克隆載體與表達(dá)載體

1、克隆載體克 隆 載 體基本性質(zhì)基本特征（或載體的構(gòu)建）原理機(jī)制常用的載體質(zhì)粒載體質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的 DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主 復(fù)制；不相容性；可轉(zhuǎn) 移性（基因工程中采用 非接合性質(zhì)粒）（1） 具有合適的復(fù)制起始位點(diǎn)（ORI）（2） 具有合適的選擇性標(biāo)記基因（ 3） 若干限制性切酶的單一位點(diǎn)（ 4）具有 較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。當(dāng)帶有抗菌素抗性基因的載體進(jìn)入受體菌后，受體 菌才能生長(zhǎng)。不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能 在含有抗菌素的培養(yǎng)基 （選擇培養(yǎng)基）中生長(zhǎng)。（抗 菌素選擇原理）PSC101ColE1PBR322 pUC18 pUC19 TA載體噬 菌 體 載 體入噬 菌體其DNA兩端的5

2、'末端 各帶有12個(gè)堿基的互補(bǔ) 單鏈，即cos位點(diǎn)。有 可替代區(qū)，即非必需區(qū)。 用外源DNA片段替代這 個(gè)區(qū)域，不會(huì)影響噬菌 體顆粒的形成。（1）基因組大?。蝗コ潜匦鑵^(qū)，建立 外源DNA片段的克隆或替換位點(diǎn)（2） 在DNA的非必需區(qū)插入選擇標(biāo)記：lacZ 基因；基因c I失活（cl基因：溶源 過(guò)程控制基因）；Spi篩選（野生型 入 噬菌體在帶有 P2原噬菌體的溶源性 E.coli中 的生長(zhǎng)會(huì)受到限制的表型， 稱(chēng)作Spi+ ，即對(duì)P2噬菌體的干擾敏 感）1）通過(guò)裂解過(guò)程增殖載體2）載體與外源DNA的酶切3）外源DNA與載體的連接4）重組噬菌體的體外 包裝5）包裝噬菌體顆粒的感染6）篩選

3、（入噬菌體載體的克隆原理）插入式載體置換型載體（取代型載 體）M13噬 菌體 載體M13噬菌體的基因組為 單鏈DNA。噬菌體顆粒 的大小受其DNA端點(diǎn)制 約的，不存在包裝限制。 只感染雄性大腸桿菌基因間隔區(qū)（in terge nic regio n, IG區(qū)）基因II與基因IV之間存在一段 507bp的基因間隔區(qū)，含有復(fù)制起始位 點(diǎn)，是實(shí)施改造、構(gòu)建人工載體的重點(diǎn) 區(qū)域。IG區(qū)只有一個(gè)Bsu I切點(diǎn)。（2）加入酶切位點(diǎn)，在IG區(qū)加入單一 切酶位點(diǎn)。M13mp1在IG區(qū)插入一個(gè)大 腸桿菌的LacZ'（-肽序列）。使克隆1、以（+）鏈DNA為摸板，合成互補(bǔ)（-）鏈，該 雙鏈稱(chēng)復(fù)制型 DNA

4、（ RFDNA。2、RFDNA在宿主細(xì)胞 能快速增殖，可增加到每個(gè)細(xì)胞約200個(gè)拷貝。3、單鏈特異的DNA吉合蛋白結(jié)合在 （+ ）鏈上，從而阻 斷了其互補(bǔ)鏈，即（）鏈的合成，這樣，細(xì)胞就 會(huì)不斷的合成（+）鏈DNA 4、游離出來(lái)的（+）鏈 DNA先與基因V的編碼產(chǎn)物形成特異的 DNA-蛋白質(zhì) 復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)移到寄主細(xì)胞膜，同時(shí)基因V的蛋M13mpn n代表系列數(shù) 字對(duì)M13mp1的改 進(jìn)加上常用 的酶切位點(diǎn)。M13mp2LacZ'5'端的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體 細(xì)胞外，M13重組分子篩選簡(jiǎn)便， 被M13 噬菌體感染的受體細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形成 混濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且

