植物的多倍體培養(yǎng)

1、植物的多倍體培養(yǎng)植物多倍體培養(yǎng)4月10日起摘要：植物多倍體是指每個細(xì)胞中的染色體數(shù)具有3套或更多套數(shù)的植物。隨著染色體組倍數(shù)的增加，有可能使一些作物的經(jīng)濟(jì)性狀發(fā)生有利的變化。因此，植物多倍體的研究和利用是育種工作中值得重視的途徑之一。本次實(shí)驗(yàn)就是通過用擬南芥種子作為實(shí)驗(yàn)材料，通過培育多倍體擬南芥，來熟悉掌握一般的多倍體誘導(dǎo)的方法。1. 引言1916年溫克勒(H.Winkler)在番茄與龍葵的嫁接試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在愈傷組織長成的枝條中有番茄的四倍體。自1937年布萊克斯利(A.F.B.Iakeslee)和埃弗里(A.G.Avery)利用秋水仙素誘發(fā)曼陀羅四倍體獲得成功以后，各國相繼展開人工誘發(fā)多倍體

2、的試驗(yàn)研究。1947年，木原均、西山市三發(fā)表利用三倍體無子西瓜之研究，報導(dǎo)了三倍體無子西瓜選育成功。1959年，西貞夫等利用四倍體結(jié)球甘藍(lán)和四倍體白菜雜交，成功地育成雙二倍體新種“白藍(lán)”。目前，已有1000多種植的獲得了多倍體。中國于20世紀(jì)50年代開始多倍體育種的研究。70年代以來，蔬菜多倍體育種取得許多重要進(jìn)展，已培育出三倍體、四倍體西瓜，四倍體甜瓜以及蘿卜、番茄、茄子,蘆筍、辣椒和黃瓜等蔬菜多倍體材料。多倍化后，多個等位基因互作產(chǎn)生了更多的組合和更多樣的功能變化，從而比二倍體親本擁有更高的雜合性和更迅速的環(huán)境適應(yīng)力，表現(xiàn)為抗逆性增強(qiáng)及克服遠(yuǎn)緣雜交的不育性等特點(diǎn)而倍受園藝育種學(xué)家的青睞。多

3、倍化導(dǎo)致植物基因組發(fā)生部分或全部的重復(fù)，其后伴隨著DNA排除、ZW4同質(zhì)化、基因沉默和染色體重排等，從而改變了二倍體祖先基因組中基因連鎖關(guān)系、遺傳平衡及遺傳修飾式樣賦予多倍體基因組新的細(xì)胞遺傳學(xué)特性，使之在細(xì)胞形態(tài)、核型特征以及基因表達(dá)等方面表現(xiàn)出極大的生物學(xué)多樣性，從而加速物種的進(jìn)化。經(jīng)典理論認(rèn)為，植物天然多倍體基因組主要起源于體細(xì)胞有絲分裂異常、未減數(shù)分裂配子融合和種間雜交三個途徑。目前的研究，特別是2019年擬南芥全基因組測序完成之后，多倍體的認(rèn)識有了新的概念，像擬南芥這種典型的二倍體植物，基因組極小，但卻是一個典型的endopolyploid,在生長過程中存在普遍的基因組多倍化事件，科

4、學(xué)家研究認(rèn)為是基因組的表達(dá)需要而使得擬南芥在生長過程中基因組不斷的復(fù)制自我，因此，自身的基因型以及內(nèi)源加倍在目前也被認(rèn)為是多倍體產(chǎn)生的一個重要途徑人工誘導(dǎo)多倍體的方法很多(在以大蒜根尖多倍體鑒定中)已詳細(xì)說明，分為物理的(溫度劇變、機(jī)械損傷、各種射線處理等)和化學(xué)方法的(各種植物堿、麻辭劑、植物生長激素等)誘導(dǎo)方法。其中，秋水仙素是誘導(dǎo)多倍體的最有效的方法之一。秋水仙素是從百合科秋水仙素屬的一個種，秋水仙(Colchicumautumnale.L.)的器官和種子內(nèi)提煉出來的一種植物堿。它的化學(xué)分子式為C22H25O6N因有劇毒，故使用時要特別注意，切勿使藥液進(jìn)入眼內(nèi)或口中。秋水仙素的作用在于阻

