（離心力和離心時(shí)間）研究。4、 變性蛋白的純化研究：對(duì)包涵體抽提物可采取柱層析、凝膠過(guò)濾、離子交換層析和HPLC等方法進(jìn)一步分離純化。 Ps：重組蛋白的純化可以在包涵體溶解后進(jìn)行，也可以在復(fù)性后進(jìn)行，因此還應(yīng)進(jìn)行兩種方法的對(duì)比研究。5、 變性蛋白的復(fù)性研究：考察比較不同復(fù)性方法對(duì)目的蛋白復(fù)性效果的影響。主要考察其對(duì)蛋白回收率和復(fù)性程度的影響；另外，還需要考察復(fù)性時(shí)間的影響因素，如蛋白質(zhì)濃度、雜質(zhì)的含量、重折疊速度、氧化還原劑的用量和比例、重折疊配體的摻入、溫度、pH

15、值和離子強(qiáng)度等對(duì)復(fù)性效果的影響。6、 目的蛋白的高度純化研究：對(duì)經(jīng)復(fù)性后得到的目的蛋白進(jìn)行進(jìn)一步高度純化，以滿足不同的需要。八、基因工程藥物質(zhì)量控制的必要性及其質(zhì)控要點(diǎn)，基因工程藥物最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制特點(diǎn)及要點(diǎn)。必要性：1、 它是利用獲得細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)來(lái)制備產(chǎn)品，所獲得的蛋白質(zhì)往往分子量較大，并且具復(fù)雜的表達(dá)結(jié)構(gòu)；2、 許多基因工程藥物都是參與人體一些生理功能精密的蛋白質(zhì)，在極微量的差別的情況下產(chǎn)生顯著效應(yīng)；3、 宿主細(xì)胞中表達(dá)的外源基因在翻譯、轉(zhuǎn)錄及工藝放大的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生變化。質(zhì)控要點(diǎn)：1、 原料的質(zhì)量控制。確保編碼藥品的DNA序列正確性，重組微生物來(lái)自單一克隆，所用的質(zhì)粒純而穩(wěn)定。2、生

16、產(chǎn)的質(zhì)量控制。原始細(xì)胞庫(kù)生產(chǎn)、有限代次的生產(chǎn)、連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)、分離純化。3、最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制。產(chǎn)品的鑒別、純度分析、生物活性測(cè)定、安全性穩(wěn)定性考察和產(chǎn)品一致性的保證。質(zhì)控特點(diǎn)：任何單一的分析方法都無(wú)法滿足對(duì)該類(lèi)產(chǎn)品的檢測(cè)要求，它需要綜合生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等多門(mén)學(xué)科的理論和技術(shù)，才能切實(shí)保證基因工程產(chǎn)品的安全有效。第四章 酶工程制藥一、酶工程制藥的主要內(nèi)容1、藥用酶的生產(chǎn)：發(fā)酵生產(chǎn)，分離純化，分子修飾2、酶法制藥：酶催化反應(yīng)、固定化、非水相催化二、酶法制藥研究中涉及到的研究項(xiàng)目及內(nèi)容1、 原料的選擇及反應(yīng)的研究。 2、酶或酶系的選擇研究。 3、酶催化反應(yīng)最佳工藝條

17、件研究。 4、產(chǎn)物的分離純化研究第五章 植物細(xì)胞培養(yǎng)制藥一、植物細(xì)胞的生理特性，植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本流程和技術(shù)。生理特性：1、 比微生物細(xì)胞大得多；2、具有群體生長(zhǎng)特性，單細(xì)胞難以生長(zhǎng)，繁殖；3、對(duì)剪切力敏感，抗張力強(qiáng)度大，抗剪切力小；4、生長(zhǎng)速度慢，操作周期長(zhǎng)；5、容易結(jié)成細(xì)胞團(tuán)；6、大多植物細(xì)胞的生長(zhǎng)及次級(jí)代謝物的生產(chǎn)都要求一定的光照和時(shí)間，且不同波長(zhǎng)的光具有不同的效果?；玖鞒蹋?、外植體的獲得及預(yù)處理； 2、獲得懸浮細(xì)胞株 3、懸浮細(xì)胞株篩選 4、植物細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)； 5、大規(guī)模培養(yǎng)基本技術(shù)：1、植物細(xì)胞的獲得技術(shù)； 2、植物細(xì)胞的選育與改良技術(shù)； 3、植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)； 4、植物細(xì)胞培

