植物單寧的含量測定方法

1、植物單寧的含量測定方法1植物單寧單寧（Tannins）又稱單寧酸、糅質(zhì)、糅酸。按Bategnt的定義，指相對分子質(zhì)量為5003000的能沉淀蛋白質(zhì)、生物堿的水溶性多酚化合物。主要應(yīng)用于1醫(yī)藥、食品、制革、日用化學(xué)品、水處理等領(lǐng)域。單寧在傳統(tǒng)醫(yī)藥上內(nèi)服可治胃腸道出血和止痢，外用于局部止血和創(chuàng)面保護(hù)防止感染發(fā)炎；近年研究發(fā)現(xiàn)單寧還具有抑菌抗病毒、抗過敏、抗氧化和延緩衰老、預(yù)防心血管疾病、抗腫瘤和促進(jìn)免疫等作用。單寧在食品行業(yè)中可作為功能性成分用于制作保健品，生產(chǎn)食品添加劑、風(fēng)味劑等；在化妝品中主要起收斂、防曬、美白、抗皺、保濕、防腐等作用；在制革工業(yè)中，單寧是榜膠的主要成分。2單寧的含量測定經(jīng)典的

2、有皮粉法、干酪素法、氧化滴定法、分光光度法等；現(xiàn)階段涌現(xiàn)出許多新型的測定方法，如高效液相色譜法、流動注射分析法、原子分光光度法等。經(jīng)典測定方法皮粉法皮粉法是國際上公認(rèn)的單寧含量測定方法，從20世紀(jì)60年代至今，原蘇聯(lián)、日本、印度和中國都采用此法作為國家標(biāo)準(zhǔn)測試方法。皮粉的主要成分是蛋白質(zhì)，單寧是多元酚類，分子中的酚羥基與蛋白質(zhì)的酰胺鍵以氫鍵結(jié)合形成不溶于水的沉淀，以此使單寧沉淀下來，用重量法測定其含量。根據(jù)皮粉與單寧溶液接觸方式不同，可將其分為震蕩法和過濾法。震蕩法是皮粉與單寧溶液一起震蕩來脫去溶液中的單寧；過濾法是將單寧溶液流過皮粉柱層以脫去單寧。通常，過濾法所測的單寧含量比震蕩法高5%7%

3、皮粉法所測的是單寧的絕對含量，并且不需要標(biāo)樣，操作簡單，可用其測定中藥水提液中糅質(zhì)的含量2。但皮粉法的缺點(diǎn)是，用重量法測定樣品時(shí)，須經(jīng)過過濾、干燥、稱重，樣品耗用量大，測定時(shí)間較長，一般樣品分析需20h左右，不適合大批量樣品的快速測定；沒有選擇性，對低相對分子質(zhì)量的多酚也具有一定的吸附能力，往往使測定結(jié)果偏高；適用于單寧含量高的樣品，不適合低含量和微量測定；另外皮粉試劑的供應(yīng)和質(zhì)量都較難保證。針對以上缺點(diǎn)，現(xiàn)在大多采用皮粉-分光光度法3、磷鉬鎢酸-皮粉比色法4等，具有操作簡單、快速、精密度高的優(yōu)點(diǎn)。干酪素法干酪素的主要成分是酪蛋白，為含磷蛋白。利用其能選擇性地結(jié)合具有生理活性的鞣質(zhì)，從而測定具

4、有療效鞣質(zhì)的含量。干酪素法一般與分光光度法結(jié)合，鞣質(zhì)在一定的pH條件下與Folin試劑反應(yīng)，并且鞣質(zhì)含量與吸光度成正比。很多人利用干酪素法測定了金櫻子、側(cè)伯葉、大黃、旋覆花5-8等藥材中單寧的含量，此法樣品取量少、簡單、靈敏、快速、準(zhǔn)確，可作為檢測植物藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的可靠分析手段。膠體滴定法膠體滴定法，又稱聚電解質(zhì)滴定法，是利用一些電荷密度已知且性能比較穩(wěn)定的陰、陽離子聚電解質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，對被測試樣進(jìn)行電荷測量的一種滴定方法9。1948年日本學(xué)者寺山宏提出后，經(jīng)眾多研究者的不斷改進(jìn)，已成為最簡單的定量分析聚電解質(zhì)的方法10-11，并且在制革、水處理、造紙、食品等行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用12-13。

5、單寧溶液在一定的條件下呈膠體狀態(tài)，膠粒帶負(fù)電荷14。膠體滴定的具體做法是15，于浸提的栲膠溶液中加入過量的PD（聚二甲基二烯丙基氯化鏤）標(biāo)準(zhǔn)溶液，以TB（甲苯胺蘭指示劑）為指示劑，用PVSK（聚乙烯醇硫酸鉀）滴定過剩的PD。TB指示劑帶有正電荷，與PD不反應(yīng)，最初呈現(xiàn)藍(lán)綠色。隨著滴定的進(jìn)行，過剩的PD會與PVSK形成聚離子復(fù)合物，此時(shí)再滴入的PVSK與指示劑反應(yīng)，產(chǎn)生異染現(xiàn)象，試樣溶液立即變?yōu)榧t紫色，指示滴定到達(dá)終點(diǎn)。龐燕等16利用膠體滴定法測定木麻黃樹皮中的單寧，得出了在pH為7時(shí)木麻黃溶液的膠體滴定值與所含單寧含量的線性關(guān)系，相關(guān)性良好，可以據(jù)此來計(jì)算未知濃度的木麻黃提取液中單寧的含量。戴