5、重組分子 越大，混濁斑的混濁度亦越大 但 M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小， 只有1.5 kb白質(zhì)從（+） DNA鏈上脫落下來(lái)，余下的 M13（ +）鏈 DNA則是從其感染的寄主細(xì)胞的細(xì)胞膜溢出的過(guò)程 中，被外殼蛋白包裝成病毒顆粒的。（M13噬菌體產(chǎn)生單雙鏈DNA的機(jī)制）的第13個(gè)核 苷酸G突變成 A,產(chǎn)生了一 個(gè)EccR I切 占八、噬 菌 體- 質(zhì) 粒 雜 合 載 體黏粒載體考斯質(zhì)粒是一類(lèi)人工構(gòu) 建的含有入-DNAcos序 列和質(zhì)粒復(fù)制子的的特 殊類(lèi)型載體。能像 -DNA那樣進(jìn)行體外包 裝，并咼效轉(zhuǎn)染受體細(xì) 胞；能像質(zhì)粒那樣在受 體細(xì)胞中自主復(fù)制具有 較咼容量的克隆能力： 45kb

6、;具有與同源性序 列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能 力粘粒（cosmid ）是帶有 cos序列的質(zhì) 粒。cos序列是噬菌體DNA中將DNA包裝到噬菌體顆粒中所需的DNA序列。黏粒的組成包括質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（colEI ）,抗性標(biāo)記（amp）, cos 位 點(diǎn)，因而能象質(zhì)粒一樣轉(zhuǎn)化和增殖?？?隆的最大DNA片段可達(dá)45kb 。有的 粘粒載體含有兩個(gè)cos位點(diǎn)，在某種程度上可提高使用效率。設(shè)計(jì)構(gòu)建的柯斯質(zhì)粒一般長(zhǎng)46kb。其上的cos位點(diǎn)的一個(gè)重要作用是識(shí)別噬菌體的外殼蛋白。凡具 有cos位點(diǎn)的任何DNA分子只要在長(zhǎng)度相當(dāng)于噬菌 體基因組，就可以?xún)胀鈿さ鞍捉Y(jié)合而被包裝成類(lèi)似 噬菌體入的顆粒。因此，插入柯斯質(zhì)粒的外

7、源DNA可大于40kb。重組的柯斯質(zhì)?？上笫删w入一樣感 染大腸桿菌，并在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制。噬菌 粒載 體能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì) 胞中自主復(fù)制能像M13-DNA那樣體外包裝， 并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（10 kb 通過(guò)克隆雙鏈 DNA能獲 得同等長(zhǎng)度的單一單鏈DNA噬菌粒載體綜合了質(zhì)粒載體和M13噬菌體載體優(yōu)點(diǎn)，含有ColEl復(fù)制起始位點(diǎn)、 抗生素抗性選擇標(biāo)記和絲狀體噬菌體 DNA間隔區(qū)（含有噬菌體DNAM制起始、 終止以及噬菌體顆粒形態(tài)發(fā)生所必需 的全部順式作用元件）它具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、選擇性標(biāo)記、 多克隆位點(diǎn)等，方便 DNA的操作，可在 細(xì)胞穩(wěn)定存在；又具有單

8、鏈?zhǔn)删w的復(fù)1.具有較小分子量基因組DNA可克隆10kb的外源DNA片段，并易于進(jìn)行分離與操作；2.編碼一個(gè) amP基因作為選擇記號(hào)， 便于轉(zhuǎn)化子的選擇；3.拷 貝數(shù)含量高4.存在著一個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)，因此多 種不冋類(lèi)型的外源 DNA片段，不經(jīng)修飾便可直接插 入到載體分子上；5.多克隆位點(diǎn)區(qū)阻斷了大腸桿菌 lacZ基因的5'-端編碼區(qū)，可按照IPTG顯色反應(yīng) 試驗(yàn)師選6. lacZ 基因是置于lac啟動(dòng)子的控制之 下，插入的外源基因便會(huì)以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)；PUC118 和PUC119重組操作簡(jiǎn)便，篩選容 易制起點(diǎn)，在輔助噬菌體的存在下，可進(jìn) 行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌 體7含

