云南白藥對自發(fā)性高血壓大鼠腎臟炎癥狀態(tài)的改善作用

1、云南白藥對自發(fā)性高血壓大鼠腎臟炎癥狀態(tài)的改善作用                    作者：田登科， 陳剛領(lǐng)， 李亞娟， 胡送友， 劉俊，卞卡【摘要】  目的觀察云南白藥(YNBY)對自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)腎臟炎癥狀態(tài)的影響，探討其對高血壓腎臟疾病的防治作用及機制。方法將6周齡SHR分為YNBY組和高血壓模型對照組，在3個時間點(給藥6周，給藥14周，停藥后9周)研究YNBY對SH

2、R血壓值、腎臟炎性因子表達和氧化應(yīng)激水平的影響。結(jié)果YNBY對SHR無明顯降壓作用(P>0.05)。YNBY在mRNA和蛋白水平抑制了細胞間粘附分子-1(ICAM-1)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)在SHR腎臟的高表達(P<0.05)。 YNBY在給藥14周和停藥9周時降低了過氧化物酶體增殖物活化受體(PPAR)的mRNA表達(P<0.05)，在給藥14周時明顯降低了PPAR的蛋白表達(P<0.05)。YNBY給藥后顯著降低了SHR腎臟組織蛋白羰基化水平(P<0.05)，在給藥14周及停藥9周后均可顯著提高SHR腎臟總抗氧化能力(P<0.05)。結(jié)論YNB

3、Y給藥后能夠顯著減輕SHR腎臟炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平，YNBY可能在防治高血壓腎病方面具有一定的療效。 【關(guān)鍵詞】  云南白藥; 自發(fā)性高血壓大鼠; 高血壓腎臟疾病; 炎癥反應(yīng)Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of YunNanBaiYao(YNBY)on inflammatory status of the kidney from spontaneously hypertensive rats (SHR), and to explore preventive and therapeutic usage of YNBY on h

4、ypertensive nephropathy. Methods6 weeks old SHR were divided into SHR control group and SHR-YNBY group.The effects of YNBY on systolic blood pressure, expression of inflammation-related factors and level of oxidative stress were determined at 3 time points: 6 weeks of YNBY treatment; 14 weeks of YNB

5、Y treatment; and 9 weeks post-YNBY treatment.ResultsYNBY did not affect the elevation of blood pressure of SHR(P>0.05). However, the TCM compound inhibited the expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) at both mRNA and protein levels (P&

6、lt;0.05). At the time points of 14 weeks of treatment and 9 weeks post-treatment, HMP significantly attenuated peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) mRNA expression (P<0.05). The protein level of PPAR was also inhibited by YNBY markedly after 14 weeks of treatment (P<0.05). YNBY si

7、gnificantly reduced protein carbonyl contents of SHR kidney (P<0.05). In addition, after 14 weeks of treatment, YNBY increased total anti-oxidant capacity of renal tissue from SHR (P<0.05) and this elevated anti-oxidant capacity was even maintained for 9 weeks after treatment (P<0.05). Conc

8、lusionYNBY can reduce the inflammatory status and oxidative stress of SHR kidney, which may serve as the base for the advanced therapeutic utility of YNBY in hypertensive renal disease.Key words：YunNanBaiYao (YNBY); Spontaneously hypertensive rat (SHR); Hypertensive nephropathy; Inflammation腎臟是高血壓的重

9、要靶器官之一。最近研究表明，炎癥反應(yīng)不僅參與了高血壓疾病的發(fā)生，更是與高血壓心、腦、腎等多個靶器官損害密切相關(guān)1。炎癥反應(yīng)不僅可導(dǎo)致腎臟纖維化和腎單位的損傷，同時也參與了腎小球濾過膜的破壞，因此抗炎相關(guān)治療已經(jīng)成為防治高血壓腎臟疾病新的重要環(huán)節(jié)。云南白藥(YNBY)由云南民間醫(yī)生曲煥章于1902年研制成功，具有活血消腫、止血止痛的功效，臨床上可有效應(yīng)用于多種出血性疾病的治療2。近年來隨著中醫(yī)藥學(xué)化研究的深入，YNBY的臨床應(yīng)用也在不斷地得到拓展。本研究將觀察YNBY對SHR腎臟炎癥狀態(tài)的影響，進一步明確其作用環(huán)節(jié)和機理，為開拓其在防治高血壓腎臟疾病方面的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。1 材料與儀器1.1

