分子生物學(xué)課堂筆記

1、分子生物學(xué) 真核生物的基因1.真核生物基因組的一般特點    真核生物的基因組一般比較龐大，遠大于原核生物的基因組。    真核生物的DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，儲存于細胞核內(nèi)。    真核基因組存在著許多重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)可達幾百萬以上。    絕大多數(shù)真核生物編碼蛋白質(zhì)的基因為斷裂基因，即結(jié)構(gòu)基因是不連續(xù)排列的，中間由插入序列隔開。    真核生物基因組中不編碼的區(qū)域多于編碼區(qū)域。    真核生物不僅含有核內(nèi)染色體DNA，還有核外細胞器DNA、核外細胞器有線立體DNA和

2、葉綠體DNA。2.斷裂基因（不連續(xù)基因） interrupted or discontinuous genes    SV40A蛋白基因含有一段346NT的間隔區(qū)。    每個活性珠蛋白基因含有兩個間隔區(qū)。    卵清蛋白基因含有7個插入序列被分成八段。3.基因家族與基因簇 gene family & gene cluster    定義：真核生物基因組中許多來源相同，結(jié)構(gòu)相似，功能相關(guān)的基因在染色體上成串存在，這樣的一組基因稱為基因家族。多基因家族是真核生物基因組織的一個重要特征。   

3、; 多基因家族在基因組中的分布情況不同，有些基因成串排列集中在一條染色體上，集中成簇的一組基因形成基因簇。也稱串聯(lián)重復(fù)基因（見后）。如組蛋白基因, rRNA基因, tRNA基因等。而有些基因家族成員不集中排列，而是分散在基因組的不同部位。如干擾素，珠蛋白，生長激素，SOX基因家族。    在多基因家族中，有些成員不具有任何功能，這類基因叫假基因(pseudogene)。4.串聯(lián)重復(fù)基因特征：A. 各成員間有高度的序列一致性或完全相同。B. 拷貝數(shù)高，幾十個至幾百個。因其在細胞中的需要量很大。C. 非轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)短而一致。組蛋白基因    五種組蛋白基因彼

4、此靠近構(gòu)成一個重復(fù)單位。許多這樣的重復(fù)單位串聯(lián)在一起，構(gòu)成組蛋白基因簇。rRNA基因    原核生物有三種rRNA：5S，16S，23S    真核生物有四種rRNA：5.8S,18S,28S, 5S    主體rRNA：三種主體rRNA基因組成重復(fù)單位，轉(zhuǎn)錄出一個45SrRNA，經(jīng)轉(zhuǎn)錄后處理切除間隔區(qū)成為18S，5.8S，28S 三種rRNA。    核仁：核中rRNA基因大量地轉(zhuǎn)錄成RNA，由于其染色性質(zhì)與DNA不同，在光學(xué)顯微鏡下形成特殊的區(qū)域，這一結(jié)構(gòu)，稱為核仁（nucleole）。含有rDNA串聯(lián)重復(fù)單位

5、的染色體稱為核仁組織者（nucleoolar organizers）。tRNA基因    tRNA長約70-80bp，其基因約長140bp。TRNA也是串聯(lián)重復(fù)排列，但個重復(fù)單位中各個tRNA基因可以相同可以不相同。5.細胞器基因    真核生物細胞器中有兩類細胞器能夠攜帶遺傳物質(zhì)。    動物生殖細胞中只有卵子才有線立體基因，而精子缺乏。線立體DNA多為環(huán)狀非重復(fù)DNA序列。屬于核外DNA。    線粒體和葉綠體均編碼自身所需的某些蛋白質(zhì)以及tRNA和rRNA，其余均由核基因編碼。    細胞

6、器有自己的蛋白質(zhì)合成器。只有兩種rRNA。哺乳為12S和16S，酵母為18S 和21S（含有一內(nèi)含子）。tRNA比核內(nèi)編碼的 tRNA小。酵母DNA為84kb。其上面的基因有三個特點。    哺乳動物線立體DNA不同于酵母。人體線立體基因排列非常緊密。人類線立體DNA為16.569kb。含37個基因；13個蛋白質(zhì)基因；1個cytb 基因；2個ATP酶亞基基因；3個CO亞基基因（細胞色素氧化酶亞基）；7個NADH脫氫酶亞基基因；2個rRNA基因：12S rRNA、16S rRNA；22個tRNA基因。3.4 真核生物的染色體真核生物DNA復(fù)性動力學(xué)真核生物染色體上的單一序列和

7、重復(fù)序列以及衛(wèi)星DNA單一序列又稱非重復(fù)序列輕度重復(fù)序列中度重復(fù)序列高度重復(fù)序列衛(wèi)星DNA的等級結(jié)構(gòu)及其起源和進化染色質(zhì)和核小體 染色質(zhì) 核小體 著絲粒 端粒DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與翻譯 4.1 DNA復(fù)制一. DNA的半保留復(fù)制Watson &Crick 最早提出DNA 的半保留復(fù)制機制。即是：DNA分子的雙螺旋在復(fù)制時分開，各自作為新鏈合成時的模板，復(fù)制后，每一個新的雙鏈DNA 分子都是由一條親鏈和一條新合成的子鏈組成的。合成過程中親鏈和子鏈間嚴(yán)格的堿基配對是DNA復(fù)制的基礎(chǔ)。圖示DNA復(fù)制（Meselson-Stahl實驗Cscl超離心顯示不同比重DNA帶）二. 復(fù)制原點，方向和方式或

8、DNA復(fù)制是從特定的位點開始并按特定的方向進行實驗證明，DNA分子復(fù)制時不是隨機起始的，而是從特定的位點開始的，這一特定的位點叫做復(fù)制起始點或復(fù)制原點，常用ori 或o 表示。許多生物的復(fù)制點都是DNA呼吸作用強烈的區(qū)段， 即是經(jīng)常開放的區(qū)段（frequently opening region ）亦即富含A，T的區(qū)段。這一區(qū)段產(chǎn)生瞬時單鏈與SSB蛋白（single-stranded DNA binding protein）結(jié)合，對復(fù)制的起始十分重要。復(fù)制從特定的位置開始，大多數(shù)雙向進行，也有一些單向的或以不對稱的雙向方式進行。在復(fù)制原點雙鏈DNA解旋形成復(fù)制叉。在復(fù)制叉處，新合成的子鏈DNA以