9、有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，可復(fù)制形成大量的雙鏈 DNA 分子8.帶有一個(gè)M13噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)，在有輔 助噬菌體感染的寄主細(xì)胞中，可以合成出單DNA拷貝，并包裝成噬菌體顆分泌到培養(yǎng)基中；9.;在PUC118和pUC119這兩個(gè)載體中，多克隆位點(diǎn)區(qū)的 核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它們當(dāng)中的一 個(gè)可轉(zhuǎn)錄克隆基因的正鏈 DNA另一個(gè)則可轉(zhuǎn)錄出負(fù)鏈DNA人工染色 體染色體具有復(fù)制功能， 利用染色體的復(fù)制元件 來(lái)驅(qū)動(dòng)外源DNA片段復(fù) 制的載體稱(chēng)為人工染色 體載體其裝載外源DNA的容量比質(zhì)粒、噬菌體 和噬菌體-質(zhì)粒雜合載體等有很大的拓 展，甚至可以跟染色體的大小相媲美。 人工染色體載體拷貝數(shù)少，制備困難， 通

10、常采取“穿梭載體”的策略來(lái)解決含有質(zhì)粒載體所必備的第一受體（大腸桿菌）質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)，這樣的載體在大腸桿菌可以按質(zhì)粒復(fù) 制形式進(jìn)行高拷貝復(fù)制，含有第二受體（如酵母）端粒（TEL）、DNAM制起始位點(diǎn)（ARS）和著絲粒（CEN） 以及合適的選擇標(biāo)記。載體在體外與目的DNA重組后轉(zhuǎn)化到第二受體細(xì)胞，按照染色體復(fù)制的形式進(jìn) 行復(fù)制和傳遞。篩選第一受體的克隆子一般采用抗 生素抗性選擇標(biāo)記；篩選第二受體的克隆子常用與 受體互補(bǔ)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。酵母人工染 色體載體YAC 細(xì)菌人工染 色體載體BACP1噬菌體人 工染色體載體PAC質(zhì)粒載體總結(jié)質(zhì)粒 載 體類(lèi)型長(zhǎng)度選擇標(biāo)記克隆位點(diǎn)PSC101天然質(zhì)粒，屬?lài)?yán)緊型

11、、低拷貝型9.09kb四環(huán)素抗性Tetr7 個(gè)克隆位點(diǎn)：EcoR I、Xho I、Pvu I、Hi nd III、BamH I、Sal I 、Sam I主要使用EcoR IColEI天然質(zhì)粒，屬松弛型多拷貝型6.3 kb大腸桿菌素（colicin ） E1 和對(duì)E1免疫的 基因（immEDEcoR I位于E1部，插入外源 DNA會(huì)導(dǎo)致E1失 活，使受體菌不能合成E1 （ColEI ），但仍然表現(xiàn)出對(duì)E1免疫型（ImmEl）pBR322兀件來(lái)源復(fù)制起點(diǎn) oripMB1系列（來(lái)源于ColEI ）的高拷貝型復(fù)制起點(diǎn) Ampr 基因pSP2124質(zhì)粒的Amp基因Tet r基因pSC101的 Tetr基

12、因。4363bp氨卞冃霉素和四環(huán)素抗性24個(gè)克隆位點(diǎn)。其中9個(gè)會(huì)導(dǎo)致 Tetr基因失活（如BamH、Hi nd川、Sal I ）;3個(gè)會(huì)導(dǎo)致 Amp基因失活（Sca I、PvuI、Pst 1）。pUC系列（i ）來(lái)自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ori ）; （ii ）氨芐青 霉素抗性基因（ampr），但它不再含有原來(lái)的核酸切限制 酶的單識(shí)別位點(diǎn)；（iii ）大腸桿菌3 -半乳糖酶基因（lacZ ）的啟動(dòng)子及其編碼a -肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱(chēng)為lacZ '基因；（iv ）位于lac Z'基因中的靠近 5'-端的一段多克隆位點(diǎn)（MCS區(qū)段，但它并不破壞該 基因的功能2