10、實驗動物與藥物SPF級SHR 48只，WKY大鼠24只，均為雄性，6周齡，購自中科院上海實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(滬)2007-0005。YNBY購自云南白藥集團公司(批號20051005)。1.2 試劑與儀器Trizol 試劑購自美國Sigma-Aldich 公司;RT-PCR 試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司;引物合成自上海生工生物工程技術(shù)有限公司;抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology Inc公司。PCR擴增儀：德國Biometra 公司;GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)：上海天能科技有限公司;無創(chuàng)尾動脈血壓測定分析系統(tǒng)：上海奧爾科特生物科技有限公司;酶

11、標(biāo)儀Spectra Max 190：美國Molecular Devices公司;分光光度計UV-1700：日本Shimadzu公司。其它試劑為國產(chǎn)分析純。2 方法2.1 動物分組及給藥將48只SHR隨機分為YNBY組和高血壓模型組，每組24只，以24只同周齡的WKY大鼠為正常對照。將YNBY溶于蒸餾水中灌胃給藥，藥物濃度為20 mg/ml，日用藥量為200 mg/kg,SHR模型組和WKY對照組大鼠每日按10 ml/kg灌胃蒸餾水。分別在給藥6周、給藥14周和停藥9周后分3批處理動物。2.2 檢測指標(biāo)2.3 統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)以±s表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行單因素方

12、差分析。3 結(jié)果3.1 YNBY對SHR血壓值的影響結(jié)果見表2。模型組SHR收縮壓較正常對照WKY大鼠明顯升高(P<0.05)。給藥YNBY 6周，14周及停藥9周后，SHR的收縮壓與模型組大鼠比較無明顯差異(P>0.05)。表2 YNBY對SHR血壓值的影響與WKY組比較，P<0.05;與SHR模型組比較，P>0.05;n=83.2 YNBY對SHR腎臟ICAM-1和eNOS表達的影響見圖1(a)、1(b)、1(c)，模型組大鼠腎臟eNOS和ICAM-1的mRNA表達顯著高于正常組(P<0.05)，YNBY治療后(給藥6周，給藥14周，停藥9周)可顯著降低SHR

13、腎臟eNOS和ICAM-1的mRNA表達水平(P<0.05)。如圖2(a)、2(b)、2(c)所示，與WKY大鼠比較，模型組SHR腎臟可見eNOS和ICAM-1蛋白的高表達(P<0.05)。在各處理批次(給藥6周，給藥14周，停藥9周)YNBY均能夠顯著降低eNOS 和ICAM-1的表達水平(P<0.05)。3.3 YNBY對SHR腎臟PPAR表達的影響如圖1(a)、1(d)所示，模型組大鼠腎臟PPAR mRNA表達顯著高于正常組(P<0.05)。YNBY給藥6周后對PPAR的表達無明顯影響(P>0.05)，在給藥14周和停藥9周后可明顯降低其mRNA水平(P&l

14、t;0.05)。如圖2(a)、2(d)所示，與WKY大鼠比較，在各處理周齡模型組大鼠PPAR的蛋白表達均有明顯提高 (P<0.05)。YNBY在給藥6周及停藥9周后對PPAR的蛋白表達無明顯影響(P>0.05)，而在給藥14周時能夠顯著抑制PPAR的高表達(P<0.05)。3.4 YNBY對SHR腎臟總抗氧化能力的影響見表3。模型組SHR在20，29周齡時腎臟總抗氧化能力相對于WKY大鼠明顯降低(P<0.05)。YNBY給藥6周后，SHR總抗氧化能力與模型組大鼠比較有提高趨勢(P>0.05)，在給藥14周和停藥9周時SHR腎臟總抗氧化能力明顯提高(P<0.0

15、5)。表3 YNBY對SHR腎臟總抗氧化能力的影響3.5 YNBY對SHR腎臟蛋白羰基化水平的影響見表4。與WKY組比較，SHR模型組腎臟蛋白羰基化水平顯著提高(P<0.05)。YNBY給藥后，SHR蛋白羰基化水平與SHR模型組大鼠比較明顯降低(P<0.05)。表4 YNBY對SHR腎臟蛋白羰基化水平的影響與WKY組比較，P<0.05;與SHR模型組比較，P<0.05;n=84 討論腎臟是高血壓的重要靶器官之一,高血壓腎病可導(dǎo)致很高的高血壓病致死、致殘率。目前關(guān)于高血壓腎臟損傷的發(fā)病機理有許多學(xué)說和解釋，國際最新研究表明發(fā)生于腎臟的慢性炎癥反應(yīng)是高血壓腎臟損傷的重要病變