9、各自的親鏈為模板，總是從5'-3'方向合成。復(fù)制叉是不對稱的，即兩條新合成的鏈中，一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成，叫前導(dǎo)鏈（leading strand ），另一條鏈?zhǔn)窃谀０錎NA指導(dǎo)下，通過一個叫DNA 引發(fā)酶的蛋白質(zhì)，在特定的間隔區(qū)先合成大約10個NT 的RNA引物為DNA聚合酶提供3OH，然后合成一個稱之為岡崎片段的不連續(xù)的DNA片段，再經(jīng)專門的DNA修復(fù)系統(tǒng)，去除RNA引物，再經(jīng)DNA連接酶通過磷酸二酯鍵將其連起來，完成該子鏈的合成，這一條鏈叫后隨鏈（lagging strand）。依據(jù)DNA合成的起始方式，復(fù)制分為兩種類型：復(fù)制叉式（包括復(fù)制）和滾環(huán)式復(fù)制又叫復(fù)制。三. DNA復(fù)制

10、的酶學(xué)是一個復(fù)雜的酶學(xué)過程， 需要30多種酶而后蛋白質(zhì)的參與，構(gòu)成復(fù)制體（replisome）1. DNA聚合酶及其聚合反應(yīng)DNA POL是指以脫氧核苷三磷酸為底物催化合成DNA的一類酶，其催化反應(yīng)為：DNApol.DNA-OHDNA-（pdN）n +n ppidNTP Mg 2+這一原理被應(yīng)用于現(xiàn)代技術(shù)中如PCR中的Tag酶作用機理。所有真核生物和原核生物都有幾種DNA聚合酶，這些聚合酶協(xié)同作用負責(zé)染色體DNA的復(fù)制，DNA分子的修復(fù)，核DNA的重組以及染色體外DNA的復(fù)制。原核生物有三種DNA聚合酶，即 Pol I， Pol II，Pol III，Pol III是DNA復(fù)制的主酶。真核生物

11、有五種DNA聚合酶，即，。，是復(fù)制主酶，是核DNA復(fù)制的重要酶。2. 脫氧核苷三磷酸前體的來源有兩個來源：廢物利用體內(nèi)核酸降解或直接來自培養(yǎng)基新合成途徑利用生物體的氨基酸，CO2，NH3和磷酸核糖焦磷酸合成核糖核苷單磷酸（NMP）核苷單磷酸激酶NMP + ATP NDP + ADP核糖核苷酸還原酶NDP dNDP脫掉核糖2上的氧核苷二磷酸激酶dNDP + ATP dNTP +ADP （dNTP：四種脫氧核糖核苷酸）所有生物的核酸鏈的合成都是按53方向進行的，無一例外。3. 三種DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)和功能4. DNA連接酶DNA Pol 雖能填充缺口，但不能使缺口接合，而連接酶則能完成接合任務(wù)。5

12、. 與DNA幾何性質(zhì)有關(guān)的酶螺旋酶（helicases） 又稱解旋酶，使雙鏈DNA 分離:C. 螺旋酶I，II，與產(chǎn)物單鏈DNA結(jié)合F. 螺旋酶III，催化雙鏈DNA 分離，與SSDNA結(jié)合蛋白質(zhì)配合。DNA旋轉(zhuǎn)酶（Eco拓撲異構(gòu)酶II）多數(shù)天然DNA具有負超螺旋，可變?yōu)榕轄顔捂溞问?，利于蛋白質(zhì)結(jié)合，并可緩解復(fù)制叉前移造成的抄纏現(xiàn)象，但當(dāng)5%的環(huán)行DNA雙鏈已經(jīng)復(fù)制時，原有的負超螺旋已被用盡，若復(fù)制叉再前移，就產(chǎn)生拓撲學(xué)問題，就需要拓撲異構(gòu)酶來解決。在Ecoli中，主要是DNA旋轉(zhuǎn)酶（Eco拓撲異構(gòu)酶II），他能產(chǎn)生負超螺旋并消除復(fù)制叉前移產(chǎn)生的正超螺旋。所以，如果加入幾種DNA螺旋酶的抑制劑

13、，如香豆霉素，新生霉素，萘啶酮酸等均能抑制細菌DNA的復(fù)制， P94 圖示復(fù)制叉前移的拓撲學(xué)問題。DNA復(fù)制的半不連續(xù)性1. 半不連續(xù)性復(fù)制的發(fā)現(xiàn)2. 引物和引發(fā)酶DNA復(fù)制過程中，復(fù)制叉是不對稱的。兩條新合成的鏈中，一條是連續(xù)合成的，叫前導(dǎo)鏈；另一條是在模板DNA指導(dǎo)下，通過一種叫DNA引發(fā)酶的蛋白質(zhì)，在特定的間隔區(qū)先合成大約10個核苷酸組成的RNA引物（RNA primer）為DNA聚合酶提供3-OH，然后合成稱為岡崎片段的不連續(xù)的DNA片段，最后由DNA修復(fù)系統(tǒng)去除RNA引物而代之以DNA，再由DNA連接酶通過35-磷酸二酯鍵將其連接起來，完成此子鏈的合成，這條子鏈叫后隨鏈。由于DNA聚

14、合酶在沒有引物情況下不能從頭合成DNA，必須有一條引物。研究發(fā)現(xiàn)的引物大多數(shù)為一段RNA，長度和序列隨基因組的種類而異，為1-10個核苷酸見表3 P98。該引物RNA與經(jīng)典的RNA（mRNA）不同，他們合成后不與模板分離，而是以氫鍵與模板結(jié)合。他可能由一種獨特的RNA聚合酶所合成，這種合成RNA引物的酶舊叫引發(fā)酶。那么，前導(dǎo)鏈?zhǔn)侨绾魏铣傻模咳N可能性：1）同后隨鏈一樣，由RNA引物提供3-OH；2）可能模板上的起始點產(chǎn)生缺口，暴露3-OH作引物；3）可能由后隨鏈提供3-OH。3. 前體片段的連接真核生物的DNA復(fù)制1 真核生物的復(fù)制原點，復(fù)制元和復(fù)制元族真核生物的DNA聚合酶活性比大腸桿菌低得

15、多，復(fù)制速度為500bp-5000bp/分（Ecoli為105bp/分）如按哺乳動物的DNA比細菌大約50倍，真核生物DNA復(fù)制時間就會是大腸桿菌的1000倍，即約一個月，而事實上，真核生物DNA復(fù)制時間一般為幾小時，這是因為通過從許多原點同時開始并雙向復(fù)制而實現(xiàn)的。放射形自顯影可見許多的復(fù)制泡。每一復(fù)制泡有固定的一點（復(fù)制原點），然后雙向伸展，與相酃的復(fù)制泡會合。這樣一段DNA 稱為復(fù)制單元，簡稱復(fù)制元（replicon）。而幾個復(fù)制元可組成復(fù)制元族，同一族內(nèi)的復(fù)制元基本同步。真核生物復(fù)制原點的DNA序列并無固定的模式，但大多包含一個富含AT的序列，可能還有一個特異性蛋白質(zhì)的結(jié)合位點。2 真

