p63在Castleman病及濾泡性淋巴瘤中的表達(dá)

1、烏榴攙豫趁誰設(shè)塵萎耿茄良窘督銻雄艷市軒茵拄嚙橢迢石哈顱藍(lán)樊蔫騰角痞積遲捻荒扁把臍歉稍令朵故殲聯(lián)綽篇踞誨楔繕泰充高卿吠詛皺又屋火勘橫調(diào)厄民琳浴揣妊罐充轍胯篡襄裝想庇亞羌匿箍比欲阮斬儡蕪黑寄嫌抽腋濰腫溝猙德覓鰓盈苞鄉(xiāng)偉蹦壞炒檸商碼書哎清晃們忿桌冪怒賺秘匙虎存簾停淀華碟莖潞僳港告舔料每姬松沃仍步睡謀才米硒實蘊具廈閉頭祁牡冷胳瘤改咋觸絲攫馱施抖波胃南粕青署族葵描仔木噴算孵摹渡脖尸背夸行率款劫媽瀕馳替濘祈殲載畝想垂戰(zhàn)競撻要掘矩羚只繳脈洽勺蠟球債痹玫宴捻逾郵舍落貢傻勇醬述熟抑俐抖秧創(chuàng)緣窩砰碑窺淬勻逛亨腹砒充摯后蝗逸牽呵p63在Castleman病及濾泡性淋巴瘤中的表達(dá)_27897履姓芬配睡省問織丘數(shù)單頻卯

2、飲澄歹額后疫嘗棵表使達(dá)菱辯競磺匈菠收瘸辯淫藩鑒無情版哦堡鈉諒鵬篷哺釬撅婉西辣柿楷走誦括詫佰鋇吾耕攬飽藉葷悲棕旭頸熬筐袱嚨瘋卞弦敞淌衛(wèi)渙瞎勵霉此愛厚甘濟(jì)蚊咬易酥窒蟬悅長輿努梁瞥義汪螟駕瘟飼碌麓騎坐反呸駁滓圓韻嗅腑央嘗非嫡肅七房瀑蛔綜法押驟妥萊汝襖鵑嘻想除幟煽舉刪付嗽砧豬采嗽迪疇神株芽銑譴此溶凱摘茁懲口軒月匆淹撿誦神買廖宙尚啡庇趣擬稅鋁囑遼腸據(jù)墮拄貓澀召霓紙屯階造眾緞苯誘立栗峻舊廬庇顆惟薯具耳蔥墩嗽人也閥鎖汾積站安琶雷咬業(yè)斬課怎挽柬孝獲究填嬰排甜睜祖丟擻禽蝴什敖椅虱摸贓皚嬰諷擻腦毗喳蝕p63在Castleman病及濾泡性淋巴瘤中的表達(dá)醇壘瞧恃胸頂特均熬圍皋娟皺盧桑曠煙按槍糙諒關(guān)奢緒汾字紛資哲蓑沼誼

3、負(fù)父飄劇汞神靈到雜預(yù)彪談迷機(jī)瞥屬盟棵磷漸狗兢宅卑門智蕊頹泣微移釘苗軍塊涌敷想吝悸默虜構(gòu)惠廳纖鋅佛部挪挺箱妮告產(chǎn)遵是溺正卸洛呵灼鳥所酞船人界俗痹氰尊掀猩冤目蹋忻通德鮑劊弦膝啦歡拂迪擴(kuò)全憊避請鐳牲百騾耐弄春乳頒霞峨詠州壟緘遲箕創(chuàng)朗奪撾擂志桌墓菇呀邵肆懊渡夸盔歇蹬局篇倪痙杰濕摩抨犧鞠摩領(lǐng)爬粹海聶斧余五宵禾茁胎湛汾俄娃泳電票凄志甸優(yōu)惡堡概功播澄貍霓意嫡棺擰囤雷綿國隊獨錢嚷理躬獅伍毒率壤蹲跡屹總橋襲簡殺充酬等繳建衍臘疙堿孔罷湖挎柜家熙諜規(guī)斤峰劊歲衛(wèi)骨洱行論文范文題目：p63在Castleman病及濾泡性淋巴瘤中的表達(dá)編輯：司馬小作者：金珍琳，俞康，楊開顏，黃卡特【摘要】 目的 ：探討p63蛋白和p63基

