CpG ODN增強(qiáng)乙肝疫苗免疫反應(yīng)的研究

1、CpG ODN增強(qiáng)乙肝疫苗免疫反應(yīng)的研究                作者：戴帆，董斌，郭曉磊，石碧珠，方麗娟，莫家琳，田素娟，孟民杰 【摘要】目的 研究人工合成的CpG ODN對(duì)乙肝表面抗原的免疫增強(qiáng)效應(yīng)，評(píng)價(jià)CpG ODN的佐劑效應(yīng)。方法 將不同劑量特定的CpG ODN與乙肝表面抗原聯(lián)合免疫小鼠，用ELISA檢測(cè)小鼠乙肝表面抗體的滴度。結(jié)果 CpG ODN聯(lián)合乙肝表面抗原免疫小鼠，在短期檢測(cè)中，高劑量組能較快的達(dá)到檢測(cè)閾，各劑量組間抗體滴度

2、檢測(cè)值差異有顯著性(P0.05)，在長(zhǎng)期檢測(cè)中，各劑量組間抗體滴度檢測(cè)值差異有顯著性(P0.05)，檢測(cè)值隨CpG劑量的增高而增大。結(jié)論 CpG ODN增強(qiáng)乙肝表面抗原的免疫反應(yīng)短期和長(zhǎng)期都具有劑量效應(yīng)。 【關(guān)鍵詞】   CpG ODN 乙肝表面抗原 免疫佐劑 體液免疫Abstract:Objective To investigate the effects of immunological enhancement of HBsAg with synthetic CpG oligodeoxynucleotides,evaluate the adjuvant effect of CpG

3、 ODN. Methods Mice were vaccinated with CpG oligodeoxynucledtides and HBsAg at different doses,and then titers of HBsAb in the blood serums of mice were detected with ELISA. Results CpG ODN and HBsAg immunize the BALb/c mice,the highdose group could be detected quickly in shot term,the levels of ant

4、ibodies in groups which use different doses of CpG ODN and HBsAg were different in statics(P0.05),in long term the levels of antibodies in groups which use different doses of CpG ODN and HBsAg were different in statics(P0.05),the levels of antibodies were corresponded with the levels of CpG ODN (P0.

5、05).Conclusion The immunological effect of HBsAg was enhanced with CpG ODN as adjuvant in short and long terms.Key words:CpG ODN; HBsAg; immunoadjuvant; humoral immunityCpG基序是一種具有非特異性免疫刺激能力的DNA序列，為非甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸重復(fù)序列。CpG ODN (unmethylated CpG motifbased oligodeoxynucleotide)是人工合成的含未甲基化CpG基序的寡核苷酸序列。C

6、pG ODN可刺激人類和多種動(dòng)物產(chǎn)生 自然 免疫和獲得性免疫，主要通過TLR9信號(hào)系統(tǒng)活化免疫系統(tǒng)，最終促使多種免疫細(xì)胞的成熟分化和增殖，包括B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞。CpG ODN能快速活化T、B細(xì)胞，誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)并能促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞的增生和成熟?，F(xiàn)階段我國(guó)對(duì)乙型肝炎的預(yù)防主要是通過注射乙型肝炎疫苗，但接種免疫過程中和接種免疫后會(huì)出現(xiàn)免疫較弱和不免疫現(xiàn)象2,3。所以，選擇一種安全有效的免疫佐劑是增強(qiáng)免疫效果的有效途徑。本文通過測(cè)定不同時(shí)間段的小鼠注射CpG ODN和乙肝表面抗原后的抗體滴度，評(píng)價(jià)CpG ODN作為免疫佐劑增強(qiáng)乙肝疫苗的免疫效果。