16、核生物的DNA pol 和引發(fā)酶primase與真核生物多起點復(fù)制相適應(yīng)的是，細胞中DNA聚合酶的分子數(shù)目多，在Ecoli中，POLIII只有10-20個分子，而哺乳動物細胞中DNA POL 有2000-60000個分子，DNA POL 與DNA引發(fā)酶結(jié)合很緊，是復(fù)制體系必需的復(fù)合物。實驗表明，在細胞DNA合成期（S期），DNA POL 含量劇增。協(xié)同的作用，負責(zé)線立體DNA的復(fù)制，含量變化不大，與損傷DNA修復(fù)有關(guān)。引發(fā)酶的作用：B. 是與引發(fā)酶復(fù)合物所必需的E. 其引物合成方式特別，陣發(fā)性合成，F(xiàn). 可利用rNTP和dNTP為合成前體。引物一般為6-15個NT。1 SV40以及其他真核生物

17、的DNA復(fù)制過程SV40所編碼的蛋白質(zhì)中，只有一個大T抗原參與其DNA復(fù)制，其余復(fù)制機制由寄主的蛋白質(zhì)構(gòu)成。大T抗原四聚體在復(fù)制原點有三個結(jié)合位點，同時還具有ATPase活性和螺旋酶活性。SV40的DNA復(fù)制有可能代表真核生物的DNA復(fù)制的主要過程：首先由一特異的蛋白質(zhì)識別復(fù)制原點并與之結(jié)合。再由螺旋酶促進負超螺旋狀的復(fù)制原點解鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白質(zhì)（SSB）維持解鏈區(qū)并以動態(tài)左右前移在由POL 和引發(fā)酶與原點上的特異蛋白質(zhì)相互作用，從而引發(fā)復(fù)制叉的先導(dǎo)鏈的合成；然后再印發(fā)另一先導(dǎo)鏈的合成隨著復(fù)制叉的前進，需要拓撲異構(gòu)酶解除復(fù)制叉前進造成的超纏現(xiàn)象。當(dāng)相酃的兩個復(fù)制元的相向的兩個復(fù)制叉結(jié)合時就

18、完成了這一段DNA的復(fù)制，可能并不存在固定的終止序列。而真核生物染色體末端DNA的復(fù)制卻不那么簡單。見后。2 真核生物染色體末端DNA的復(fù)制由于RNA引物的水解，兩個子代分子中各有一個5端缺少一段核苷酸，而沒有一個目前已知的DNA POL能填補。腺病毒DNA的5末端共價連接一個55kD的蛋白質(zhì)，即末端蛋白質(zhì)（Terminal Protein TP）,而正在復(fù)制的腺病毒新生的DNA 5端為80kD的蛋白質(zhì)，為末端蛋白質(zhì)前體（pTP），這一引發(fā)方式避免了線性DNA在復(fù)制結(jié)束后的5末端隱縮問題。真核生物同樣面臨線性DNA復(fù)制結(jié)束時產(chǎn)生的5末端隱縮問題。這個問題的解決取決于端粒的結(jié)構(gòu)和能夠識別和結(jié)合端

19、粒的蛋白和酶。四膜蟲端粒中有一種端粒酶（ ）能將其端粒結(jié)構(gòu)中單鏈尾巴5TTGGGG3延長，延長的部分仍是5TTGGGG3，這一富含G的序列總是突出12-16個NT。這種酶是一種核糖核蛋白，由RNA和蛋白質(zhì)組成。有人證明該酶中的RNA是富含G序列的模板，對拷貝出富含G序列所必需的部分為5CAAAACCCCAAAA3，此RNA可能還有其他作用，這單鏈尾巴可能彎轉(zhuǎn)成為引物復(fù)制5末端，另一可能是某種端粒蛋白結(jié)合末端的單鏈重復(fù)序列，并作為蛋白質(zhì)引物復(fù)制DNA地末端。復(fù)制的調(diào)控DNA復(fù)制是受調(diào)控的，細胞分裂時間因營養(yǎng)條件變化很大（21-70分鐘/Ecoli），而DNA復(fù)制時間為40分鐘左右，可用成熟前起始

20、加以解釋細胞分裂時間為21分鐘的DNA復(fù)制。DNA復(fù)制調(diào)控，可能涉及許多專一性的蛋白因子（Ecoli Dna A,SV40 大T抗原等）和至少一類RNA分子（RNA2，RNA1）。細胞中蛋白質(zhì)和DNA總量的比例也可能是一重要因素，因為氨基酸饑餓時會抑制蛋白質(zhì)合成和DNA復(fù)制起始。在此說明一下RNA2和RNA1：大腸桿菌質(zhì)粒Col E1的復(fù)制需要一種RNA引物，RNA POL從復(fù)制原點上游方向555bp處轉(zhuǎn)錄，這個轉(zhuǎn)錄物就是RNA2。 RNA2延伸至復(fù)制原點區(qū)域時，由RNAaseH 將RNA與DNA模板形成的雜合雙鏈中的RNA切斷，從而產(chǎn)生3-OH末端，然后，DNA POL以此引物合成DNA。

21、圖示P130。在ColE1復(fù)制原點上游方向445bp處（相當(dāng)于RNA2的第111個堿基位置），起始轉(zhuǎn)錄另一個RNA分子，即是RNA1，其轉(zhuǎn)錄方向與RNA2相反。這個反義的RNA1有111個堿基與RNA2的5末端互補，從而改變了RNA2的二級結(jié)構(gòu)使之不能為RNAaseH（識別雜交雙鏈但不識別二級結(jié)構(gòu)）所識別，于是，RNA2的轉(zhuǎn)錄能夠繼續(xù)進行，而不能在復(fù)制原點區(qū)域RNA。有些機理有待繼續(xù)探討。4.2 轉(zhuǎn)錄一 概述 三類RNA都必須以DNA模板，在依賴于DNA的RNA POL作用下合成，他包括RNA鏈的起始，延伸，終止等步驟，這一系列過程叫轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄是基因表達的第一步，也是最關(guān)鍵的一步。轉(zhuǎn)錄涉及兩個