6、麗君等17以膠體滴定法和皮粉法分別測定了橡碗栲膠中單寧含量，兩者對比發(fā)現(xiàn)，膠體滴定法測得的單寧含量值均小于皮粉法的測定值，但是差值不大，究其原因，可能是由于滴定終點(diǎn)的判斷、溫差等原因引起的。絡(luò)合滴定法絡(luò)合滴定法是以絡(luò)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的容量分析方法，又稱螯合滴定法。單寧分子中含有多個(gè)酚羥基可以與一個(gè)中心離子，如銅、鋅、鉍、鐵、汞等進(jìn)行絡(luò)合，形成多核絡(luò)合物，在一定的pH條件下沉淀，再通過EDTA反滴定過量金屬離子來確定單寧的含量。絡(luò)合法所使用的指示劑一般為金屬指示劑，指示終點(diǎn)到達(dá)時(shí)要求具有較深的顏色，如鉻黑T。利用Zn2+只與單寧反應(yīng)的特性來沉淀分析溶液中的塔拉單寧，以鉻黑T作指示劑，用EDTA溶液滴

7、定剩余的Zn2+，結(jié)果顯示塔拉中單寧的質(zhì)量百分含量為%，比皮粉法測定的結(jié)果要精確18。劉佳銘19用Pb2+與單寧絡(luò)合，以K2CrO4為指示劑，PAM（陽離子型聚丙烯酰胺）為終點(diǎn)增敏劑，測定了黑荊樹栲膠中單寧的含量，較之皮粉法快速、準(zhǔn)確。還有人研究了綠茶20、橡子21和三葉委陵菜22中單寧的絡(luò)合滴定，眾多研究表明絡(luò)合滴定法簡單、快速、誤差小，并且避免了沉淀轉(zhuǎn)移及洗滌的繁瑣程序，還可省略空白對照，對酚類物質(zhì)的選擇性比較好，蛋白質(zhì)和抗壞血酸均不影響測定。但是金屬離子與酚類物質(zhì)的反應(yīng)與酚的結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系，并且靈敏度較差，不適宜酚組分復(fù)雜的樣品。氧化滴定法氧化還原滴定法是以氧化劑或還原劑為滴定劑，直接滴

8、定一些具有還原性或氧化性的物質(zhì)；或者間接滴定一些本身沒有氧化還原性，但能與某些氧化劑或還原劑起反應(yīng)的物質(zhì)。單寧是多酚類的化合物，具有很好的還原性，在常溫酸性溶液中可被高鎰酸鉀氧化，由此可得到單寧的含量。用此法測定二白圓、二梭子兩種青果果實(shí)中的總糅質(zhì)含量23表明，滴定終點(diǎn)不易觀察，須多次平行試驗(yàn)，取平均值。Stiasny法Stiasny法也稱甲醛縮合法，是利用單寧與甲醛-鹽酸共沸時(shí)，單寧與甲醛縮聚,基本上全部沉淀下來。其反應(yīng)方程如圖1。單寧與甲醛所產(chǎn)生的沉淀物質(zhì)量占樣品總質(zhì)量的百分率，稱為甲醛值（或稱Stiasny值）。在規(guī)定的測定條件下，用甲醛縮合的沉淀物質(zhì)量與試樣的質(zhì)量及不溶物含量之間的數(shù)量

9、關(guān)系計(jì)算得出被測試樣中單寧的含量。國內(nèi)有采用甲醛縮合法測定落葉松樹皮、黑荊樹榜膠24-26中的單寧含量，具有簡單、快捷、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，是一種值得推廣的縮合單寧含量的測定方法。分光光度法分光光度法是通過測定被測物質(zhì)在特定波長或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，以此對該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。分光光度法的應(yīng)用光區(qū)包括紫外光區(qū)、可見光區(qū)、紅外光區(qū)，其中常用的是紫外光區(qū)和可見光區(qū)，兩者的波長范圍分別為200400nm和400760nm分光光度法的基本原理是朗伯-比爾定律，即當(dāng)一束平行的單色光通過含有吸光物質(zhì)的稀溶液時(shí)，溶液的吸光度與吸光物質(zhì)濃度、液層厚度乘積成正比。定量分析時(shí)，首先需要測定溶液對不同波長光

10、的吸收情況，從中確定出最大波長，然后以此波長為光源，測定一系列已知濃度c溶液的吸光度A，做出A-c工作曲線。分析未知溶液時(shí)，根據(jù)測量的吸光度，對應(yīng)工作曲線即可確定出相應(yīng)的濃度。在眾多單寧含量的測定方法中，分光光度法的應(yīng)用最為廣泛。常用的顯色劑有鄰二氮菲-鐵（出）、香草醛、正丁醇-鹽酸、Folin-Denis試劑、Folin-Ciocalteu試劑、鐵氰化鉀（普魯士藍(lán)法）、磷鉬酸-鎢酸鈉、檸檬酸鐵銨等27-31。其中Folin-酚法和普魯士藍(lán)法測定的是總酚含量；香草醛法選擇性測定A環(huán)為間苯三酚的黃烷醇，但不能區(qū)別單體和聚合體；正丁醇-鹽酸測定的是聚原花色素（縮合單寧）的含量。武予清等32通過Fo