7、1 材料與方法 1.1 材料1.2 動(dòng)物分組及免疫方案1.3 乙肝表面抗原檢測(cè)1 000倍稀釋的HRP標(biāo)記的乙肝表面抗原，37孵育40 min。PBS洗滌5次，每孔加入100 L TMB底物(含0.1 mg/mL 3355四甲基聯(lián)苯胺的磷酸鹽檸檬酸緩沖液，pH 5.4，用前加5 mL 30% H2O2 10 mL)，37 孵育1 h。每孔加入100 L H2SO2(0.2 mol/L)終止顯色反應(yīng)。BioRad 680 測(cè)定A450/630讀數(shù)。1.4 學(xué)分析SPSS統(tǒng)計(jì)，采用重復(fù)測(cè)量方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P0.05為差異有顯著性。 2 結(jié) 果 2.1 小鼠免疫后728 d外周血中乙肝表面抗

8、體的平均滴度變化乙肝表面抗原單用組的抗體在717 d時(shí)間段內(nèi)檢測(cè)不到，乙肝表面抗原和低劑量CpG ODN聯(lián)合免疫的抗體在第14天檢測(cè)到，乙肝表面抗原和中劑量CpG ODN聯(lián)合免疫組的抗體在第10天檢測(cè)到，乙肝表面抗原和高劑量CpG ODN聯(lián)合免疫的抗體出現(xiàn)時(shí)間較早，在第7天即可檢測(cè)到。在第1428天的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，乙肝表面抗原和高劑量CpG ODN聯(lián)合免疫組的抗體滴度均顯著高于乙肝表面抗原和中劑量CpG ODN聯(lián)合免疫組、乙肝表面抗原和低劑量CpG ODN聯(lián)合免疫組(P0.05);在第14、17、21天時(shí)間點(diǎn)上，乙肝表面抗原和中劑量CpG ODN聯(lián)合免疫組、乙肝表面抗原和低劑量CpG ODN聯(lián)

9、合免疫組之間差異無顯著性(P0.05)，在第24、28天時(shí)間點(diǎn)上，兩組差異有顯著性 (P0.05);在第21、24、28天時(shí)間點(diǎn)上，乙肝表面抗原和中劑量CpG ODN聯(lián)合免疫組、乙肝表面抗原和低劑量CpG ODN聯(lián)合免疫組的抗體滴度均顯著高于乙肝表面抗原單用組(P0.05)。見1和表1。表1 免疫728 d HBsAb滴度對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)         2.2 小鼠免疫后38周外周血中乙肝表面抗體的平均滴度變化在第38周時(shí)間內(nèi)，第4周乙肝表面抗原和高劑量CpG ODN聯(lián)合免疫組、疫苗和中劑量CpG ODN聯(lián)合免疫組之

10、間的抗體滴度差異有顯著性(P0.05);在其他時(shí)間點(diǎn)上，乙肝表面抗原和高劑量CpG ODN聯(lián)合免疫組的抗體滴度與其他組別差異均有非常顯著性(P0.01)，并持續(xù)快速升高。乙肝表面抗原和中劑量CpG ODN聯(lián)合免疫組、乙肝表面抗原和低劑量CpG ODN聯(lián)合免疫組的抗體滴度從第3周之后均逐漸升高，在第3、4、5、6周時(shí)間點(diǎn)上，只有第4周兩組之間差異有顯著性 (P0.05)，其他時(shí)間點(diǎn)差異均無顯著性 (P0.05);到第7、8周時(shí)兩組差異有顯著性(P0.05)。對(duì)于乙肝表面抗原單用組，雖然抗體滴度有逐漸升高的趨勢(shì)，但卻一直處于比較低的水平，除了第4周與乙肝表面抗原和低劑量CpG ODN聯(lián)合免疫組之間