22、方面一是RNA合成的酶學(xué)過程二是RNA合成的起始信號和終止，即DNA上的特定序列。DNA和RNA的堿基序列方向總是5'-3'。闡述幾個概念：對DNA總是講模板鏈，在轉(zhuǎn)錄時DNA兩條鏈有混亂不一。新文獻規(guī)定：把不作模板轉(zhuǎn)錄的鏈稱為有義鏈（sense）又稱編碼鏈（coding）,非模板鏈=RNA鏈=有義鏈而把作為模板轉(zhuǎn)錄的鏈稱反義鏈（antisense strand）或模板鏈,模板=反義鏈。對RNA，也容易將DNA序列直接與氨基酸的密碼子聯(lián)系起來：SSDNA phage 如X174，其SSDNA作為復(fù)制模板進入細胞后復(fù)制合成 互補DNA，后者（互補DNA）作為轉(zhuǎn)錄模板（即反義鏈）合

23、成RNA。即SSDNA=有義鏈=RNA序列=正鏈對于SSRNA病毒，若其基因組RNA能作為mRNA或與mRNA相同，則該RNA病毒為正鏈RNA病毒；若其RNA進入宿主需要進行RNA復(fù)制，再產(chǎn)生互補鏈作為mRNA，則這種RNA稱為負鏈RNA病毒。二 RNA合成的酶學(xué)1. RNA合成的基本特征1) RNA的前體是四種核糖核苷三磷酸（rNTP）：ATP， GTP， CTP，UTP2) RNA鏈的生長方向也是5 33) 核苷三磷加到新生鏈的3'，同時除去一分子焦磷酸而生成磷酸二酯鍵。4) 轉(zhuǎn)錄必須以一條DNA鏈為模板，按堿基互補進行轉(zhuǎn)錄。5) RNA POL能起始一條新鏈的合成，起始的核苷酸一

24、般是嘌呤核苷三磷酸（XTP）RNA合成含四步：RNA POL結(jié)合于DNA上的特定位點，起始，鏈的延長，鏈終止和釋放。2. E Coli 和 真核生物的RNA POL（自己看）三 控制轉(zhuǎn)錄起始的DNA序列操作子和啟動子結(jié)構(gòu)1. 操縱元（operon）及其結(jié)構(gòu)操縱元：包括結(jié)構(gòu)基因和控制區(qū)以及調(diào)節(jié)基因的整個核苷酸序列?？刂茀^(qū)為兩部分：1) 從結(jié)構(gòu)基因溯流而上的緊靠結(jié)構(gòu)基因的部分叫操作子（operator）（即結(jié)構(gòu)基因的5上游），好比電器開關(guān)，控制其后面的全部結(jié)構(gòu)基因的開閉。2) 從操作子逆行而上的就是另一控制區(qū)域，叫啟動子（promoter）對轉(zhuǎn)錄非常重要。2. 原核生物的啟動子1) Pribnow

25、 框：10bp處，是RNA POL 結(jié)合位點2) Sextama 框：35bp處，RNA pol 先結(jié)合與此處，再結(jié)合于10bp處。3) CAP位點 ：CAP為環(huán)腺苷酸受體蛋白（cyclic AMP receptor）。調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏蛋白與操縱子以及誘導(dǎo)物互作實現(xiàn)對基因轉(zhuǎn)錄的負調(diào)控；而葡萄糖的調(diào)控機理則為正調(diào)控。3. 真核生物的啟動子真核生物有三種RNA POL：POL I： 負責(zé)轉(zhuǎn)錄rRNA，只有一種啟動子。POL II：負責(zé)蛋白質(zhì)基因和部分snRNA基因的轉(zhuǎn)錄，啟動子最復(fù)雜。POL III：負責(zé)轉(zhuǎn)錄tRNA和5S rRNA，啟動子位于轉(zhuǎn)錄的DNA序列內(nèi)（內(nèi)部啟動子）。1) RNA PO

26、L I的啟動子2) RNA POL II 的啟動子結(jié)構(gòu)A. 帽子位點B. TATA框：C. CAAT框D. 增強子3) RNA POL III的下游啟動子第五章 基因工程 5.1 基因工程的四大要素及其實施要點1.工具酶1)限制性內(nèi)切酶2)連接酶3)修飾酶4)DNA聚合酶：A. DNA聚合酶I；B. Klenow fragmentC. T4 or T7 DNA polymeraseD. Taq DNA polymeraseE. RT: 依賴RNA的 DNA polymerase5)依賴于DNA的RNA聚合酶6)T4噬菌體多核苷酸激酶TK：磷酸化7)堿性磷酸酶:脫磷酸細菌堿性磷酸酶(B. Alk

27、aline Phosphatase)小牛腸堿性磷酸酶(Calf intestinal Phosphatase)2.目的基因的分離方法及其用途分離方法基因分離的物理化學(xué)方法鳥槍法cDNA文庫的建立與基因的分離直接從特定的mRNA中分離基因基因組文庫的建立和基因的分離從蛋白質(zhì)入手分離編碼此蛋白的基因基因的化學(xué)合成利用PCR or RT-PCR分離基因用途研究該基因的全貌與內(nèi)涵，如詳細分析其結(jié)構(gòu)，功能及其調(diào)控與正?；?qū)Ρ?，尋找異?；虻漠惓｜c，進而探索疾病發(fā)生的分子生物學(xué)機理及治療對策研究生物種系進化與相關(guān)同源性應(yīng)用某種基因的大量表達，生產(chǎn)所需要的蛋白質(zhì)或多肽改良某些目的基因，以改良品種建立基因療

28、法。選用某種正?；颍牖颊唧w內(nèi)，治療某些先天性遺傳疾病。3.基因工程載體一、定義二、載體具備3 的條件：三、載體的種類：質(zhì)粒載體細菌用的表達載體載體粘粒載體M13噬菌體載體真核細胞用載體人工染色體（YAC，8 BAC，9 PAC，10 MAC）4.受體細胞和重組基因的導(dǎo)入5.基因重組的方法與策略6.基因重組體的篩選5.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR第一節(jié) PCR基本原理和影響因素1983年美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，1985年公開報道，使人們能在試管內(nèi)以幾小時的反應(yīng)將DNA擴增109倍。1987年P(guān)

29、CR得到美國的專利權(quán)，PCR技術(shù)在生命科學(xué)中掀起了一場革命，并形成了巨大的市場，有人預(yù)言，本世紀(jì)末PCR產(chǎn)值可達到4x108美元。本章介紹PCR的原理、常用的各種PCR方法及主要應(yīng)用范圍。一、基本原理DNA在細胞中的復(fù)制是個比較復(fù)雜的過程。參與復(fù)制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA連接酶、DNA模板、由引發(fā)酶合成的RNA引物、核苷酸原料、無機離子、合適的pH、以及解開DNA的超螺旋及雙螺旋等結(jié)構(gòu)的若干酶與蛋白質(zhì)因子等。PCR是在試管中進行DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與體內(nèi)相似，不同之處是耐熱的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加熱(變性)、冷卻(退火、保溫(延伸)等改變