11、lin酚還原法、正丁醇-鹽酸法和香草醛法測定棉花組織中單寧的含量，比較表明Folin酚法測定的單寧含量值顯著高于正丁醇-鹽酸法，原因可能是此法測定出的是相對總酚含量；而香草醛法的測定結(jié)果與正丁醇-鹽酸法差異不大，可以用于棉花中縮合單寧的含量測定。比色法比色法是通過比較或者測量有色物質(zhì)溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法。其作為一種定量分析方法，大約開始于19世紀(jì)3040年代。常用的比色法有兩種：目視比色法和光電比色法，都是以朗伯-比爾定律為基礎(chǔ)的。在20世紀(jì)3060年代，是比色分析發(fā)展的繁盛時(shí)期，它廣泛的應(yīng)用于冶金、地質(zhì)、金屬材料中微量的金屬和部分非金屬元素的測定。但隨著光學(xué)儀器制造技術(shù)的發(fā)展

12、，分光光度法逐漸代替了比色法?，F(xiàn)代測定方法高效液相色譜法高效液相色譜法（HPL。又稱高壓液相色譜、近代柱色譜，是以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例混合的溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)對試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。1906年俄國植物化學(xué)家茨維特（Tswett）首次提出“色譜法”和“色譜圖”的概念。1960年中后期，液相色譜開始活躍，到60年代末把高壓泵和化學(xué)鍵合固定相用于液相色譜就出現(xiàn)了HPLC；1990年以后，生物工程和生命科學(xué)在國際和

13、國內(nèi)的迅速發(fā)展，為高效液相色譜技術(shù)提出了更多、更新的分離、純化、制備的課題，促進(jìn)了它的迅速發(fā)展。高效液相色譜中的固定相可以是液體、吸附劑、離子交換劑、離子交換樹脂、凝膠，固定相的不同，分離原理也有差異。較常用的是液-液分配色譜法，即流動相和固定相都是液體，并且互不相溶，有一個(gè)明顯的分界面。其又包括正相液-液分配色譜法即流動相的極性小于固定相、反相液-液分配色譜法即流動相的極性大于固定相。在液-液分配色譜中盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液仍不可避免的在流動相中有微量的溶解；并且流動相通過色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊力，會造成固定液的流失。20世紀(jì)70年代末發(fā)展的化學(xué)鍵合固定相可以克服上述的缺

14、點(diǎn)，現(xiàn)在應(yīng)用很廣泛。郭佳莉等33采用HypersilODS（125Xmm,5m）色譜柱；檢測波長275nm；流動相為80%甲醇和20%水；流速為mLmin-1測定余甘子中單寧酸的含量，相關(guān)系數(shù)達(dá)%以上，充分顯示了該法快速、方便、精確可靠的優(yōu)點(diǎn)。流動注射法流動注射分析法（FIA）是丹麥科學(xué)家于1974年創(chuàng)立的一項(xiàng)溶液自動在線處理及測定的現(xiàn)代分析技術(shù)。1988年Ruzicka等對流動注射分析作了定義：向流路中注入一個(gè)明確的流體帶，在連續(xù)非隔離載流中分散而形成濃度梯度，從此濃度梯度中獲得信息的技術(shù)。流動注射分析法是利用具有流速的試劑流的容量測定，即用聚四氟乙烯管代替燒杯和容量瓶，通過流動注射進(jìn)行分析

15、的方法。用恒流量泵使檢測試劑流過內(nèi)徑為1mm的聚四氟乙烯管，在中途有注入部件（旋轉(zhuǎn)閥）注入微升量試樣，使其在混合圈中反應(yīng)。檢測器通常是采用裝有流通池的分光光度計(jì)、熒光光度計(jì)、原子吸收分光光度計(jì)和離子計(jì)等。李淮芬等34基于在甲醛存在的酸性介質(zhì)中，高錳酸鉀氧化單寧酸產(chǎn)生較強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，結(jié)合流動注射技術(shù)，測定了幾種啤酒中微量的單寧酸含量。趙川等35使用經(jīng)陽極化處理的雙鉑電極，通過偶合單寧在一支電極上的催化氧化和氧化鉑在另一支電極上的還原兩個(gè)不可逆電極過程，建立了不可逆電對的流動注射雙安培法快速檢測綠茶、花茶等中的單寧含量的新方法。流動注射法還可與化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)法、動力學(xué)光度法等方法結(jié)合36-37，

16、對被測試樣的單寧含量進(jìn)行測定，具有較好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。流動注射法的測量是在動態(tài)條件下進(jìn)行，反應(yīng)條件和分析操作能自動保持一致，結(jié)果重現(xiàn)性好；分析速度快，特別適合于大批量樣品分析；并且易于實(shí)現(xiàn)連續(xù)自動分析，使某些難以或無法實(shí)現(xiàn)的手工操作成為可能，將有良好的發(fā)展前景。2.2.3薄層掃描法層掃描法（TLCS）是指用一定波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜中有紫外或可見吸收的斑點(diǎn)或經(jīng)照射能激發(fā)產(chǎn)生熒光的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，將掃描的圖譜及積分值用于藥品的質(zhì)量檢驗(yàn)方法。蔡毓瓊等38使用島津CS-930雙波長薄層掃描儀，建立了余甘子喉片中沒食子酸含量的測定方法。該法簡便、快速，穩(wěn)定，并且不須任何顯色劑，加熱即呈現(xiàn)穩(wěn)