18、養(yǎng)次級(jí)代謝產(chǎn)物技術(shù)； 5、植物細(xì)胞培養(yǎng)生物轉(zhuǎn)化技術(shù)二、植物細(xì)胞獲取的主要方法及其操作過(guò)程，植物細(xì)胞培養(yǎng)制藥的培養(yǎng)方法。愈傷組織培養(yǎng)的基本過(guò)程和操作。主要方法：從外植體直接分離，愈傷組織誘導(dǎo)獲取，原生質(zhì)體再生操作過(guò)程：1、 外植體的選擇與預(yù)處理。選擇時(shí)需綜合考慮的因素有外植體大小、同一植物不同部位的選取、不同物種的選擇、植物年齡以及取材季節(jié)。注意滅菌劑和滅菌時(shí)間選擇以及滅菌后無(wú)菌水洗。2、 直接分離：（1） 機(jī)械搗碎法：先將外植體輕輕搗碎，然后通過(guò)過(guò)濾和離心分離細(xì)胞；（2）酶解法：利用果膠酶，纖維素酶等處理，分離出具有代謝活性的細(xì)胞。3、 愈傷組織誘導(dǎo)法：（1）誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制備 （2）外植體植入

19、誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)生成愈傷組織 （3）愈傷組織繼代培養(yǎng) （4）從愈傷組織分離得到植物細(xì)胞。4、 原生質(zhì)體再生法（不要求）。培養(yǎng)方法：按培養(yǎng)對(duì)象分：愈傷組織培養(yǎng)，原生質(zhì)體培養(yǎng)，小細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)按培養(yǎng)基類(lèi)型分：固體培養(yǎng)，液體培養(yǎng)按培養(yǎng)方式：懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，固定化細(xì)胞培養(yǎng)基本操作和過(guò)程：1、 愈傷組織培養(yǎng)基的配制。 配制液體培養(yǎng)基 配制含有各種所需營(yíng)養(yǎng)成分的液體培養(yǎng)基，其濃度是所需培養(yǎng)基濃度的2倍。 瓊脂的配制與熔化 按照1.5%瓊脂的比例稱(chēng)取瓊脂，加入所需培養(yǎng)基體積一半的蒸餾水，放置一段時(shí)間，待瓊脂吸水膨脹后加熱使瓊脂完全熔化。 分裝 將上述熔化的瓊脂趁熱與液體培養(yǎng)基按照1:1的比例混合均勻，用稀酸或稀堿

20、調(diào)節(jié)至所需的pH值，分裝于培養(yǎng)皿、三角瓶或試管等培養(yǎng)容器中。 滅菌 在120的條件下，滅菌1520min，冷卻后備用。2、愈傷組織的選擇。通常在愈傷組織誘導(dǎo)的10-15d左右進(jìn)行繼代培養(yǎng)，在繼代培養(yǎng)的第10-15d進(jìn)行新一輪的繼代培養(yǎng)。3、接種。首先在無(wú)菌條件下，用鑷子或小刀將選擇好的愈傷組織塊分割成若干小塊，剔除附著在愈傷組織塊上的原有培養(yǎng)基，必要時(shí)可以用無(wú)菌水清洗幾次，然后在無(wú)菌條件下將處理好的愈傷組織小塊轉(zhuǎn)移到含有新鮮固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。4、培養(yǎng)。將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中，在一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)一定時(shí)間后，適時(shí)地進(jìn)行下一輪的繼代培養(yǎng)或接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。例：從愈傷組織獲

21、得植物細(xì)胞有哪兩種操作方式？將愈傷組織接種到新鮮的固體培養(yǎng)基中是怎樣操作的？（10分）答：方法1：對(duì)誘導(dǎo)獲得的愈傷組織用鑷子或小刀分割得到植物小細(xì)胞團(tuán)；方法2：將愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中，加入經(jīng)過(guò)殺菌處理的玻璃珠進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，使愈傷組織分散成為小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞，然后用適當(dāng)孔徑的不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾，除去大細(xì)胞團(tuán)和殘?jiān)?，得到一定體積的小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞懸浮液。 操作：在無(wú)菌條件下，首先用鑷子或小刀將選擇好的愈傷組織塊分割成若干小塊，將原培養(yǎng)基清洗干凈，然后將處理好的愈傷組織小塊轉(zhuǎn)移到含有新鮮固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿中。三、植物細(xì)胞培養(yǎng)中提高植物次生代謝物生產(chǎn)的途徑。（具例見(jiàn)教材）1、添加誘導(dǎo)因子：引起植物