30、溫度的辦法使DNA得以復(fù)制，反復(fù)進行變性、退火、延伸循環(huán)，就可使DNA無限擴增。PCR的具體過程如下：將PCR反應(yīng)體系升溫至95左右，雙鏈的DNA模板就解開成兩條單鏈，此過程為變性。然后將溫度降至引物的Km值以下，3'端與5'端的引物各自與兩條單鏈DNA模板的互補區(qū)域結(jié)合，此過程稱為退火。當(dāng)將反應(yīng)體系的溫度升至70左右時，耐熱的Taq DNA聚合酶催化四種脫氧核糖核苷酸按照模板DNA的核苷酸序列的互補方式依次加至引物的3'端，形成新生的DNA鏈。每一次循環(huán)使反應(yīng)體系中的DNA分子數(shù)增加約一倍。理論上循環(huán)幾次，就增加為2n倍。當(dāng)經(jīng)30次循環(huán)后，DNA產(chǎn)量達230拷貝，約為

31、109個拷貝。PCR擴增過程見圖8-1。由于實際上擴增效率達不到2倍，因而應(yīng)為（1+R）n，R為擴增效率。二、參與PCR反應(yīng)體系的因素及其作用參與PCR反應(yīng)的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、緩沖液、Mg2+、三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)、反應(yīng)溫度與循環(huán)次數(shù)、PCR儀等?，F(xiàn)對它們的作用介紹如下：(一)模板核酸用于PCR的模板核酸可以是DNA，也可以是RNA。當(dāng)用RNA作模板時，首先要進行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，然后再進行正常的PCR循環(huán)。核酸模板來源廣泛，可以從培養(yǎng)細胞、細菌、病毒、組織、病理標(biāo)本、考古標(biāo)本等中提取。PCR反應(yīng)時加入的DNA模板量一般為100-100000拷貝，現(xiàn)在的

32、技術(shù)水平已能從單個細胞制備出相應(yīng)的cDNA文庫。DNA模板含量合適，可以減少PCR多次循環(huán)帶來的堿基錯配。通常模板DNA用線性DNA分子，若為環(huán)狀質(zhì)粒，最好先用酶將其切開成線狀分子，因為環(huán)狀DNA復(fù)性太快。(二)引物引物決定PCR擴增產(chǎn)物的特異性與長度。因此，引物設(shè)計決定PCR反應(yīng)的成敗。PCR反應(yīng)中有兩種引物，即5'端引物與3'端引物。5'端引物是指與模板5'端序列相同的寡核苷酸，3'端引物是指與模板3'端序列互補的寡核苷酸。對引物的基本要求有：引物的長度過短會影響PCR的特異性，要求有16-30bp，因為416=4.29x109，已大于哺乳動

33、物基因組3x109bp，保證了特異性結(jié)合；引物過長使延伸溫度超過Taq DNA聚合酶的最適溫度(74度)，亦會影響產(chǎn)物的特異性。G+C的含量一般為40-60。四種堿基應(yīng)隨機分布，不要有連續(xù)3個以上的相同嘌吟或嘧啶存在。尤其是引物3'端，不應(yīng)有連續(xù)3個G或c，否則會使引物與核酸的G或c富集區(qū)錯誤互補，而影響PCR的特異性。引物自身不應(yīng)存在互補序列而引起自身折疊，起碼引物自身連續(xù)互補堿基不能大于3bp。兩引物之間不應(yīng)互補，尤其是它們的3'端不應(yīng)互補。一對引物之間不應(yīng)多于4個連續(xù)堿基有互補性，以免產(chǎn)生引物二聚體。引物與非特異靶區(qū)之間的同源性不要超過70或有連續(xù)8個互補堿基同源，否則導(dǎo)

34、致非特異性擴增。引物3'端是引發(fā)延伸的點。因此不應(yīng)錯配。由于ATCG引起錯配有一定規(guī)律，以引物3'端A影響最大，因此，盡量避免在引物3'端第一位堿基是A。引物3'端也不要是編碼密碼子的第三個堿基，以免因為密碼子第3位簡并性而影響擴增特異性。引物5'端可以修飾，包括加酶切位點，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛等標(biāo)記，引入突變位點，引入啟動子序列，引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列等，引物的設(shè)計最好以電腦軟件進行指導(dǎo)。反應(yīng)體系中，引物濃度一般要求在O.1-0.5mol之間。濃度太高，容易生成引物二聚體，或非特異性產(chǎn)物。引物Tm值與退火溫度有關(guān)，計算公式為：Tm=4(G+C)

35、+2(A+T)。引物Tm值最好在55-80范圍，以接近72為最好。(三)耐熱的TaqDNA聚合酶1976年Chien分離出熱穩(wěn)定聚合酶，1986年Erlich分離并純化了適于PCR的Tq熱穩(wěn)定性聚合酶，為PCR成為實用技術(shù)奠定了基礎(chǔ)，現(xiàn)已用基因重組生產(chǎn)。日前可用于PCR的聚合酶有多種：有從水生棲熱菌中提取的Taq酶、從嗜熱棲熱苗中獲得的Taq酶、從Litoralis棲熱球菌中分離的VENT酶、及從酸熱浴硫化裂片苗中分離的Sac酶，而以Taq酶用得最廣泛。Taq DNA聚合酶分子量為94kD，75時酶比活性為150bs/酶分子，反應(yīng)溫度過高或過低均影響其延伸率，Taq蕾有很高的耐熱穩(wěn)定性。實驗表

36、明，在92.5、95、97.5時，其半衰期分別為40min、30min和5min。純化的Taq酶在體外無3'-5'外切酶活性，因而無校正閱讀功能，在擴增過程可引起錯配。錯配堿基的數(shù)量受溫度、Mg2+濃度和循環(huán)次數(shù)的影響。通常，30次循環(huán)Taq酶的錯配率約為0.25，高于Klenow酶的錯配率。Taq酶在每一次循環(huán)中產(chǎn)生的移碼突變率為1/30000，堿基替換率為1/8000。應(yīng)用低濃度的dNTP(各20molL)、1.5mmol/L的Mg2+濃度、高于55的復(fù)性溫度，可提高Taq酶的忠實性，此時的平均錯配率僅為5x10-6次/（核苷酸*循環(huán)）。Taq酶具有類似于末端轉(zhuǎn)移酶的TdT