16、因素。成年SHR腎臟纖維化、蛋白尿和肌酐清除率降低明顯，同時伴隨著腎臟炎癥因子的高表達和氧化應(yīng)激的發(fā)生3，4。YNBY自從20世紀初行銷于世以來，譽滿中外，歷久不衰，被譽為傷科圣藥。我們研究中心首次對YNBY的心血管系統(tǒng)現(xiàn)代藥作用進行了創(chuàng)新性審視，認為YNBY可能在抑制炎癥反應(yīng)、保護血管內(nèi)皮、降低氧化應(yīng)激方面具有一定作用，而有關(guān)YNBY在此方面的應(yīng)用卻未見報道。本研究將通過觀察YNBY對SHR腎臟炎癥狀態(tài)的影響，探索其對高血壓時腎臟損害的保護作用及機理。1         動脈壓增高是高血壓時腎臟發(fā)生病變的重要誘因

17、。然而研究表明，在血壓未升高的幼齡SHR腎間質(zhì)中便存在著單核/巨噬細胞的浸潤和NADPH氧化酶的活化，這表明炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激可能不依賴于血壓值的增高而引發(fā)腎臟損傷5。在保護高血壓靶器官損傷、降低高血壓各種臨床終點事件中，降壓也并非是唯一重要的療法，這可以從HMP及他汀類藥物能夠獨立于血壓值之外減輕高血壓并發(fā)癥中得到證明6，7。腎臟炎癥反應(yīng)發(fā)生時，腎小管上皮細胞ICAM-1 和血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)表達增加，二者可能介導(dǎo)了白細胞從小管周圍毛細血管內(nèi)皮細胞到腎臟間質(zhì)的遷移8。成年SHR腎小球細胞和血管內(nèi)皮細胞ICAM-1蛋白表達明顯提高，大量單核細胞浸潤腎小球，24h尿蛋白量增多，

18、并且核轉(zhuǎn)錄因子-B (NF-B)的活化與ICAM-1的表達及單核細胞浸潤、尿蛋白量均呈明顯正相關(guān)9，提示原發(fā)性高血壓時活化的NF-B可通過上調(diào)腎組織ICAM-1 基因表達，促進單核細胞浸潤腎組織從而引發(fā)腎臟損害。生理條件下由eNOS產(chǎn)生的NO在調(diào)節(jié)血管張力、抑制血小板聚集和白細胞黏附、抑制血管平滑肌細胞(VSMC)增殖方面起了重要作用。然而在多種病理狀況下往往伴隨著eNOS脫偶聯(lián)的現(xiàn)象，此時eNOS不再產(chǎn)生NO而是產(chǎn)生大量的氧自由基，而且過氧化氫能夠刺激eNOS在血管壁的代償性增高10，11。實驗結(jié)果表明SHR腎臟eNOS較WKY明顯提高，提示SHR腎臟eNOS脫偶聯(lián)病理現(xiàn)象的存在。YNBY能

19、夠顯著降低SHR腎臟eNOS的表達水平，表明YNBY可通過干預(yù)eNOS脫偶聯(lián)的現(xiàn)象而起到腎臟的保護作用。同時在本研究中，YNBY在mRNA和蛋白水平降低了SHR腎臟ICAM-1的表達，提示YNBY對發(fā)生于SHR腎臟的慢性低度炎癥反應(yīng)具有顯著的抑制作用。PPAR具有抗炎和抗氧化作用。在Fischer 344大鼠腎臟中PPAR通過抑制p65核易位和NF-B的結(jié)合活性，從而降低了誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、 環(huán)氧合酶-2(COX-2)、 IL-1、 IL-6和VCAM-1的表達12。在原代培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞中PPAR可同時上調(diào)銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)的表達和下調(diào)還原型煙酰胺腺嘌呤二