22、過(guò)敏反應(yīng)，誘導(dǎo)植物特定基因表達(dá)，進(jìn)而激活特定次生代謝途徑，積累特定的目的次生代謝物，具有種屬專(zhuān)一性；2、前體飼喂：在植物細(xì)胞培養(yǎng)中加入次生代謝物合成的前體物質(zhì)； 3、兩相法培養(yǎng)：細(xì)胞在其中一相中生長(zhǎng)并合成次生代謝物，而這些產(chǎn)物又通過(guò)主動(dòng)或被動(dòng)運(yùn)輸方式釋放到細(xì)胞外，并被另一相所吸收，達(dá)到富集產(chǎn)物的目的； 4、培養(yǎng)條件的控制：通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基、光照、溫度、通氣等條件的調(diào)控，使細(xì)胞次級(jí)產(chǎn)物分泌變多； 5、在培養(yǎng)基中添加代謝產(chǎn)物合成抑制劑； 6、其他，如選育高產(chǎn)細(xì)胞株，二步法培養(yǎng)，新型生物反應(yīng)器等。四、植物細(xì)胞培養(yǎng)次級(jí)代謝物生產(chǎn)的基本工藝過(guò)程，過(guò)程涉及到哪些研究?jī)?nèi)容？如何進(jìn)行研究？工藝過(guò)程：1、 外植體

23、的選擇與處理； 2、植物細(xì)胞的獲得； 3、植物細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)； 4、植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)； 5、次級(jí)代謝物的分離純化研究的內(nèi)容：1、外植體的選擇和處理研究； 2、愈傷組織誘導(dǎo)； 3、植物細(xì)胞的誘變、篩選； 4、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的研究； 5、提取分離與純化方法研究五、植物細(xì)胞培養(yǎng)生物轉(zhuǎn)化制藥的基本工藝過(guò)程，過(guò)程涉及到哪些研究?jī)?nèi)容？如何進(jìn)行研究？生物轉(zhuǎn)化基本過(guò)程：1. 轉(zhuǎn)化反應(yīng)植物細(xì)胞篩選 2.外植體的選擇和處理 3.培養(yǎng)基的選擇和配置 4.細(xì)胞的獲取 5.穩(wěn)定細(xì)胞系的建立 6.加入底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化 7.轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的提取分離 8.產(chǎn)物檢測(cè)研究?jī)?nèi)容：1.轉(zhuǎn)化持續(xù)時(shí)間的研究 2.底物濃度的研究 3.不同細(xì)胞密度

24、的研究 4.培養(yǎng)體系pH值的研究 5.溫度光照的研究六、植物細(xì)胞培養(yǎng)代謝物生產(chǎn)制藥和生物轉(zhuǎn)化制藥其過(guò)程的影響因素。植物細(xì)胞培養(yǎng)代謝物影響因素：1.外植體的選擇。不同外植體的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物，其最大次級(jí)代謝產(chǎn)物的累計(jì)時(shí)間各異。2.培養(yǎng)條件的影響 培養(yǎng)環(huán)境的內(nèi)在因素： a。接種和誘導(dǎo) b?；九囵B(yǎng)基的組成： 1.磷 2.氮 3.碳源 4.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 5.O2和pH值 6.滲出物 兩步培養(yǎng)法 培養(yǎng)環(huán)境的外部因素： 溫度 2.攪拌頻率 3.培養(yǎng)容器的影響 4.光的影響生物轉(zhuǎn)化制藥其過(guò)程的影響：1、植物細(xì)胞的影響 1.轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的影響 2.細(xì)胞系的影響 3.細(xì)胞生長(zhǎng)階段的影響2、外源底物的影響（1）外源

25、底物濃度的影響：外源底物對(duì)培養(yǎng)的植物細(xì)胞一般都是有毒性的（2）外源底物結(jié)構(gòu)的影響（3）外源底物添加方式的影響 不溶性的底物，先溶解后再加入；活用細(xì)粉末；用吐溫或環(huán)糊精來(lái)促溶3、培養(yǎng)條件的影響培養(yǎng)基的組成、植物激素、刺激劑、抑制劑以及pH值、溫度、光照等培養(yǎng)條件。第六章 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制藥一、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)，生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的種類(lèi)及其特點(diǎn)，生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的獲得，工程細(xì)胞庫(kù)的種類(lèi)及要求，細(xì)胞的冷凍保存與復(fù)蘇技術(shù)及其操作要領(lǐng)。生理特點(diǎn)：1、動(dòng)物細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng)； 2、細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象； 3、正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命有限； 4、對(duì)環(huán)境敏感； 5、對(duì)培養(yǎng)基要求高； 6、蛋白質(zhì)的合成