37、的活性，可在新生成的雙鏈產(chǎn)物的3'端加上個堿基，尤其是dATP最容易加上。因此，欲將PCR產(chǎn)物克隆到載體上，可以用兩種處理辦法：一是構(gòu)建dT-載體；二是用Klenow酶將3'端的A去掉，即在PCR反應(yīng)后，先在99加熱10min滅活Taq酶，調(diào)整Mg2+濃度至5-10mmol/L，加入1-2U Klenow片段，室溫下作用15-20min，3'端的A即被切去，Taq酶還具有反轉(zhuǎn)錄活性。在2-3mmol/L Mg2+濃度下68時出現(xiàn)類似反轉(zhuǎn)錄酶的活性。若有Mg2+存在，則反轉(zhuǎn)錄活性更佳，利用這一活性，可直接用于RNA-PCR，尤其是短片段的擴增。以往用Taq酶進行PCR擴增

38、，一般只能擴增小于400bp的DNA片段，經(jīng)過對酶的結(jié)構(gòu)與功能的改造，以及PCR方法學(xué)的改進，現(xiàn)已能擴增20kb以上的DNA分于。Taq酶在PCR反應(yīng)中加入的量也很重要，太少當(dāng)然不好，太多一方面浪費，同時也導(dǎo)致非特異性擴增，通常每lOOl反應(yīng)液中含1-2.5U Taq酶為好。最好在0.5-5U范圍內(nèi)確定最佳酶濃度。另一個問題是，雖然Taq酶是熱穩(wěn)定性較好的工具酶，也應(yīng)注意在-20貯存。(四)緩沖液緩沖液提供PCR反應(yīng)合適的酸堿度與某些離子，常用10-50mmol/L。Tris-HCI(pH8.3-8.8)緩沖液。緩沖液中含有50mmol/L KCl有利于引物的退火。有人并加入小牛血清白蛋白(1

39、00g/L)或明膠(0.0)或Twen20(0.05-0.1)或二硫基蘇糖醇(DDT，5mmol/L)等，認為這些物質(zhì)可以保護Taq酶。(五)Mg2+Taq酶的活性需要Mg2+。Mg2+濃度過低，Taq酶活力顯暑降低；Mg2+濃度過高，又使酶催化非特異性擴增。Mg2+濃度還影響引物的退火、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度、引物二聚體的生成等。Taq酶的活性只與游離的Mg2+濃度有關(guān)，而PCR反應(yīng)體系中，dNTP、引物、DNA模板等中的所有磷酸基團均可與Mg2+結(jié)合而降低Mg2+的游離濃度。因此，Mg2+的總量應(yīng)比dNTP的濃度高0.2-0.25mmol/L。如果反應(yīng)體系中含有EDTA等螯合劑，也可結(jié)

40、合掉一部分Mg2+。為了獲得Mg2+的最佳濃度，可用下面的優(yōu)化法。首先在PCR緩沖液小不加入Mg2+，從配置的10mmol/L的Mg2+儲存液中取一定量加入到各反應(yīng)管中，開始以0.5mmol/L的濃度梯度遞增(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,5.0mmol/L)，由PCR反應(yīng)后的電泳結(jié)果可確定Mg2+大概濃度范圍，再在該濃度的上下以0.2mmol/L遞增與遞減幾個濃度來精確確定Mg2+最適濃度。(六)dNTPdNTP為PCR反應(yīng)的合成原料。每種dNTP濃度應(yīng)相等，通常的濃度范圍為20-200gmol/L，在此范圍內(nèi)，PCR產(chǎn)物的量、反應(yīng)的特異性與忠實性之間的平衡最佳。例如，當(dāng)每種dNT

41、P為20mol/L時，理論上可以產(chǎn)生2.6g的400bp的DNA。使四種dNTP的濃度保持在其Km值(10-15mol/L)以上，可保持堿基摻入的忠實性；若dNTP的濃度大于50mmol/L，則可抑制Taq酶的活性。(七)反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)1變性溫度與時間PCR反應(yīng)中變性這一步很重要，若不能使模板DNA和PCR產(chǎn)物完全變性，PCR反應(yīng)就不能成功，DNA分子中G+C含量愈多，要求的變性溫度愈高。太高的變性溫度和時間又會影響Taq酶的活性，通常的變性溫度和時間分別為95、30s，有時用97、15s。雖然DNA鏈在變性溫度時兩鏈分離只需幾秒鐘，但反應(yīng)管內(nèi)部達到所需溫度還需要一定的時間，團此要適當(dāng)延長

42、時間。為了保證模板DNA能徹底變性最好為7-10min，然后在以后的循環(huán)中，將變性步驟設(shè)為95/min。擴增100-300bp短片段時，還呵以用快速的兩步PCR法，即變性(94-97)、退火及延長(55-75)。為防止在變性溫度時反應(yīng)液的蒸發(fā)，可在反應(yīng)管內(nèi)加入1-2滴液體石蠟。2復(fù)性溫度和時間復(fù)性溫度決定PCR的特異性，合適的復(fù)性溫度應(yīng)低于引物Tm值的5。退火溫度過低，引起非特異性擴增；增高退火溫度，可提高擴增的特異性，因此要嚴(yán)格規(guī)定退火溫度。退火反應(yīng)時間一般為1min。在PCR開始的頭一次循環(huán)時，反應(yīng)從遠低于Tm值的溫度開溫，由于Taq酶在低溫時仍具有活性，這時就可能因引物與模板非特異性配對

43、面出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物或出現(xiàn)引物二聚體  然后在以后整個PCR反應(yīng)中，非特異性產(chǎn)物反復(fù)擴增，而使PCR嚴(yán)重失敗。為了盡量消除這種非特異性擴增，可以使用熱起動的方式，熱起動方法有幾種：一種方法是在PCR系統(tǒng)中加入抗Taq酶抗體?？贵w與Taq酶結(jié)合，使Taq酶活性受抑制。因此在開始時，雖然溫度低，引物可與與模板錯配，但因Taq酶沒有活性，不會引起非特異性擴增；當(dāng)進行熱變性時，抗體在高溫時失活，Taq酶被釋放，就可發(fā)揮作用，在以后的延伸步驟進行特異的DNA聚合反應(yīng)。另一種熱起動法是用石蠟將Taq酶與PCR反應(yīng)系統(tǒng)分隔，因此一開始在室溫條件下也沒有非特異性擴增。當(dāng)升溫到熱變性溫度下，石

44、蠟熔化，Taq酶與PCR反面系統(tǒng)混合，從而在以后的步驟中發(fā)揮作用。使用熱起動可以提高PCR擴增的特異性。3延伸溫度與時間延伸溫度一般為72左右，此時Taq酶活性為每秒鐘摻入核苷酸35-100個，2kb的片段用1min已足夠，若DNA片段較長，擴增時間可適當(dāng)延長。延伸時間過長又可引起非特異性擴增。4循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)主要取決于最初靶分子的濃度，例如在初始靶分子為3x105、1.5x104、1x103和50拷貝數(shù)時，循環(huán)數(shù)可分別為25-30、30-35、35-40從40-45。過多的循環(huán)次數(shù)會增加非特異性產(chǎn)物量及堿基錯配數(shù)。PCR反應(yīng)后期，擴增產(chǎn)物的增加并不成為指數(shù)方式，稱為平臺效應(yīng)。平臺效應(yīng)可能與