5、止分裂細(xì)胞形成紡錘絲，而對染色體的結(jié)構(gòu)和復(fù)制無顯著影響。濃度適合，藥物在細(xì)胞中擴(kuò)散后，不致發(fā)生嚴(yán)重的毒害，細(xì)胞經(jīng)一定時期后仍可恢復(fù)正常，繼續(xù)分裂，只是染色體數(shù)目加倍成為多倍性細(xì)胞，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)育成為多倍體植物。2. 實(shí)驗(yàn)材料2.1 .試驗(yàn)材料擬南芥種子0.1%的秋水仙素，MS培養(yǎng)基，花泥培養(yǎng)皿，Parafilm封口膜，超凈工作臺等2.2.實(shí)驗(yàn)方法2.2.1.MS培養(yǎng)基的配置先配制母液，再按照所需培養(yǎng)基的量，量取所需體積；按照每1000ml7g、30g的比例加入瓊脂和白砂糖。之后，加水至接近所需體積，調(diào)節(jié)pH至5.86.0,然后定容。2.2.2. 消毒處理2.2.2.1. 種子消毒：選取

6、完整且顆粒飽滿的擬南芥種子，先用70%的乙醇在離心管中消毒處理1分鐘；在換用2.5%的次氨酸鈉溶液處理3分鐘；之后立即用清水清洗4-5次。2222器具消毒：將培養(yǎng)皿、離心管、移液槍頭，以及配置好的MS所需無菌水、配好的秋水仙素放入手動高溫高壓滅菌鍋中，消毒滅菌。2.2.3. 鋪板將消好毒的種子放入離心管中，加入懸浮液(0.3%0.5%的瓊脂溶液)，此時擬南芥種子會懸浮在液體中，用移液槍吸取種子，均勻的涂抹在培養(yǎng)板上。然后將培養(yǎng)板一道22C的有光培養(yǎng)室中培養(yǎng)。2.2.4.不同處理誘導(dǎo)多倍體表1：處理方法編號AB水仙素0.1%秋水仙素的水溶液上B1、B2,繼續(xù)培養(yǎng);MS培養(yǎng)基上，編號鋪板后，在處理

7、1、2、3、4天后，分別取一部份種子移入新的純?yōu)镃1、C2、C3c4,繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)基純MS培養(yǎng)基純MS培養(yǎng)基+0.1%秋鋪板后，正常培養(yǎng)；鋪板后，正常培養(yǎng)15天，將所得幼苗分別移入兩個純MS培養(yǎng)板處理方法21鋪板后，處理1、2天后，分別取一部份種子移入新的純MS培養(yǎng)D清水基上，編號為D1vD2O2.2.5.移苗在處理的幼苗長到四葉期（一半需要兩周左右）時，準(zhǔn)備花泥，將幼苗移入花泥中繼續(xù)培養(yǎng)。移苗時，小心用鏡子從培養(yǎng)皿中連根取出小苗，把苗種入花泥中。移苗結(jié)束后，用保鮮膜覆蓋12天后揭膜，如果苗很弱，則在此基礎(chǔ)上還需多覆蓋幾天。（在花泥中種植時，苗期不需要添加營養(yǎng)液，開始抽苔時及時添加營養(yǎng)液，一

8、般需要添加2次，每次加入1升擬南芥營養(yǎng)液，2次添加最好間隔一段生長時期（710天）。）3. 結(jié)果及討論3.1.表2：后期處理及結(jié)果編號AB1B2C1泥培養(yǎng)C2純MS培養(yǎng)長的跡象，但并未生根，最終還是變黃，死亡;C3純MS培養(yǎng)有生長跡象，很快變黃，死亡；C4純MS培養(yǎng)生長跡象，很快變壞，死亡；D1純MS培養(yǎng)正常植株；D2純MS培養(yǎng)長成正常植株；在D中培養(yǎng)一天后，種子萌發(fā)，長出嫩葉；移入D1后，種子在D中培養(yǎng)一天后，子萌發(fā)，露白；移入D1后，種子長成在C中培養(yǎng)三天，種子已見兩片綠色葉片；移入之后，無在C4C中培養(yǎng)三天，種子已見綠色葉片；移入C3之后，基本沒但相對正常植株，仍顯矮壯，在四葉期之后移入