26、途徑和修飾功能與細(xì)菌不同。細(xì)胞種類(lèi)及特點(diǎn)：1、 原代細(xì)胞：增殖能力有限，需大量動(dòng)物。2、 二倍體細(xì)胞體：2n型染色體組，傳代壽命有限，具有明顯的貼壁依賴和接觸抑制特點(diǎn)，無(wú)致癌性。3、 轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：具有無(wú)限繁殖超額能力，倍增時(shí)間較短，對(duì)培養(yǎng)條件和生長(zhǎng)因子要求較低。4、 融合細(xì)胞系：雜交特性。5、 重組工程細(xì)胞系工程細(xì)胞庫(kù)的種類(lèi)及要求：1、 原始細(xì)胞庫(kù)（MCB）:儲(chǔ)存于MCB的細(xì)胞應(yīng)該是單一來(lái)源的均質(zhì)細(xì)胞，對(duì)二倍體細(xì)胞應(yīng)該是群體倍增水平盡可能低的細(xì)胞。儲(chǔ)存時(shí)需有該細(xì)胞的詳細(xì)檔案，包括該細(xì)胞系的歷史，和對(duì)各種有害因子的檢查結(jié)果。2、 生產(chǎn)用細(xì)胞（MWCB）儲(chǔ)存于MWCB的細(xì)胞應(yīng)該是從MCB來(lái)的，或從

27、單一安瓿來(lái)，或從多個(gè)安瓿在融化即刻混合在一起的然后經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增達(dá)一定數(shù)量后，再分裝儲(chǔ)存形成的細(xì)胞庫(kù)。該細(xì)胞庫(kù)同樣需要建檔案，而且需進(jìn)行無(wú)菌性的無(wú)細(xì)胞交叉污染的檢查。細(xì)胞的冷凍保存與復(fù)蘇技術(shù)及其操作要領(lǐng)：常用技術(shù)是液氮冷凍保存法，主要采用加入適量保護(hù)劑的緩慢冷凍法保存細(xì)胞。步驟：細(xì)胞懸液制備加保護(hù)劑分裝和封口液氮凍存。復(fù)蘇一般采用快速融化法，以保證細(xì)胞外結(jié)晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細(xì)胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細(xì)胞。二、動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的生長(zhǎng)與增殖過(guò)程，動(dòng)物細(xì)胞與微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞在培養(yǎng)上的區(qū)別，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的方法和操作方式及其特點(diǎn)。生長(zhǎng)與增殖過(guò)程：原代培養(yǎng)期傳代培養(yǎng)期衰退期。培養(yǎng)區(qū)別：1

28、、動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，且大多哺乳動(dòng)物細(xì)胞附著在固體或半固體的表面才能生長(zhǎng)；2、對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求嚴(yán)格，除氨基酸，維生素，鹽類(lèi)，葡萄糖或半乳糖外，還需要血清；3、動(dòng)物細(xì)胞對(duì)環(huán)境敏感，包括pH，溶氧，溫度，剪切應(yīng)力都比微生物有更嚴(yán)的要求，一般需嚴(yán)格地監(jiān)測(cè)和控制。培養(yǎng)方法及特點(diǎn)：1、 懸浮培養(yǎng)：適用于一切各類(lèi)的懸浮細(xì)胞和兼性貼壁細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)條件較均一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易擴(kuò)大規(guī)模培養(yǎng)。缺點(diǎn)：較難采用灌流培養(yǎng)，細(xì)胞密度一般較低（即不適于高密度培養(yǎng)）。2、 貼壁培養(yǎng)：適用于一切貼壁細(xì)胞和兼性貼壁細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：適用的細(xì)胞各類(lèi)廣，較易采用灌流培養(yǎng)，細(xì)胞密度高，缺點(diǎn)：操作比較麻煩，需要合適的貼附材料和足夠的