17、定的黃褐色斑點(diǎn)，大大提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法（AAS）是基于蒸汽相中待測元素的基態(tài)原子對其共振輻射的吸收強(qiáng)度來測定試樣中該元素含量的一種儀器分析方法。主要應(yīng)用于測量痕量和超痕量元素。張穎等39建立了火焰原子吸收法測土茯苓中單寧的含量，單寧與醋酸銨溶液中的銅離子產(chǎn)生沉淀，離心后通過測定剩余銅離子和未加入單寧前銅離子的吸光度，兩者之差在一定的范圍內(nèi)與單寧濃度呈線性關(guān)系，由此得出單寧含量。此法靈敏度高、干擾較少、選擇性好，可使整個(gè)操作自動化，應(yīng)用日益廣泛。其他熒光分析法是利用某些物質(zhì)被紫外光照射后所發(fā)射的能反映該物質(zhì)特性的熒光，可以進(jìn)行定性或定量分析的方法。它

18、作為一種高靈敏的檢測方法很少用于單寧含量的測定。馮素玲等40基于單寧活化Cu（n）催化過氧化氫氧化口比咯紅丫，使體系熒光猝滅，將熒光分析法與動力學(xué)結(jié)合起來測定茶葉中的痕量單寧。Claderaforteza等41用熱透鏡光譜法測定了白葡萄酒中的痕量單寧，檢測限達(dá)到了5g/L。丁亞平等利用KBrO3和KBr的氧化還原反應(yīng)與茶單寧的溴代反應(yīng)的速度差異，采用高靈敏示波電位動力學(xué)分析法測定了痕量的茶單寧。MelloLD等42用生物傳感器測定了蔬菜中的多酚含量。有報(bào)道稱可用濁度光度法測定液體，特別是飲料（如啤酒、酒和果汁）中的單寧和類單寧化合物。3展望我國植物資源豐富，開發(fā)利用植物鞣質(zhì)具有廣闊的發(fā)展前景。

19、目前，國內(nèi)對鞣質(zhì)的研究相對較少，仍然處于初級階段，應(yīng)用領(lǐng)域也比較局限。單寧的經(jīng)典測定方法大多數(shù)比較冗繁、精確度低；而現(xiàn)代測定方法中儀器價(jià)格昂貴，不適合大范圍推廣應(yīng)用，因此探尋一種經(jīng)濟(jì)、精確的單寧測定方法是當(dāng)務(wù)之急。參考文獻(xiàn)：1但衛(wèi)華，程鳳俠.制革化學(xué)及工藝學(xué)M.北京：中國輕工業(yè)出版社，2006.2董潔，郭立瑋，文紅梅，等.中藥水提液中鞣質(zhì)含量測定方法研究J.江蘇中醫(yī)藥，2008，40（11）：89-90.3陳紅英，林南英，謝金倫.塔拉粉中單寧含量的測定J.云南化工，2006，33（1）：44-45.4王坤，魯靜.中藥材中鞣質(zhì)含量測定方法的研究J.中國藥事，2004，18（6）：361-364.

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25、平，馬澤芳.竹子中單寧光譜分析，2003，23（2）：322-324.17 戴麗君，蘇小寶，盧玉棟，等.膠體滴含量的測定及其對大熊貓采食量的41CladerafortezaA,TomasmasC,定法測定橡椀栲膠中的單寧含量J.影響J.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，29EstelaripollJM,etal.Determination生物質(zhì)化學(xué)工程，2006，40（5）：15-（2）：67-71.oftanninsinwhitewinesbythermal-17.30房江育，馬雪瀧.影響黑果枸杞縮合lensspectrometryJ.Microchemical18 楊文云，李志國，吳昊，等.絡(luò)合

26、法測單寧測定的因素分析J.食品科學(xué)，Journal,1995,52（1）:28-32.定塔拉單寧含量的研究J.西南林學(xué)2006，22（8）：105-107.42LucileneDomellesMello,MariaDel等.高粱中單院學(xué)報(bào)，1999，19（4）：249-252.31范璐，霍權(quán)恭，周展明，PilarTaboadaSotomayor,Lauro寧含量測定方法的研究J. 中國糧油19 劉佳銘.絡(luò)合滴定黑荊樹栲膠中單寧Tatsuo-based含量的新方法J.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，學(xué)報(bào)，2001，16（2）：13-17.amperometricbiosensorforthe1997，17（3）

27、：63-66.32武予清，郭予元.棉花植株中的單寧polyphenolsdeterminationin20 張濤，張少文.綠茶提取物的制備及測定方法研究J.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，vegetablesextractJ.Sensorsand其鞣質(zhì)的含量測定J.中醫(yī)藥信息，2000，11（2）：243-245.ActuatorsB:Chemical,2003,96（3）:2001，18（1）：41-42.33郭佳莉，李國清，蔡英卿，等.高效液634-645.植物單寧的含量測定方法摘要：單寧是多酚中高度聚合的化合物，廣泛存在于自然界中，主要應(yīng)用于日化、食品、醫(yī)藥、制革等領(lǐng)域。簡要介紹了植物單寧的性質(zhì)、生理活性

28、及應(yīng)用，綜述了單寧含量的經(jīng)典測定方法以及現(xiàn)代測定方法，并對其發(fā)展前景進(jìn)行了展望。關(guān)鍵詞：植物單寧；生理活性；應(yīng)用；含量測定1植物單寧單寧（Tannins）又稱單寧酸、鞣質(zhì)、鞣酸。按Bategnt的定義，指相對分子質(zhì)量為5003000的能沉淀蛋白質(zhì)、生物堿的水溶性多酚化合物。它廣泛存在于植物的葉、果實(shí)、根及皮等部位，也是樹木受昆蟲侵襲而生成的蟲癭的主要成分；主要應(yīng)用于1醫(yī)藥、食品、制革、日用化學(xué)品、水處理等領(lǐng)域。單寧是多酚中高度聚合的化合物，為黃色或棕黃色無定形松散粉末，在空氣中顏色逐漸變深，有較強(qiáng)的吸濕性；不溶于乙醚、苯、氯仿，易溶于水、乙醇、丙酮，水溶液有澀味。單寧的化學(xué)成分比較復(fù)雜，大致分