13、.7kbAmpicilli n 抗性和lacZ 的a肽互補(bǔ)（監(jiān)白斑）相 結(jié)合。10個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于lacZ '基因的5'端。TA載體耐熱聚合酶可在 PCR產(chǎn)物的3'端加上一個(gè)非配對(duì)的 脫氧腺嘌呤核苷（A）。根據(jù)這一特點(diǎn)研制出線性TA質(zhì)粒載體，其5'端各帶有一個(gè)不配對(duì)的脫氧胸腺嘧 啶（T），用該載體可進(jìn)行 PCR產(chǎn)物的直接克隆。TA載體構(gòu)建：在 般質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建。方法1:先采用限制性切核酸酶酶切使質(zhì)粒載體線性化，再通過(guò)K1enow片段將酶切的線性載體末端補(bǔ)平方法2:利用產(chǎn)生平末端的限制性切核酸酶酶切產(chǎn)生平末端，最后將線性化鈍 末端質(zhì)粒載體加 T

14、反應(yīng)形成。目前有很多公司推出了TA質(zhì)粒載體。入噬菌體載體入噬菌體載體分類(lèi)插入式載體一種只具有一 個(gè)可供外源DNA 插入的克隆位 點(diǎn)的派生載體入噬菌體載體相對(duì)于質(zhì)粒載體來(lái)說(shuō)，克隆片段較大，所以一般用于cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)的構(gòu)建。cl基因插入失活：如入gt10、入NM1149等載體，在cl基因上有EcoR I及Hind III 的酶切位點(diǎn)。外源基因插入后將導(dǎo)致cI基因的失活。cI基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶原化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁 的噬菌斑。Lac Z 基因插入失活：如 charon16A載體，在非必須區(qū)段引入lac Z 基因，在lac Z 基因上有 EcoR I位點(diǎn)，插入失活后

15、利用X-gal法篩選（藍(lán)白篩選）置換型載體（取代型載 體）具有成對(duì)的克 隆位點(diǎn)，在這 兩個(gè)位點(diǎn)之間 的入DNA區(qū)段可 以被外源DNA 片段所取代。野生型噬菌體染色體的中段對(duì)于噬菌體的感染和復(fù)制是非必要的，外源DNA可以取代這一片段這些載體是用Lac 5替換入噬菌體的中間區(qū)段，同時(shí)將Lac 5作為選擇標(biāo)記使用時(shí)用EcoRI水解，去掉中間的片段，再與欲克隆片段在體外進(jìn)行重組、包裝。而后，感染E.coli使之在E.coli繁殖，并裂解 E.coli ,形成空斑。置換型入噬菌體是使用最廣泛的載體。人工染類(lèi)別元件優(yōu)點(diǎn)酵母人工染色體 載體YAC是最常用來(lái)克隆 很大DNA片段（2Mb的系統(tǒng)。為構(gòu)建YAC需要

16、結(jié)合四個(gè)短序列：即二個(gè)端粒、 一個(gè)著絲粒和一個(gè) ARS元件，并將一適當(dāng)大小的 外源DNA連接成一線性DNA分子，而端粒序列位 于正確的末端。YAC的構(gòu)建有比在細(xì)菌中克隆的一些優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槟承┱婧?細(xì)胞的序列，特別是重復(fù)序列是難以甚至不可能在細(xì)菌中 繁殖的，酵母細(xì)胞卻具有這樣的能力色體細(xì)菌人工染色體 載體BAC是基于大腸桿菌 的F質(zhì)粒構(gòu)建 的，高通量低拷 貝的質(zhì)粒載體每個(gè)環(huán)狀DNA分子中攜帶一個(gè)抗生素抗性標(biāo) 記，一個(gè)來(lái)源于大腸桿菌F因子（致育因子）的嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制子oriS（ Shizuya et al.1992 ），個(gè)易于DNA復(fù)制的由ATP驅(qū)動(dòng)的解 旋酶（RepE）以及三個(gè)確保低拷貝質(zhì)粒精確