11、的抗體滴度差異無顯著性外(P0.05)，其他時(shí)間點(diǎn)上與其他各組差異均有顯著性(P0.05)。見2和表2。表2 免疫38周HBsAb滴度對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù) 3 討 論 對(duì)于CpG ODN的免疫刺激作用人們已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究。在方面，人們較為關(guān)注其安全、有效的佐劑特性。因?yàn)镃pG ODN能同時(shí)增強(qiáng)抗原特異性體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，尤其對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答具有更突出的增強(qiáng)作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),應(yīng)用CpG ODN作為乙肝表面抗原的佐劑，能較早較快地刺激機(jī)體產(chǎn)生乙肝表面抗體，CpG ODN作為佐劑使用增強(qiáng)乙肝表面抗原的免疫效應(yīng)，CpG ODN的使用量在實(shí)驗(yàn)的劑量范圍內(nèi)具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，高劑量的CpG ODN

12、的使用對(duì)增強(qiáng)乙肝表面抗原的免疫效應(yīng)效果更早更好。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)觀察來看，單純的乙肝表面抗原抗原性是較弱的，搭配佐劑使用，才能有效地提高乙肝表面抗原的免疫原性，提高乙肝表面抗原的免疫效果。實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，增強(qiáng)乙肝疫苗抗原抗體反應(yīng)是顯著的，并且動(dòng)物也無逆毛、腹瀉、發(fā)熱或其他中毒現(xiàn)象等任何異常，表明CpG ODN的使用是安全可靠的。CpG ODN的作用是通過有Toll樣受體家族的細(xì)胞，主要是TLR9受體識(shí)別CpG的基序，從而通過若干信號(hào)傳遞途徑活化轉(zhuǎn)錄因子，啟動(dòng)相關(guān)細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄。本實(shí)驗(yàn)所用的CpG ODN是將60 bp磷酸二脂修飾的ODN與pUC18載體體外連接構(gòu)建的重組質(zhì)粒pUC18ODNs，更

13、真實(shí)地模擬了天然的包含CpG基序的非甲基化的ODN。在免疫過程中，CpG ODN以模擬細(xì)菌感染的方式激活了細(xì)胞經(jīng)由TLR9通道的固有免疫，由于CpG ODN僅僅是一段DNA序列，在激活免疫的同時(shí)不具有感染性，小鼠未發(fā)生任何炎性反應(yīng)7,8。同時(shí)，CpG ODN激活了體內(nèi)的免疫細(xì)胞，調(diào)動(dòng)了免疫系統(tǒng)，使乙肝疫苗能夠較早較快的產(chǎn)生免疫反應(yīng)7,8。由于CpG ODN的免疫刺激作用，小鼠的機(jī)體可以較長(zhǎng)時(shí)間的處于免疫活化狀態(tài)，免疫細(xì)胞免疫活性高，乙肝表面抗體得以長(zhǎng)期高水平的經(jīng)由B細(xì)胞分泌7,8。在有的實(shí)驗(yàn)中，大量的細(xì)菌DNA產(chǎn)生抗雙鏈DNA的自身抗體，加重小鼠的自身免疫性疾病;在本實(shí)驗(yàn)中使用CpG ODN，

14、乙肝表面抗體產(chǎn)生早，滴度高，持續(xù)久，并且安全可靠。在應(yīng)用CpG ODN作為乙肝疫苗佐劑的試驗(yàn)中，首次和第2次免疫后抗體水平甚至可以提高1345倍;同時(shí)，由于CpG對(duì)CD8+T細(xì)胞刺激作用，誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞在細(xì)胞免疫作用殺傷腫瘤以及 治療 胞內(nèi)感染也具有很好的應(yīng)用前景10。但是對(duì)長(zhǎng)期性觀察的缺失，還不能夠全面反映CpG ODN的作用效果，長(zhǎng)期效應(yīng)的機(jī)制也未被揭開。本研究結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)室制備的CpG ODN作為乙肝表面抗原的佐劑能較早較快地促進(jìn)乙肝表面抗原的抗原抗體反應(yīng)，并且安全可靠。在長(zhǎng)期效應(yīng)上，CpG ODN作為佐劑對(duì)維持乙肝表面抗體的有效滴度具有長(zhǎng)期效應(yīng)?！?參考 文獻(xiàn) 】  Y

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