29、為兩種：一種是水解類單寧，是多元酚酸與糖主要以酯鍵形成的化合物，如沒食子酸單寧和鞣花酸單寧；一種是縮合類單寧，重要組成成分為黃烷醇及其衍生物，如堅(jiān)木單寧、荊樹皮單寧和落葉松單寧。特定分子結(jié)構(gòu)的單寧具有生理活性，能與生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、多糖、核酸等發(fā)生作用。單寧對人體的作用具有雙重性，食物中的單寧過量會產(chǎn)生抗?fàn)I養(yǎng)的作用，如降低蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值、影響VA和Vb12的有效利用。單寧在傳統(tǒng)醫(yī)藥上內(nèi)服可治胃腸道出血和止痢，外用于局部止血和創(chuàng)面保護(hù)防止感染發(fā)炎；近年研究發(fā)現(xiàn)單寧還具有抑菌抗病毒、抗過敏、抗氧化和延緩衰老、預(yù)防心血管疾病、抗腫瘤和促進(jìn)免疫等作用。單寧在食品行業(yè)中可作為功能性成分用于制作保健品，

30、生產(chǎn)食品添加劑、風(fēng)味劑等；在化妝品中主要起收斂、防曬、美白、抗皺、保濕、防腐等作用；在制革工業(yè)中，單寧是栲膠的主要成分。2單寧的含量測定近十多年來，植物單寧的性質(zhì)和應(yīng)用引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。隨著研究的不斷深入，迫切需要對單寧進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量分析。單寧的定量檢測方法很多，經(jīng)典的有皮粉法、干酪素法、氧化滴定法、分光光度法等；現(xiàn)階段涌現(xiàn)出許多新型的測定方法，如高效液相色譜法、流動注射分析法、原子分光光度法等。經(jīng)典測定方法皮粉法皮粉法是國際上公認(rèn)的單寧含量測定方法，從20世紀(jì)60年代至今，原蘇聯(lián)、日本、印度和中國都采用此法作為國家標(biāo)準(zhǔn)測試方法。皮粉的主要成分是蛋白質(zhì)，單寧是多元酚類，分子中的酚羥

31、基與蛋白質(zhì)的酰胺鍵以氫鍵結(jié)合形成不溶于水的沉淀，以此使單寧沉淀下來，用重量法測定其含量。根據(jù)皮粉與單寧溶液接觸方式不同，可將其分為震蕩法和過濾法。震蕩法是皮粉與單寧溶液一起震蕩來脫去溶液中的單寧；過濾法是將單寧溶液流過皮粉柱層以脫去單寧。通常，過濾法所測的單寧含量比震蕩法高5%7%皮粉法所測的是單寧的絕對含量，并且不需要標(biāo)樣，操作簡單，可用其測定中藥水提液中鞣質(zhì)的含量2。但皮粉法的缺點(diǎn)是，用重量法測定樣品時(shí)，須經(jīng)過過濾、干燥、稱重，樣品耗用量大，測定時(shí)間較長，一般樣品分析需20h左右，不適合大批量樣品的快速測定；沒有選擇性，對低相對分子質(zhì)量的多酚也具有一定的吸附能力，往往使測定結(jié)果偏高；適用于

32、單寧含量高的樣品，不適合低含量和微量測定；另外皮粉試劑的供應(yīng)和質(zhì)量都較難保證。針對以上缺點(diǎn)，現(xiàn)在大多采用皮粉-分光光度法3、磷鉬鎢酸-皮粉比色法4等，具有操作簡單、快速、精密度高的優(yōu)點(diǎn)。干酪素法干酪素的主要成分是酪蛋白，為含磷蛋白。利用其能選擇性地結(jié)合具有生理活性的鞣質(zhì)，從而測定具有療效鞣質(zhì)的含量。干酪素法一般與分光光度法結(jié)合，鞣質(zhì)在一定的pH條件下與Folin試劑反應(yīng)，并且鞣質(zhì)含量與吸光度成正比。很多人利用干酪素法測定了金櫻子、側(cè)伯葉、大黃、旋覆花5-8等藥材中單寧的含量，此法樣品取量少、簡單、靈敏、快速、準(zhǔn)確，可作為檢測植物藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的可靠分析手段。膠體滴定法膠體滴定法，又稱聚電解質(zhì)滴定

33、法，是利用一些電荷密度已知且性能比較穩(wěn)定的陰、陽離子聚電解質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，對被測試樣進(jìn)行電荷測量的一種滴定方法9。1948年日本學(xué)者寺山宏提出后，經(jīng)眾多研究者的不斷改進(jìn)，已成為最簡單的定量分析聚電解質(zhì)的方法10-11，并且在制革、水處理、造紙、食品等行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用12-13。單寧溶液在一定的條件下呈膠體狀態(tài)，膠粒帶負(fù)電荷14。膠體滴定的具體做法是15，于浸提的栲膠溶液中加入過量的PD（聚二甲基二烯丙基氯化鏤）標(biāo)準(zhǔn)溶液，以TB（甲苯胺蘭指示劑）為指示劑，用PVSK（聚乙烯醇硫酸鉀）滴定過剩的PD。TB指示劑帶有正電荷，與PD不反應(yīng)，最初呈現(xiàn)藍(lán)綠色。隨著滴定的進(jìn)行，過剩的PD會與PVSK形成