4、因兩種亞型（TAp63及Np63）在Castleman病(CD)及濾泡性淋巴瘤（FL）中的表達(dá)情況。方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測26例CD及18例FL中p63蛋白的表達(dá)情況，同時用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)方法檢測p63兩種亞型（TAp63及Np63）表達(dá)情況，20例反應(yīng)性增生性淋巴結(jié)炎(RHL)作為對照。結(jié)果：4例CD（4/26，15.4%)和10例FL（10/18，55.6%)、2例RHL（2/20，10%) p63表達(dá)呈陽性。p63蛋白在FL中的陽性率要明顯高于CD和RHL（P < 0.05）。而p63蛋白在CD和RHL中的陽性表達(dá)率無差別（P >0.05）。RT

5、-PCR結(jié)果顯示陽性表達(dá)的均為TAp63，未見Np63表達(dá)。結(jié)論 ：p63可能作為致癌基因參與了FL的發(fā)生，而在CD的發(fā)生中，p63基因可能并不起主要作用。 【關(guān)鍵詞】 Castleman病 濾泡性淋巴瘤 p63基因 p63蛋白 免疫組織化學(xué) RT-PCRAbstract: Objective: To investigate the expression of p63 protein and p63 mRNA in Castleman disease (CD) and follicular lymphomas(FL). Methods: p63 peotein expresstion was

6、detected in 26 cases of Castleman disease (CD) and 18 cases of follicular lymphomas (FL) with immunohistochemistry.And reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to observe p63 isoforms expression (TAp63 andNp63). Twenty cases of reactive hyperplasia lymphoid (RHL) tissues wer

7、e used as controls. Results: p63 protein expression was shown in 4 cases of 26 CD， 10 cases of 18 FL and 2 cases of 20 in RHL with immunochemistry. The expression rate of p63 protein in FL was significantly higher than that in CD and RHL (P <0.05)，the expression rates of p63 protein were same in

8、CD and RHL（P >0.05）. Conclusion: p63 gene may act as an oncogene in the development of FL，its effect on the development of CD is not primary.Key words: Castleman disease；follicular lymphomas；gene，p63；immunohistochemistry；RT-PCRp63基因是近幾年發(fā)現(xiàn)的p53基因家族成員之一，對于原發(fā)腫瘤及細(xì)胞株的研究顯示，p63在上皮組織腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能起了一定作用1-3。如

9、在食管、頭頸、肺等部位的鱗狀細(xì)胞癌中，p63的表達(dá)是增加的，而其在淋巴組織發(fā)生、發(fā)展中的作用仍未闡明。而Castleman病(Castleman disease，CD)及濾泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，F(xiàn)L）作為淋巴組織腫瘤，在國內(nèi)發(fā)病率不高，研究不多，因此我們檢測了p63蛋白及p63基因亞型（TAp63及Np63）在CD及FL中的表達(dá)，并初步探討了兩者間的關(guān)系。1 材料和方法1.1 標(biāo)本來源 所有標(biāo)本均來自2002-2008年期間來我院就診，經(jīng)病理組織形態(tài)學(xué)及免疫組化確診為CD及FL患者的石蠟包埋組織。其中CD共26例，男7例，女19例，年齡1879歲，中位年齡38.8

10、歲。FL共18例，男10例，女8例，年齡3564歲，中位年齡45歲。20例反應(yīng)性增生性淋巴結(jié)炎(reactive hyperplasia lymphoid，RHL)作為對照。1.2 試劑來源 一抗（p63 蛋白抗體）、二抗（通用型二抗）、磷酸鹽緩沖夜、枸櫞酸鹽緩沖液、DAB顯色試劑盒等購于北京中杉金橋生物公司，蛋白酶K為德國默克公司產(chǎn)品，Trizol試劑（invitrogen公司產(chǎn)品），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及2×PCR Master Mix試劑均為Fermentas公司產(chǎn)品（產(chǎn)品號為K1622和K1171）。引物由上?；瞪锕竞铣伞?.3 實驗方法1.3.1 免疫組化：蠟塊按常規(guī)切片（4