17、 分配至子代細(xì)胞的基因座（parA , parB ,和parC）以大腸桿菌為寄主，轉(zhuǎn)化率高，構(gòu)建BAC文庫(kù)比YAC文庫(kù)更容易；BAC載體以環(huán)型超螺旋狀態(tài)存在，從大腸桿 菌中提取質(zhì)粒較方便，而從酵母中分離DNA較困難；BAC的復(fù)制子來(lái)源于 F因子，可穩(wěn)定遺傳，嵌合及重組 現(xiàn)象少；可以通過(guò)菌落原位雜交來(lái)篩選目的基因，方便 快捷；BAC載體在克隆位點(diǎn)的兩側(cè)具有 T7和Sp6聚合酶 啟動(dòng)子，可以用于轉(zhuǎn)錄獲得 RNA探針或直接用于插入片段 的末端測(cè)序。表達(dá)載體分類(lèi)結(jié)構(gòu)組成及表達(dá)兀件特點(diǎn)或優(yōu)點(diǎn)備注質(zhì) 粒 表 達(dá) 載 體原核表達(dá)載體1啟動(dòng)子、2轉(zhuǎn)錄終止子（防止克隆的外源基因表達(dá)干 擾載體的穩(wěn)疋性）3核糖體結(jié)

18、合位點(diǎn)表達(dá)方式有： 組成型表達(dá)， 誘導(dǎo)型表達(dá)。 融合型表達(dá)， 分泌型表達(dá)。啟動(dòng)子類(lèi)型：根據(jù)作用方式及功能分類(lèi)組成 型啟動(dòng)子 組織特異啟動(dòng)子又稱(chēng)器官特異性啟動(dòng)子。 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子酵母表達(dá)載體來(lái)自pBR322基本骨架含有該質(zhì)粒復(fù)制起 始位點(diǎn)（ori） , lacZ 基因、bla 或 amp、tet 等基因。含有 URA3 HIS3、LEU2 TRP、LYS2與特定的宿主營(yíng)養(yǎng)缺陷突變體互補(bǔ)篩GAP是組成型啟動(dòng)子。其余是誘導(dǎo)型啟動(dòng) 子。酵母表達(dá)載體多為穿梭載體 ：既可以 在大腸桿菌中繁殖，獲得足夠的載體DNA 進(jìn)行體外操作，又可以在酵母中復(fù)制、 表由于原核生物和真核生物存在糖基化、 ?；?等翻譯后修飾

19、反應(yīng)機(jī)制的差異， 真核基因的原 核表達(dá)難以獲得有活性的蛋白。 酵母成為真核 表達(dá)的首選系統(tǒng)。選或利用 zeocin、basticidin （殺稻瘟菌 素）的抗性基因篩選。啟動(dòng)子有GAP AOXI、 AUGI 和 GAL1 等。達(dá)和選擇。融合蛋白表達(dá)載體：于外源基 因插入位點(diǎn)的C端或N端插入了 1個(gè)6X His標(biāo)簽，或在5'端插入了 a -因子作 為分泌信號(hào)Ti質(zhì) 粒 表 達(dá) 載 體一元 載體一兀載體就是含目的基因的中間表達(dá)載體 與改造后的受體（Ti質(zhì)粒）通過(guò)同源重組所 產(chǎn)生的一種復(fù)合型載體，也稱(chēng)為共整合載 體。由于該載體的T-DNA區(qū)與Vir區(qū)緊密連 鎖，也稱(chēng)為順式載體（cis-vec