34、聚離子復(fù)合物，此時(shí)再滴入的PVSK與指示劑反應(yīng)，產(chǎn)生異染現(xiàn)象，試樣溶液立即變?yōu)榧t紫色，指示滴定到達(dá)終點(diǎn)。龐燕等16利用膠體滴定法測定木麻黃樹皮中的單寧，得出了在pH為7時(shí)木麻黃溶液的膠體滴定值與所含單寧含量的線性關(guān)系，相關(guān)性良好，可以據(jù)此來計(jì)算未知濃度的木麻黃提取液中單寧的含量。戴麗君等17以膠體滴定法和皮粉法分別測定了橡碗栲膠中單寧含量，兩者對比發(fā)現(xiàn)，膠體滴定法測得的單寧含量值均小于皮粉法的測定值，但是差值不大，究其原因，可能是由于滴定終點(diǎn)的判斷、溫差等原因引起的。絡(luò)合滴定法絡(luò)合滴定法是以絡(luò)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的容量分析方法，又稱螯合滴定法。單寧分子中含有多個(gè)酚羥基可以與一個(gè)中心離子，如銅、鋅、鉍、

35、鐵、汞等進(jìn)行絡(luò)合，形成多核絡(luò)合物，在一定的pH條件下沉淀，再通過EDTA反滴定過量金屬離子來確定單寧的含量。絡(luò)合法所使用的指示劑一般為金屬指示劑，指示終點(diǎn)到達(dá)時(shí)要求具有較深的顏色，如鉻黑T。利用Zn2+只與單寧反應(yīng)的特性來沉淀分析溶液中的塔拉單寧，以鉻黑T作指示劑，用EDTA溶液滴定剩余的Zn2+，結(jié)果顯示塔拉中單寧的質(zhì)量百分含量為%，比皮粉法測定的結(jié)果要精確18。劉佳銘19用Pb2+與單寧絡(luò)合，以K2CrO4為指示劑，PAM（陽離子型聚丙烯酰胺）為終點(diǎn)增敏劑，測定了黑荊樹栲膠中單寧的含量，較之皮粉法快速、準(zhǔn)確。還有人研究了綠茶20、橡子21和三葉委陵菜22中單寧的絡(luò)合滴定，眾多研究表明絡(luò)合滴

36、定法簡單、快速、誤差小，并且避免了沉淀轉(zhuǎn)移及洗滌的繁瑣程序，還可省略空白對照，對酚類物質(zhì)的選擇性比較好，蛋白質(zhì)和抗壞血酸均不影響測定。但是金屬離子與酚類物質(zhì)的反應(yīng)與酚的結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系，并且靈敏度較差，不適宜酚組分復(fù)雜的樣品。氧化滴定法氧化還原滴定法是以氧化劑或還原劑為滴定劑，直接滴定一些具有還原性或氧化性的物質(zhì)；或者間接滴定一些本身沒有氧化還原性，但能與某些氧化劑或還原劑起反應(yīng)的物質(zhì)。單寧是多酚類的化合物，具有很好的還原性，在常溫酸性溶液中可被高鎰酸鉀氧化，由此可得到單寧的含量。用此法測定二白圓、二梭子兩種青果果實(shí)中的總糅質(zhì)含量23表明，滴定終點(diǎn)不易觀察，須多次平行試驗(yàn)，取平均值。Stiasn

37、y法Stiasny法也稱甲醛縮合法，是利用單寧與甲醛-鹽酸共沸時(shí)，單寧與甲醛縮聚,基本上全部沉淀下來。其反應(yīng)方程如圖1。OH0H單寧與甲醛所產(chǎn)生的沉淀物質(zhì)量占樣品總質(zhì)量的百分率稱為甲醛值（或稱Stiasny值）。在規(guī)定的測定條件下，用甲醛縮合的沉淀物質(zhì)量與試樣的質(zhì)量及不溶物含量之間的數(shù)量關(guān)系計(jì)算得出被測試樣中單寧的含量。國內(nèi)有采用甲醛縮合法測定落葉松樹皮、黑荊樹榜膠24-26中的單寧含量，具有簡單、快捷、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，是一種值得推廣的縮合單寧含量的測定方法。分光光度法分光光度法是通過測定被測物質(zhì)在特定波長或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，以此對該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。分光光度法的應(yīng)用光區(qū)包括紫

38、外光區(qū)、可見光區(qū)、紅外光區(qū)，其中常用的是紫外光區(qū)和可見光區(qū)，兩者的波長范圍分別為200400nm和400760nm分光光度法的基本原理是朗伯-比爾定律，即當(dāng)一束平行的單色光通過含有吸光物質(zhì)的稀溶液時(shí)，溶液的吸光度與吸光物質(zhì)濃度、液層厚度乘積成正比。定量分析時(shí)，首先需要測定溶液對不同波長光的吸收情況，從中確定出最大波長，然后以此波長為光源，測定一系列已知濃度c溶液的吸光度A,做出A-c工作曲線。分析未知溶液時(shí)，根據(jù)測量的吸光度，對應(yīng)工作曲線即可確定出相應(yīng)的濃度。在眾多單寧含量的測定方法中，分光光度法的應(yīng)用最為廣泛。常用的顯色劑有鄰二氮菲-鐵（出）、香草醛、正丁醇-鹽酸、Folin-Denis試劑