9、花泥中；在C中培養(yǎng)兩天，種子已見綠芽；移入C2之后，仍有繼續(xù)生培養(yǎng)方式移入花泥培養(yǎng)純MS培養(yǎng)純MS培養(yǎng)純MS培養(yǎng)，之后移入花最終效果部分植株變黃枯萎；大部分能夠正常生長;在B中約10天后，已經(jīng)長到兩葉期，但是之后一直沒長；移到B1、B2后，綠色漸漸褪去，最終變黃死亡；在C中培養(yǎng)一天，種子已經(jīng)萌動，露白；移入C1長勢較好，3.2. 植株外觀均是在4月21日同時處理并播種到培養(yǎng)皿上的，在不同處理下，都培養(yǎng)了20天，所觀察到的不同植株外觀。3.2.1.A植株正常培養(yǎng)，未做任何處理，正常植株，根細(xì)長，比地上部分要長出很多。但人比學(xué)長們所培養(yǎng)的擬南芥植株要小，初步分析是因?yàn)槲覀兣囵B(yǎng)板上縮到的培養(yǎng)基過少。

10、理論上，直徑9cm的培養(yǎng)皿，所加M.S.培養(yǎng)基2530ml,培養(yǎng)基過少會出現(xiàn)我們的情況，導(dǎo)致植株生根很短，植株個體過?。慌囵B(yǎng)基過多，導(dǎo)致植株上部生長空間過小，以不利于植株的培養(yǎng)觀察。3.2.1. 圖2為根部放大。3.2.2.3.2.3. B植株（B1、B2的處理完全一樣）在B中培養(yǎng)15天左右，后轉(zhuǎn)入純MS培養(yǎng)基中，秋水仙素起到了使染色體加倍的作用所得植株基本可以確定為多倍體。而且植株明顯矮壯,根粗極短，長出的可以吸收營養(yǎng)物質(zhì)的根須也很短、很少,這也預(yù)示著這樣植株注定不可能成活。圖3為整株；圖4為根部放大。圖3圖43.2.4. C植株C1中的植株是在0.1%秋水仙素的水溶液處理1天后轉(zhuǎn)入純MS培

11、養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的植株，種子在C中時已經(jīng)萌動，露白，可以肯定秋水仙素在種子的早期有絲分裂中起到了使染色體加倍的作用。后期植株情況也顯示出多倍的特性：植株粗壯,但相對矮??；根部亦比正常植株粗短，但是沒有長出可以吸收營養(yǎng)物質(zhì)的根須.看上去更像是棱角分明塊狀的根。圖5、圖6為C1植株；圖7、圖8為C2植株；C3c4的處理，并未得到可見的有根、有葉的植株。圖5圖6圖7圖83.2.5. D植株D植株是在清水中發(fā)芽（1、2天），后轉(zhuǎn)入純MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。雖然并未用秋水仙素處理，但是從根的外觀來看，與正常植株仍有差距，又很明顯的主根分叉，沒有根須，與A中的正常植株相比，根仍顯粗短。初步原因分析是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)過程中，由于多次被污染，我們幾次轉(zhuǎn)移植株，對植株可能造成了較大的損傷。圖9為D1植株。圖94. 注意事項1)MS培養(yǎng)基的配置：注意各母液在4c保存；一般先將MS容液定容到接近所需體積，再調(diào)整pH(因?yàn)轶w積變化很小時，對pH的影響微乎其微)，最后加上瓊脂粉；2)懸浮液：擬南芥種子所用的懸浮液為0.3%0.5%的瓊脂溶液；不同的鋪板方法可以不需要懸浮液；3) 消毒問題：消毒時間一定把握好，由于擬南芥種