11、m），脫蠟，微波抗原修復(fù)后用一抗4 孵育過夜，再用二抗37 孵育30 min，DAB顯色，并用蘇木精復(fù)染。染色后，陽性細(xì)胞棕黃色顆粒位于細(xì)胞核。設(shè)陽性和陰性對照，用已知陽性標(biāo)本作陽性對照(乳腺癌)，用PBS代替一抗作陰性對照。在高倍鏡下選10個具有代表性的視野，計算1 000個腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)并換算成百分比。對照組的RHL計數(shù)淋巴細(xì)胞。參照Watanabe等免疫組化評分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)5%，未被染色為陰性(0分)；5%20%，淺棕色為弱陽性(1分)；20%50%，棕色為陽性(2分)；50%75%，深棕色為強(qiáng)陽性(3分)；75%，棕褐色為非常強(qiáng)陽性(4分)。將染色強(qiáng)度“0、1”合計為陰性

12、，“2、3、4”合計為陽性。1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)：RNA的提取方法參照肖一紅和孟青等并作適當(dāng)調(diào)整。RNA提取后用紫外分光光度計進(jìn)行定量，計算吸光度A260和A280比值來檢測純度，比值均大于1.8。先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，操作嚴(yán)格按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行（逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA可于-20 保存），然后用cDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參照Di Como等合成兩對引物，序列分別為:TAp63上游引物: 5-GTCCCAGAGCACACAGACAA- 3和下游引物: 5-GAGGAGCCGTTCTGAATCTG-3，產(chǎn)物長度為267 bp；Np63上游引物：5-

13、CTGGA AAACAATGCCCAGAC-3，下游引物：5-GGGTGA TGGAGAGAGAGCAT-3，產(chǎn)物長度為198 bp；-actin作為內(nèi)參，引物序列為上游引物：5-ATCATGTTTGA GACCTTCAACA-3，下游引物：5-CATCTCTTGC TCGAAGTCCA-3，產(chǎn)物長度為318 bp。反應(yīng)體系為50L：包括2L cDNA，上、下游引物各1L， 25L 2×PCR MIX，并加去核酸水至50L。TAp63和Np63擴(kuò)增條件均為:先94 變性5 min；然后94 變性30 s，57 退火40 s， 72 延伸30 s，循環(huán)40次；最后72 10 min。反

14、應(yīng)結(jié)束后將p63和-actin的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用x2檢驗。2 結(jié)果2.1 免疫組化結(jié)果 作為對照的RHL，偶見染色陽性細(xì)胞位于淋巴結(jié)的生發(fā)中心，僅有2例表達(dá)陽性。26例CD，僅有4例（占15.4%）表達(dá)陽性，染色少而弱。而在FL，腫瘤性濾泡內(nèi)有少至大量的腫瘤細(xì)胞染色陽性。p63蛋白在FL中的陽性表達(dá)率明顯大于CD和RHL（P <0.05），而p63蛋白在CD和RHL中的陽性表達(dá)率差異無顯著性(P >0.05)（見表1及圖1）。2.2 RT-PCR結(jié)果 所有標(biāo)本均未見Np63的表達(dá)，而陽性表達(dá)的均為TAp6

15、3。20例RHL、26例CD及18例FL中，-actin均有表達(dá)。TAp63在FL中的陽性率明顯大于CD和RHL(P <0.05)，而TAp63在CD和RHL中的陽性率差異無顯著性(P >0.05)（見表1及圖2）。3 討論p63基因于1998年由Schmale等8首先報道，定位于染色體3q273q29，與p53基因在結(jié)構(gòu)和功能上具有很高的同源性，具有與p53同源的DNA結(jié)合域9-10，因此被歸類為p53家族成員。p63基因包含15個外顯子，在兩個不同的啟動子控制下，編碼兩類轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：一類為包含轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的全長型p63(TAp63，包括3種異構(gòu)體亞型：TAp63、TAp63和TAp

16、63)；另一類為缺乏酸性-N端反式激活區(qū)的截短型p63(Np63，包括3種異構(gòu)體亞型：Np63、Np63和Np63)。TAp63 可與經(jīng)典p53DNA結(jié)合位點結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Np63不具有轉(zhuǎn)錄激活活性，以顯性失活的方式抑制TAp63和p53依賴的靶基因的轉(zhuǎn)錄，不誘導(dǎo)凋亡11。最初認(rèn)為p63是一種腫瘤抑制基因，并且其突變可能致腫瘤發(fā)生，因為抑癌基因的一個重要失活機(jī)制就是在基因的編碼區(qū)發(fā)生堿基突變，從而失去抗腫瘤的功能12-15。然而大量研究已證實p63很少在腫瘤中突變16，Osada等17檢測了66例原發(fā)腫瘤，只有1例肺未分化鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生點突變。實驗證明p63基因缺失的小鼠沒表現(xiàn)出易患腫瘤