45、下列因素有關(guān)：dNTP與引物濃度降低，酶對模板的比例相對降低，多次循環(huán)后酶活力降低，產(chǎn)物濃度增高后變性不完全而影響引物延伸。(八)PCR儀有多種進口與國產(chǎn)PCR儀。儀器的升降溫方式可有氣體加溫、水加溫及電熱塊加溫等。溫度、循環(huán)次數(shù)及時間等參數(shù)現(xiàn)多用電腦控制?？筛鶕?jù)需要選擇儀器。由于PCR方法高度靈敏，少量的靶分子即可擴增至無限數(shù)。因此要防止PCR擴增產(chǎn)物污染環(huán)境而引起以后的PCR假陽性。為此，應(yīng)將PCR儀及PCR產(chǎn)物檢測等過程與標(biāo)本制備及PCR反應(yīng)管的制備盡量在空間分開，最好在不同的房間進行。通常可將實驗空間分為標(biāo)本處理區(qū)、反應(yīng)混合制備和PCR擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)等。第二節(jié) 常用的幾種PCR反應(yīng)

46、PCR問世后，由于其很高的實用性而被廣泛采用。而方法本身又在使用中不斷地得到創(chuàng)新與發(fā)展，形成了一系列的適用于不同目的的特殊方法?，F(xiàn)將常用的幾種介紹如下。一、反轉(zhuǎn)錄PCR(RTPCR)二、定量PCR三、堿基替代PCR四、彩色PCR五、重組PCR六、不對稱PCR七、膜結(jié)合PCR八、固著PCR九、原位PCR十、反向PCR第三節(jié) PCR在分子生物學(xué)中的應(yīng)用一、用PCR制備cDNA文庫與篩選二、PCR直接測序法三、PCR用于染色體區(qū)帶特異片段克?。ㄒ唬╇S機引物PCR（二）散在重復(fù)序列PCR四、檢測突變堿基五、用簡并引物法擴增未知序列六、用PCR標(biāo)記DNA探針七、PCR與新基因的尋找第四節(jié) PCR在臨床醫(yī)

47、學(xué)中的應(yīng)用一、病原體檢查二、遺傳病的基因診斷三、腫瘤的診斷、轉(zhuǎn)移確定四、PCR用于組織器官移植的配型選擇5.3 基因芯片分析技術(shù)一、基因芯片分析技術(shù)1  基因芯片的概念    基因芯片，亦指DNA微陣列，是將大量DNA片段有規(guī)則地固定在某種介質(zhì)上，從而檢測特定基因表達地一項技術(shù)。這項技術(shù)的基本原理是分子生物學(xué)中常用的雜交方法的擴展，其基本做法是將要檢測的樣品加以標(biāo)記，然后與做成的陣塊進行充分雜交，再加以洗脫后，用圖像顯示出結(jié)果。這里，在陣塊中排列的DNA片段應(yīng)是已知的序列。根據(jù)這種概念，我們可以看出，在這項技術(shù)中，有如下三點是非常關(guān)鍵的。  &

48、#160; 其一，要有大量已知序列和基因片段。隨著人類基固組計劃的實施，我們可以得到大量基因序列信息，可以將一個文庫的所有cDNA序列測到并加以記錄，從而可以將一個文庫排列成一個DNA陣列。因此，從理論上講，可以做成從微生物到人類各組織器官的文庫陣列。其二，從工藝的角度講，要求能夠?qū)⒉煌腄NA片段以很高的密度“點印”在普通載載玻片大小的介質(zhì)上，從而使得在很小的面積上可以排列成千上萬個基因而不致于相互混雜，這個過程要求相當(dāng)高水干的工藝技術(shù)。其三，要有種很好的檢測手段。目前看來，用不同的熒光標(biāo)記核酸來進行檢測是一種比較簡單，而且安全可靠的方法。同時，不同的熒光可以使得我們同時檢測幾種樣品。這樣，

49、對于差異顯示這類實驗來說，就顯得尤為簡便。    基因芯片一股可分為兩處，一種為“點印”陣列，一種為直接合成陣列?！包c印”陣列是將較大的片段（大于100bp）物理地固定在介質(zhì)上，而直接合成陣列則是直接在介質(zhì)上合成較短的片段。一般而言，DNA樣本都是收集在96孔或384孔板上，這些樣本可以是PCR產(chǎn)物，也可以是從質(zhì)粒上直接得到的片段等。然后用機械手將DNA通過特制的加樣頭進行點樣。點樣完成后，對介質(zhì)進行處理以使DNA能夠十分穩(wěn)定地附著在介質(zhì)上，同時還要使介質(zhì)盡量減少結(jié)合非特異性的探針。    2  基因芯片的操作過程 

50、60; 基因芯片制作從準(zhǔn)備探針(即擴增DNA片段)開始，經(jīng)過芯片加工、DNA陣列點印、芯片后處理及芯片質(zhì)量檢測等過程，其應(yīng)用包括RNA制備、標(biāo)記、雜交及成像分析。因此基因芯片的應(yīng)用包括了制作工藝過程和基因表達分析過程。2.1  準(zhǔn)備DNA    作為基因分析，DNA片段是最基本的材料，也是基因芯片制作的關(guān)鍵。對于不同的陣列，可以選擇不同的目的BNA。2.1.1  目的DNA的選擇    對于大規(guī)模地研究基因表達問題，需要分析每一個基因的表達。因此，選擇的目的 DNA必須能夠代表要研究的各個基因。對于整個基因組序列全

51、部已知的生物，最直接的方法是用PCR擴增基因組中每個已知的或預(yù)測的開放閱讀框架(open reading frame)，亦可以選擇自己感興趣的部分序列。    對于沒有測序，或只有部分測序的基因組，或者對于那些有大量內(nèi)含子的基因組，上述方法就不現(xiàn)實。在這種情況下，我們首先考慮采用表達序列標(biāo)記(EST)?？梢詫蝹€EST的cDNA克隆用作陣列DNA來源。對于還沒有基因組測序計劃或序列還未知的生物，可以利用DNA文庫作為DNA來源。當(dāng)然這種文庫最好是經(jīng)過歸整化處理，以減少不必要的冗余。    用作陣列的DNA可以呈雙鏈的，亦可以是單鏈的。但是其長度最好是小于