20、tor）Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌中發(fā)現(xiàn)的可引發(fā)植 物產(chǎn)生冠癭瘤的質(zhì)粒。根據(jù)冠癭瘤合成的 冠癭堿種類(lèi)，Ti質(zhì)?？煞譃檎卖~(yú)堿、農(nóng) 桿堿、農(nóng)桿菌素和琥珀堿4種不冋類(lèi)型Ti質(zhì)粒可分為 T-DNA Vir、Con和Ori 4 個(gè)功能區(qū)。T-DNA區(qū)是Ti質(zhì)粒中能轉(zhuǎn) 移到植物細(xì)胞的區(qū)域。Vir區(qū) 位于T-DNA區(qū)的上游，其表達(dá)產(chǎn)物可激活 T-DNA向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移， 這一個(gè)區(qū)域也 稱(chēng)為致病區(qū)。Con區(qū)該區(qū)含有與農(nóng)桿菌之間接合轉(zhuǎn) 移有關(guān)的基因（tra ），這些基因受佰主細(xì) 胞合成的冠癭堿激活，使Ti質(zhì)粒在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移。Ori區(qū) 調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，為復(fù) 制起始區(qū)構(gòu)建的基本原理：引入分子質(zhì)量較小的中間載體，將

21、欲轉(zhuǎn)化的目的基因及抗性標(biāo)記基因構(gòu)建到中間載體上。將Ti質(zhì)粒上T-DNA的致瘤基因全部去掉，僅 保留其兩邊界及與 T-DNA轉(zhuǎn)移所必需的25個(gè) 堿基序列，構(gòu)建成所謂卸甲載體。 在卸甲載體 的T-DNA區(qū)被刪除致瘤基因位點(diǎn)插入中間載 體同源的質(zhì)粒序列，將中間載體轉(zhuǎn)入含有卸甲 載體的根癌農(nóng)桿菌中，構(gòu)建在中間載體上目的 基因可通過(guò)冋源重組整合到卸甲載體Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)，并與卸甲載體Ti質(zhì)粒一起復(fù)制。二元 載體雙兀表達(dá)載體系統(tǒng)主要包括兩個(gè)部分：一部分為卸甲Ti質(zhì)粒，這類(lèi)Ti質(zhì)粒由于 缺失了 T- DNA區(qū)域，完全喪失了致瘤作 用，主要是提供Vir基因功能，激活處于反 式位置上的T- DNA的轉(zhuǎn)移。

22、另一部份是微 型Ti質(zhì)粒，它在T- DNA左右邊界序列之間 提供植株選擇標(biāo)記如NPTII基因以及Lac Z基因等。雙兀載體系統(tǒng)的構(gòu)建的原理是Ti質(zhì)粒上的 Vir基因可以反式激活 T- DNA的轉(zhuǎn)移。與共整合載體所不同的是， 它不依賴(lài)兩個(gè) 質(zhì)粒之間的同源序列，不需要共整合過(guò)程就能 在農(nóng)桿菌獨(dú)立復(fù)制雙元表達(dá)載體構(gòu)件方便，轉(zhuǎn)化效率高于一 元載體。病 毒 表 達(dá) 載桿狀病毒表 達(dá)載體桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的基本兀件：（1）啟動(dòng)子：多個(gè)啟動(dòng)子同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源 基因。（2）poly A加尾信號(hào)：（3）冋源重組 序列。（4）穿梭載體必需兀件。除帶有病毒 自身的復(fù)制起始位點(diǎn)外，還帶有pUC質(zhì)粒的重組蛋白具有完整的生

23、物學(xué)功能：接近天然蛋白。能進(jìn)行翻譯后的加工修飾： 研究糖基化對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能影響方 面的理想模型。表達(dá)水平高：最高可使 目的蛋白的量達(dá)到細(xì)胞總蛋白的50%。桿狀病毒科病毒，桿狀病毒顆粒，雙鏈閉合環(huán) 狀DNA病毒，專(zhuān)一性感染無(wú)脊椎動(dòng)物將外源基因先克隆到轉(zhuǎn)移載體上，再與病毒基因組共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞的同源重組獲得 帶有外源基因的重組病毒的策略。體復(fù)制子及以amp，可以在細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增。（5） 篩選標(biāo)記。 能容納大分子的插入片段：上限未知。 能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因： 在同一細(xì)胞同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因。能表達(dá)基因組DNA昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有剪切的功能。對(duì)重組蛋白進(jìn)行定位的功能： 如將核蛋白 轉(zhuǎn)送到細(xì)胞核上