20、核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶亞單位phox22的表達13。然而，在腎臟纖維化實驗動物模型中PPAR卻呈高表達，而且羅格列酮降低了PPAR的表達水平14，15。與此相似本研究發(fā)現(xiàn)PPAR在SHR腎臟組織中高表達，這可能是機體對炎癥及氧化損害所發(fā)生的一種代償性反應(yīng)，推測YNBY對炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的抑制可能是下調(diào)PPAR表達的作用機理。同時在本研究中YNBY后對PPAR的mRNA和蛋白表達雖有降低作用，但沒有出現(xiàn)同步變化?？紤]到PPAR的轉(zhuǎn)錄活性不僅與其mRNA及蛋白表達水平有關(guān)，還與PPAR翻譯后修飾如泛素化和N-末端磷酸化、抑制劑調(diào)節(jié)等多種因素密切關(guān)聯(lián)16，YNBY對PPAR活性的具體影響及

21、機制尚有待進一步研究。炎癥發(fā)生時多伴隨氧化應(yīng)激水平的增高?；钚匝?ROS)可通過直接氧化修飾蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類和DNA造成組織損傷;ROS還可上調(diào)NF-B的活性和轉(zhuǎn)化生長因子-(TGF-)的表達，進而引發(fā)局部的炎癥反應(yīng)和纖維化過程17，18;ROS可通過負向調(diào)節(jié)L-Arg的轉(zhuǎn)運19，氧化失活BH420，氧化eNOS的鋅指結(jié)構(gòu)造成eNOS脫偶聯(lián)10，因此ROS被認為是導(dǎo)致eNOS脫偶聯(lián)和內(nèi)皮功能損傷的核心機制。含氮自由基過氧化硝酸鹽(ONOO-)還可與CuZn-SOD分子結(jié)構(gòu)域中的Cu發(fā)生反應(yīng)，在SOD分子上將酪氨酸殘基硝基化，SOD自身硝基化后其清除ROS的能力會顯著降低21。研究表明在轉(zhuǎn)基因

22、Ren-2大鼠腎臟中，NADPH氧化酶的活化和ROS的過量產(chǎn)生造成了足細胞足突消失和微動脈纖維化等腎臟損害22?？偪寡趸芰梢苑从硻C體的氧自由基代謝狀況總抗氧化能力降低表明機體氧自由基清除不足，生成相對過量，而蛋白羰基化含量可用來衡量蛋白質(zhì)氧化損傷的程度。YNBY組分中的麝香、重樓、三七均具有顯著的抗氧化作用。本研究發(fā)現(xiàn)YNBY給藥后明顯提高了SHR腎臟組織的總抗氧化能力，同時降低了蛋白質(zhì)氧化損傷程度，提示YNBY可通過抗氧化應(yīng)激作用保護高血壓腎臟損傷?？傊?，本研究證明YNBY對SHR血壓值無明顯影響，然而能夠通過抑制SHR腎臟炎性因子的表達，減輕氧化應(yīng)激改善高血壓時發(fā)生于腎臟的炎癥反應(yīng)，提

23、示HMP在高血壓腎臟疾病的防治方面具有一定的應(yīng)用潛能。關(guān)于YNBY對SHR腎臟纖維化、硬化及腎小球濾過膜包括血管內(nèi)皮細胞、基膜和足細胞裂孔形態(tài)學(xué)的影響尚需進一步研究和觀察?！尽?#160; 1 Savoia C, Schiffrin EL. Inflammation in hypertensionJ. Curr Opin Nephrol Hypertens, 2006,15(2):152.2 孔令春，厲夏女，彭衛(wèi)珍. 云南白藥的臨床應(yīng)用J. 藥業(yè)，2007，16(14)：63.3 Sun L, Gao YH, Tian DK, et al. Inflammation of different

24、tissues in spontaneously hypertensive ratsJ. Acta Physiologica Sinica, 2006, 58(4):318.4 劉淑華，張黎軍，劉昌慧，等. 氯沙坦對TGF-1在自發(fā)性高血壓大鼠腎小管表達的影響及作用J. 中國臨床藥與治療學(xué)，2005，10(2)：145.5 Biswas SK, Faria JB. Which comes first: renal inflammation or oxidative stress in spontaneously hypertensive ratsJ.Free Radic Res, 2007, 41(2):216.6 武多嬌，洪華山，江 瓊. 麝香保心丸減輕自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化的研究J. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，25(4)：350.7 Cheng W, Zhou S H, Zhang M, et al. The effect of Atorvastatin on proteinuria and plasma CRP and IL-6 in patients with hypertensive nephropathyJ. Chin J Hypertension,