39、、Folin-Ciocalteu試劑、鐵氧化鉀（普魯士藍(lán)法）、磷鋁酸-鴇酸鈉、檸檬酸鐵俊等27-31。其中Folin-酚法和普魯士藍(lán)法測定的是總酚含量；香草醛法選擇性測定A環(huán)為間苯三酚的黃烷醇，但不能區(qū)別單體和聚合體；正丁醇-鹽酸測定的是聚原花色素（縮合單寧）的含量。武予清等32通過Folin酚還原法、正丁醇-鹽酸法和香草醛法測定棉花組織中單寧的含量，比較表明Folin酚法測定的單寧含量值顯著高于正丁醇-鹽酸法，原因可能是此法測定出的是相對總酚含量；而香草醛法的測定結(jié)果與正丁醇-鹽酸法差異不大，可以用于棉花中縮合單寧的含量測定。比色法比色法是通過比較或者測量有色物質(zhì)溶液顏色深度來確定待測組分含

40、量的方法。其作為一種定量分析方法，大約開始于19世紀(jì)3040年代。常用的比色法有兩種：目視比色法和光電比色法，都是以朗伯-比爾定律為基礎(chǔ)的。在20世紀(jì)3060年代，是比色分析發(fā)展的繁盛時(shí)期，它廣泛的應(yīng)用于冶金、地質(zhì)、金屬材料中微量的金屬和部分非金屬元素的測定。但隨著光學(xué)儀器制造技術(shù)的發(fā)展，分光光度法逐漸代替了比色法?，F(xiàn)代測定方法高效液相色譜法高效液相色譜法（HPL。又稱高壓液相色譜、近代柱色譜，是以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例混合的溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)對試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、

41、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。1906年俄國植物化學(xué)家茨維特（Tswett）首次提出“色譜法”和“色譜圖”的概念。1960年中后期，液相色譜開始活躍，到60年代末把高壓泵和化學(xué)鍵合固定相用于液相色譜就出現(xiàn)了HPLC；1990年以后，生物工程和生命科學(xué)在國際和國內(nèi)的迅速發(fā)展，為高效液相色譜技術(shù)提出了更多、更新的分離、純化、制備的課題，促進(jìn)了它的迅速發(fā)展。高效液相色譜中的固定相可以是液體、吸附劑、離子交換劑、離子交換樹脂、凝膠，固定相的不同，分離原理也有差異。較常用的是液-液分配色譜法，即流動相和固定相都是液體，并且互不相溶，有一個(gè)明顯的分界面。其又包括正相液-液分配

42、色譜法即流動相的極性小于固定相、反相液-液分配色譜法即流動相的極性大于固定相。在液-液分配色譜中盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液仍不可避免的在流動相中有微量的溶解；并且流動相通過色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊力，會造成固定液的流失。20世紀(jì)70年代末發(fā)展的化學(xué)鍵合固定相可以克服上述的缺點(diǎn)，現(xiàn)在應(yīng)用很廣泛。郭佳莉等33采用HypersilODS（125Xmm,5m）色譜柱；檢測波長275nm；流動相為80%甲醇和20%水；流速為mLmin-1測定余甘子中單寧酸的含量，相關(guān)系數(shù)達(dá)%以上，充分顯示了該法快速、方便、精確可靠的優(yōu)點(diǎn)。流動注射法流動注射分析法（FIA）是丹麥科學(xué)家于1974年創(chuàng)立的一項(xiàng)

43、溶液自動在線處理及測定的現(xiàn)代分析技術(shù)。1988年Ruzicka等對流動注射分析作了定義：向流路中注入一個(gè)明確的流體帶，在連續(xù)非隔離載流中分散而形成濃度梯度，從此濃度梯度中獲得信息的技術(shù)。流動注射分析法是利用具有流速的試劑流的容量測定，即用聚四氟乙烯管代替燒杯和容量瓶，通過流動注射進(jìn)行分析的方法。用恒流量泵使檢測試劑流過內(nèi)徑為1mm的聚四氟乙烯管，在中途有注入部件（旋轉(zhuǎn)閥）注入微升量試樣，使其在混合圈中反應(yīng)。檢測器通常是采用裝有流通池的分光光度計(jì)、熒光光度計(jì)、原子吸收分光光度計(jì)和離子計(jì)等。李淮芬等34基于在甲醛存在的酸性介質(zhì)中，高錳酸鉀氧化單寧酸產(chǎn)生較強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，結(jié)合流動注射技術(shù)，測定了幾

44、種啤酒中微量的單寧酸含量。趙川等35使用經(jīng)陽極化處理的雙鉑電極，通過偶合單寧在一支電極上的催化氧化和氧化鉑在另一支電極上的還原兩個(gè)不可逆電極過程，建立了不可逆電對的流動注射雙安培法快速檢測綠茶、花茶等中的單寧含量的新方法。流動注射法還可與化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)法、動力學(xué)光度法等方法結(jié)合36-37，對被測試樣的單寧含量進(jìn)行測定，具有較好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。流動注射法的測量是在動態(tài)條件下進(jìn)行，反應(yīng)條件和分析操作能自動保持一致，結(jié)果重現(xiàn)性好；分析速度快，特別適合于大批量樣品分析；并且易于實(shí)現(xiàn)連續(xù)自動分析，使某些難以或無法實(shí)現(xiàn)的手工操作成為可能，將有良好的發(fā)展前景。2.2.4薄層掃描法層掃描法（TLCS）是指用一