24、，膜蛋白則定位在膜上， 分泌蛋白則可分泌到細(xì)胞外等。腺病毒載體腺病毒 DNA末端結(jié)構(gòu)突出特點(diǎn)1 ）帶有100bp反向的末端重復(fù)序列（ITR），而且在 每一條單鏈的 5'-末端還共價(jià)地連接著末 端結(jié)合蛋白，對(duì)病毒的復(fù)制有重要作用。2） 當(dāng)它從病毒顆粒中分離出來(lái)之時(shí)，便會(huì)自發(fā)地環(huán)化起來(lái)，爾后許多環(huán)形分子又聚合成多 聚體腺病毒載體是目前最為廣泛應(yīng)用的基因 載體，也是唯一基因藥物的載體雙鏈DNA的分子大小約為 36kb.可應(yīng)用于1.基因治療2.表達(dá)真核基因3. 研制疫苗首先構(gòu)建一個(gè)含多克隆位點(diǎn)和篩選標(biāo)志的轉(zhuǎn) 移質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有病毒基因組某段早期序 列；然后將一個(gè)含有啟動(dòng)子一外源基因-polyA

25、的表達(dá)盒插入到上述質(zhì)粒中腺病毒E1、E3或E4至右側(cè)的ITR區(qū)之間，構(gòu)建成載有外源 基因的穿梭質(zhì)粒。反 轉(zhuǎn) 錄 病 毒 載 體泡沫病毒類(lèi)從5'端開(kāi)始依次是：5'長(zhǎng)末端重復(fù)序 列（5 ' -LTR），帶有增強(qiáng)子和啟動(dòng)子序列； psi序列，又稱(chēng)“序列，是病毒包裝所必 須的信號(hào)序列；gag,編碼病毒衣殼蛋白； pol，編碼反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶（Int）:env,編碼病毒顆粒外層包裝蛋白；3'長(zhǎng) 末端重復(fù)序列（3 ' -LTR）,帶有poly A加尾 信號(hào)序列。一類(lèi)含單鏈RNA的動(dòng)物病毒。它的基因組 含有2條相同的正鏈RNA分子，包裝成二 倍體病毒顆粒。（1）在大多

26、數(shù)情況下，反 轉(zhuǎn)錄病毒的腫瘤基因（onc）都能夠在正常 的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。2 ）反轉(zhuǎn)錄病毒的寄主圍 相當(dāng)廣，包括無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物。3） 反轉(zhuǎn)錄病毒具有強(qiáng)啟動(dòng)子， 外源基因可得 到有效表達(dá)。4）反轉(zhuǎn)錄病毒不但感染效 率高，而且不招致寄主細(xì)胞的死亡載體的構(gòu)建：分離原病毒 DNA刪去部分序列t組入選擇 性標(biāo)記基因、目的基因和調(diào)控兀件t克隆到含 有大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)的克隆載體t轉(zhuǎn)化 大腸桿菌t獲得反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體t輔助細(xì)胞系（包裝細(xì)胞系）t擴(kuò)增慢病毒類(lèi)致癌 病毒 類(lèi)SV40病毒型轉(zhuǎn)化載體根據(jù)SV40 DNAS入敏感動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)方向， 分為早期轉(zhuǎn)錄區(qū)和晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)。早期轉(zhuǎn)錄區(qū)包括與病毒感染相關(guān)的t抗原含有能夠被真核細(xì)胞識(shí)別的有效的啟 動(dòng)子。有許多種動(dòng)物病毒，在其感染周 期中都能夠持續(xù)地復(fù)制，使其基因組拷貝猿猴空泡病毒 40（Simia n vacuolati ngvirus40, SV40）基因組是一種環(huán)形雙鏈的DNA其大小僅有5243bp，很適于基因操作。導(dǎo)致人基因(smallT-antigen) 和 T抗原基因(large T-antigen)等；含有 BamHI等限制性切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)；晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)包括與病 毒殼蛋白合成相關(guān)的基因，