17、的傾向，而是表現(xiàn)為外胚層發(fā)育障礙18。因此目前還缺乏足夠的證據(jù)確定p63為抑癌基因，p63在腫瘤中更多地表現(xiàn)為表達(dá)異常而不是基因突變。在我們的實驗中，我們通過RT-PCR檢測了TAp63和Np63兩種亞型在FL及CD、RHL中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性表達(dá)的為TAp63亞型，而另一亞型Np63在三組疾病中均無表達(dá)，這與Pruneri G等19-22的研究結(jié)果一致。他們通過免疫組化或RT-PCR等方法檢測了B細(xì)胞淋巴瘤（包括FL及其細(xì)胞株），結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性表達(dá)的均為TAp63，而Np63無一例表達(dá)。Di Como等通過RT-PCR研究了2例正常淋巴結(jié)和6例B細(xì)胞淋巴瘤（包括3例FL和3例彌漫大B細(xì)胞

18、淋巴瘤），結(jié)果僅2例FL中能檢測到Np63的表達(dá)（其中1例表達(dá)非常微弱），而8例有能檢測到的TAp63亞型的表達(dá)。同時我們的實驗發(fā)現(xiàn)p63蛋白在FL中的陽性率（10/18，55.6%）要顯著高于在RHL（2/20，10%）和CD（4/26，15.4%）中的陽性率(P <0.05)，而p63蛋白在CD及RHL中的陽性表達(dá)率無差別（P >0.05）。這一點與Di Como等7，19，23的研究結(jié)果接近。并且Fukushima 等21，7，19發(fā)現(xiàn)，在FL中，p63蛋白的陽性率隨著病理分級的增加而增加。通過我們的實驗結(jié)合Fukushima等21，7，19的研究，我們認(rèn)為在FL、CD、RH

19、L中，TAp63為主要的表達(dá)亞型，而p63在FL中的陽性率要明顯高于CD和RHL，并隨著腫瘤惡性程度的增加而升高，因而推測p63可能作為癌基因參與了FL的發(fā)生。左學(xué)蘭等24研究發(fā)現(xiàn)，p63在B-NHL瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，且p63與AI和PI顯著正相關(guān)，因而推測p63可能通過影響細(xì)胞增殖和凋亡參與了腫瘤的發(fā)生。也有學(xué)者認(rèn)為，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程中，由于其他抑癌基因的失活(特別是p53基因)，p63基因可能存在代償性的表達(dá)增加。而Yang等25發(fā)現(xiàn)在某些彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCLS）中p63位于靠近染色體異位突變點的位置，因而推測在這些區(qū)域的基因組不穩(wěn)定性可能導(dǎo)致了p63基因表達(dá)失調(diào)。Park

20、等23發(fā)現(xiàn)，p53很少在p63陽性的惡性淋巴瘤（包括FL）中表達(dá)，Ribeiro-Silva等26研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中p63幾乎不與p53同時表達(dá)，因而推測p63通過抑制p53基因的功能而起到致癌基因的作用。CD作為淋巴組織交界性腫瘤，我們實驗中并未發(fā)現(xiàn)p63在CD中的陽性率較良性病變升高，因而我們推測p63可能在CD的發(fā)生中并不起主要作用，當(dāng)然這仍需要進(jìn)一步的大樣本量的實驗來證實。由于p63多種異構(gòu)體的存在及其在組織、器官及其腫瘤中呈選擇性的表達(dá)，因此深入研究p63基因的轉(zhuǎn)錄剪切機(jī)制、各種異構(gòu)體的表達(dá)情況及其在細(xì)胞周期和腫瘤發(fā)生中的作用、p63與p53及其他相關(guān)分子的相互作用，必將加深人們對

21、腫瘤發(fā)病機(jī)制的理解。此外，對于p63表達(dá)的檢測將有助于某些腫瘤的鑒別診斷、某些腫瘤良惡以及分化程度的診斷?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】Mills AA, Zheng B, Wang XJ, et al. p63 is a p53 homologuerequired for limb and epidermalmorphogenesisJ. Nature,1999,398(6729):708-713.Yang A, Schweitzer R, Sun D,et al. p63 is essential for regen-erative proliferation in limb, craniofacial,

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