29、面積，培養(yǎng)條件不均一，傳質(zhì)和傳氧較差。3、 貼壁懸浮培養(yǎng)：將懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)兩者結(jié)合，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，主要方法有：微載體培養(yǎng)，包埋和微囊培養(yǎng)，結(jié)團(tuán)培養(yǎng)。操作方法及特點(diǎn)：1、 分批式操作：細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性加入反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)。2、 流加式操作：不斷加入營(yíng)養(yǎng)成分而不取出條件培養(yǎng)基（經(jīng)培養(yǎng)已經(jīng)含有細(xì)胞產(chǎn)物但不含細(xì)胞的培養(yǎng)基）。3、 半連續(xù)式操作：細(xì)胞和培養(yǎng)基加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中每隔一段時(shí)間取出部分培養(yǎng)物，補(bǔ)充同樣數(shù)量新鮮培養(yǎng)基，反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變。4、 連續(xù)式操作：連續(xù)地加入新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)等速地取出反應(yīng)器內(nèi)的培養(yǎng)液（連同細(xì)胞）。5、 灌流式操作：不斷取出部分條件培養(yǎng)基（

30、無(wú)細(xì)胞），補(bǔ)充等量新鮮培養(yǎng)基。三、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的主要影響因素及其不良因素的控制。主要影響因素：1.細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境（營(yíng)養(yǎng)條件、產(chǎn)物積累、pH、溫度和滲透壓） 2.乳酸和氨的毒性累積 3.必需營(yíng)養(yǎng)物的添加 4.對(duì)細(xì)胞的剪切作用不良因素解決手段：設(shè)計(jì)適應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基；控制營(yíng)養(yǎng)物的添加；減少產(chǎn)物消耗積累；剪切損害可通過(guò)反應(yīng)器的優(yōu)化被減少，另外在培養(yǎng)液中添加剪切抑制劑。四、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制藥的基本工藝過(guò)程。目前用哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白工業(yè)化過(guò)程的主要通用技術(shù)平臺(tái)及其特點(diǎn)。如何進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制藥的研究。動(dòng)物細(xì)胞（搗碎）組織碎片（酶處理）單個(gè)細(xì)胞離心收集細(xì)胞（營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)）培養(yǎng)瓶培養(yǎng)（酶）

31、消化處理接種擴(kuò)大培養(yǎng)種子細(xì)胞液氮保存取出細(xì)胞種子種子解凍復(fù)活培養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)接種大規(guī)模培養(yǎng)產(chǎn)物分離純化產(chǎn)品。技術(shù)平臺(tái)及特點(diǎn)：主要是以攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)（70以上）作為通用技術(shù)平臺(tái), 平臺(tái)工藝的特點(diǎn)是采用無(wú)血清培養(yǎng)（50以上）和成熟的流加和灌流工藝。懸浮培養(yǎng)工藝中影響細(xì)胞生產(chǎn)數(shù)量和質(zhì)量的因素,主要應(yīng)考慮細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境(營(yíng)養(yǎng)條件、產(chǎn)物積累、pH、溫度和滲透壓) ,終產(chǎn)物(乳酸和氨) 毒性累積和必需營(yíng)養(yǎng)物的添加等。設(shè)計(jì)適應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基,控制營(yíng)養(yǎng)物的添加,減少產(chǎn)物消耗積累是解決問(wèn)題的有效手段。 對(duì)于攪拌的剪切損害可通過(guò)反應(yīng)器的優(yōu)化被減少, 另外在培養(yǎng)液中添加剪切保護(hù)劑。貼壁細(xì)胞生產(chǎn)工藝,最佳的生物反應(yīng)器形式是攪拌式微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng),并可提供最有效的優(yōu)化工藝和最適宜的流加工藝設(shè)計(jì)。最佳的工藝設(shè)計(jì)是高密度連續(xù)灌流培養(yǎng)。 流加培養(yǎng)和灌流培養(yǎng)是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝中最常用的兩種操作方式。五、為什么要研究不同宿主菌對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響？是怎樣進(jìn)行研究的？ 由于不同載體提供的不同增強(qiáng)子和啟動(dòng)子都有自己特異的結(jié)合蛋白，而只有能為它們提供這些蛋白的宿主菌才能使目的基因得到更好的表達(dá)。此外，不同大腸桿菌的不同種和亞種所含有的宿主蛋白酶種類(lèi)和數(shù)量不同，對(duì)表達(dá)的產(chǎn)物會(huì)有不同程度的降解作用。故宿主