45、定波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜中有紫外或可見吸收的斑點(diǎn)或經(jīng)照射能激發(fā)產(chǎn)生熒光的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，將掃描的圖譜及積分值用于藥品的質(zhì)量檢驗(yàn)方法。蔡毓瓊等38使用島津CS-930雙波長薄層掃描儀，建立了余甘子喉片中沒食子酸含量的測定方法。該法簡便、快速，穩(wěn)定，并且不須任何顯色劑，加熱即呈現(xiàn)穩(wěn)定的黃褐色斑點(diǎn)，大大提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法（AAS）是基于蒸汽相中待測元素的基態(tài)原子對其共振輻射的吸收強(qiáng)度來測定試樣中該元素含量的一種儀器分析方法。主要應(yīng)用于測量痕量和超痕量元素。張穎等液體，特別是飲料（如啤酒、酒和果汁）中的單寧和類單寧化合物。3展望我國植物資源豐富，

46、開發(fā)利用植物鞣質(zhì)具有廣闊的發(fā)展前景。目前，國內(nèi)對鞣質(zhì)的研究相對較少，仍然處于初級階段，應(yīng)用領(lǐng)域也比較局限。單寧的經(jīng)典測定方法大多數(shù)比較冗繁、精確度低；而現(xiàn)代測定方法中儀器價(jià)格昂貴，不適合大范圍推廣應(yīng)用，因此探尋一種經(jīng)濟(jì)、精確的單寧測定方法是當(dāng)務(wù)之急。參考文獻(xiàn)：1但衛(wèi)華，程鳳俠.制革化學(xué)及工藝學(xué)M.北京：中國輕工業(yè)出版社，2006.2董潔，郭立瑋，文紅梅，等.中藥水提液中鞣質(zhì)含量測定方法研究J.江蘇中醫(yī)藥，2008，40（11）：89-90.3陳紅英，林南英，謝金倫.塔拉粉中單寧含量的測定J.云南化工，2006，33（1）：44-45.4王坤，魯靜.中藥材中鞣質(zhì)含量測定方法的研究J.中國藥事，2

47、004，18（6）：361-364.5 李志猛，李向日.干酪素法測定不同產(chǎn)地金櫻子中鞣質(zhì)類成分的研究J.中華中醫(yī)藥雜志，2009，24（2）：230-232.6 程立方，田櫻.干酪素法測定側(cè)伯葉中鞣質(zhì)含量J.時(shí)珍國藥研究，1995，6（3）：13-14.7戴萬生，趙榮華陳紅波.干酪素法測定大黃鞣質(zhì)類成分的研究J.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2003，14（6）：324-325.21王天元，侯穎，趙全.橡子中單寧含量相色譜法測定余甘子中單寧酸的含8 萬祺，龍凌云，裴月湖，等.旋覆花中鞣的快速測定J.化學(xué)工程師，1996，52量J.光譜實(shí)驗(yàn)室，2007,24（5）:911-質(zhì)的含量測定J.時(shí)珍國醫(yī)國藥，（1）：

48、17-19.913.2007，18（11）：2758-2759.22邊可君，王滿輝，黃開勛，等.絡(luò)合量34李淮芬，劉傳芳.流動注射化學(xué)發(fā)光9 陳玉蕉，何北海.膠體滴定方法及其研法測定三葉委陵菜鞣質(zhì)含量J.中國法測定啤酒中的單寧酸J.皖西學(xué)院究進(jìn)展J.造紙化學(xué)品，2000（1）：13-藥師，2001，4（4）：269-270.學(xué)報(bào)，2005，21（5）：19-21.16. 23諶立巍，陳思敏，吳小唯，等.兩種青35趙川，張君才，宋俊峰.流動注射雙安10 陳夫山，謝來蘇，魏德津，等.用膠體果中沒食子酸和總鞣質(zhì)的含量測定培法直接測定茶中單寧J.分析化學(xué)滴定法測定聚合物的電荷J.中國造J.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥

49、，2008，5：50-51.研究簡報(bào)，2002，30（2）：210-213.紙，2000（2）：30-34.24霍淑賢，卓紅花，黨艷華，等.甲醛縮36李世鳳，崔華，孫玉剛，等.流動注射11 李翠珍，胡開堂.聚電解質(zhì)的測定方合法檢驗(yàn)落葉松樹皮栲膠單寧含量化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)法測定單寧酸J.分析法-膠體滴定法J.湖南造紙，J.林產(chǎn)化工通訊，1999，33（2）：34-化學(xué)研究簡報(bào)，2005，29（3）：333-2001，40（5）：35-37.35.335.12 林蕓，陳秉銓.膠體滴定法在廢水處25林云露.快速測定黑荊樹栲膠單寧含37曲祥金，周杰，尹鴻宗，等.流動注射理技術(shù)中的應(yīng)用J.水處理技術(shù)，量方法的研究J.林產(chǎn)化工通訊，動力學(xué)光度法測定啤酒花中的單寧1995，21（6）：362-365.1996，4：17-19.J.分析化學(xué)研究報(bào)告，2000，28（7）：13 陳浩凡，潘仕榮，胡瑜，等.膠體滴定26陳向明，陳河如，李偉彬.甲醛縮合法820-824.法測定羧甲基殼聚糖的取代度J.分快速測定縮合單寧含量的研究J.廣38蔡毓瓊，王梅.薄層掃描測定余甘子析測試學(xué)報(bào)，2003，22（6）：70-73.東化工，2006，7（33）：24-27.喉片中沒食子酸的含