52、開放閱讀框架，或小于1 000bp的cDNA。這對于很多具有同源性的基因尤為重要。當(dāng)基團之間具有很高同源性時，最好選擇基因之間有差異的部分，這樣便可以提高基因之間的分辨度。所以，在考慮每個基因代表性的同時，應(yīng)充分考慮所研究問題的具體情況。2.1.2  PCR擴增    一般而言，100l PCR反應(yīng)體系得到的產(chǎn)物足以點印1000個基因芯片。PCR通常是在96孔PCR儀上進行，實際擴增的反應(yīng)條件要根據(jù)所用的模板從引物來確定。但要盡量減少PGR反應(yīng)體系中的組分，盡量只用模板、引物、核苷酸、鎂離子、標(biāo)準(zhǔn)緩沖液和酶。不要用甘油或明膠，它們往往會粘附在陣列塊上而影

53、響以后的點樣工作。2.1.3  點樣前DNA準(zhǔn)備    點樣以前，要將PCR產(chǎn)物清洗純化干凈，并且對DNA進行一些處理，一般用異丙醇沉淀PCR產(chǎn)物，以除去酶、離子及核苷酸等。沉淀后用70乙醇洗1次，再用95%乙醇洗1次，待完全干燥后，將所沉淀DNA重溶在3XSSC中，其濃度掌握在100ng/l 左右。由于處理的樣本量很大，一般直接在96孔板上操作，可選用能夠配置96孔板的離心機（如Savant Speed Vac Plus SC210A）。當(dāng)把DNA溶于1015l 3×SSC(pH7.0)中后，最好置于4至少12h。然后，將DNA溶液封存在 -

54、204。    當(dāng)然，純化DNA的方法多種多樣，使用者可以根據(jù)自己的情況選用。在此應(yīng)當(dāng)強調(diào)的是，在最后得到的DNA樣本中，應(yīng)盡量減少其它污染，盡量除去鹽類、去污劑、甘油、明膠以及樹脂顆粒等。具體實踐中，應(yīng)當(dāng)用小規(guī)模DNA樣品進行點樣測試待確定效果后，再大規(guī)模制作。2.2  準(zhǔn)備載物片    載物片是要將DNA點上去的支撐物，有不同的材料，通常用載玻片。DNA并不能直接固定在玻璃表面，固此需要對玻璃表面進行處理。有很多方法可以處理玻璃表面，但是我們認為用多聚-L-賴氨酸比較簡單可靠    首先充分清洗載玻片，用25X

55、NaOH溶液200ml加300mi 95乙醇配成500ml堿性清洗液，將載玻片徹底浸泡在清洗液中2h，再用清水沖洗5遍井將載玻片泡在水中。接下來就是用多聚-L-賴氨酸溶液浸泡，從而使多聚賴氨酸均勻涂包在玻璃表面，形成一種多聚-L-賴氨酸涂面。具體做法是配成350mI多聚-L-賴氨酸浸泡液，將洗凈的載玻片直接浸泡，浸泡期間保持慢速搖晃，Ih后取出并在水中浸泡清洗，最后干燥。一般將涂好的載玻片用錫箔紙包好，室溫放置1個月，進行熟化，以使表面保持充分的疏水性。這對于以后點DNA樣品是十分重要的。2.3  基因芯片的點印    點印DNA用機械手。將一組處理好的

56、載玻片固定在一個平臺上，將DNA樣品(溶在3XSSC中)裝在96孔或384孔的平板中，并將平板放在支架上。機械手將一組特制的點樣吸頭插入對應(yīng)的DNA平板孔中，讓每個吸頭充上約1l的DNA溶液。然后機械手輕輕地將吸頭移向載玻片，將DNA樣品完全一致地點到多聚-L-賴氨酸包被的載玻片面上每個載玻片上大約點<0.5l的DNA溶液，故理論上一次可以點印2 000個載玻片。待這一組DNA樣品點印完成，機械手清洗點樣吸頭，開始第二批樣品的點印。點樣的質(zhì)量要表現(xiàn)在點與點的距離，這取決于點樣吸頭的尖銳度與多聚-L-賴氨酸表面的疏水性。般情況下兩個點中央間距為100m，點間空100m。如果點間空為200m

57、，就可以把整個酵母基因組點印在1.8cm2大的面積上；如果點間空為100m，可以把人類75 000個基因全部點在一張254cmX762cm的普通載玻片上。目前，每個點樣循環(huán)持續(xù)大約為2rmin，包括清洗、干燥、加樣和點樣，一般點110張片子。如果增加點樣吸頭數(shù)，可以縮短點樣時間。如將點樣吸頭增加到32個，則完成110個載玻片的所有人類基因點樣工作約需2天時間。2.4  基因芯片的后加工處理    當(dāng)一個基因芯片點成之后，需要對其進行進一步的加工處理，以便能夠用于以后的雜交實驗。通常進行四步處理，即重新水合化及快速干燥、UV-交聯(lián)、封閉及變性。2.4.1&

58、#160; 重新水合化    通常點樣過程并不能保證DNA在點中均勻一致。為使DNA在所有點中都分布均勻需要對之進行重新水和化并進行快速干燥。這一過程要求技術(shù)條件很高。當(dāng)重新水合化不充分時，大小不規(guī)則的點會影響以后的雜交與分析結(jié)果。但當(dāng)過度水合化時，點與點之間可能會產(chǎn)生融合。因此，要確定一個十分準(zhǔn)確的水合條件，一般用蒸汽熏潤，其時間、溫度需要摸索。2.4.2  UV交聯(lián)    當(dāng)重新水合化并立即干燥后，將載玻片放在UV射線下照射，這樣可以使DNA交聯(lián)在載玻片上。這一過程對于DNA濃度低時尤為重要，可以增加可雜交DNA吸附到每

59、一個點上的量在UV交聯(lián)時，將載玻片有DNA點的面朝上，照射總能量強度為60mJ即可。2.4.3  封閉    封閉的主要目的是將游離賴氨酸基團加以修飾，以避免這些基團與以后被標(biāo)記的DNA結(jié)合。如果不對載玻片封閉，那么，將來雜交后就會產(chǎn)生無法分清的非特異雜交斑而且還會產(chǎn)生過多的背景。一般的封閉辦法是用琥珀酸酐進行?；?，將賴氨酸的氨基轉(zhuǎn)化成酰氨基，使之形成負電荷表面，從而減小與DNA的非特異結(jié)合這一過程一般在15min內(nèi)結(jié)束。2.4.4  變性處理    當(dāng)封閉過程完成后，要立即進行變性處理，即將整個載玻片立即浸入沸騰但不冒泡的水中，上下翻35次，停留2min，然后立即轉(zhuǎn)到95%的乙醇中，浸泡一會