伽瑪?shù)恫煌瑒┝空丈湔４笫笠粋?cè)尾殼核后延髓內(nèi)Fos蛋白的表達(dá)及變化

1、    伽瑪?shù)恫煌瑒┝空丈湔４笫笠粋?cè)尾殼核后 延髓內(nèi)Fos蛋白的表達(dá)及變化         摘要：目的觀察-刀不同劑量照射正常大鼠一側(cè)尾殼核后3個(gè)月，遠(yuǎn)離靶區(qū)的延髓中尾段內(nèi)Fos的表達(dá)和變化及與劑量的關(guān)系。方法分別用10Gy至100Gy 10個(gè)級別劑量照射大鼠一側(cè)尾殼核，3個(gè)月后，用ABC法對延髓中尾段切片進(jìn)行抗Fos蛋白的免疫組織化學(xué)反應(yīng)。結(jié)果在延髓內(nèi)臟帶、三叉神經(jīng)尾側(cè)亞核、三叉神經(jīng)間質(zhì)核、延髓背側(cè)網(wǎng)狀核和下橄欖核等處出現(xiàn)多少不等的Fos陽性胞核，隨著劑量的增加

2、Fos陽性胞核的數(shù)量增加，范圍擴(kuò)大。在高劑量組的延髓腹外側(cè)區(qū)出現(xiàn)3種Fos陽性細(xì)胞：胞核陽性、胞漿陰性；胞漿陽性、胞核陰性；胞核胞漿均為陽性。結(jié)論-刀照射前腦一個(gè)局部，在遠(yuǎn)離靶區(qū)的延髓中尾段出現(xiàn)Fos陽性反應(yīng)，并與劑量成正相關(guān)。關(guān)鍵詞：-刀；延髓；Fos；延髓內(nèi)臟帶；免疫組織化學(xué)分類號：R8文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：0529-1356(2000)01-21EXPRESSION AND CHANGE OF Fos IN THE MEDULLAOBLONGATA OF RAT FOLLOWING EXPOSURE TOVARIOUS DOSE OF GAMMA KNIFERAO Zhi-ren(In

3、stitute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)WU Sheng-ling(Guang dong Minimally Invasive Neurosurgery Medical Center,Guang zhou 510630,China)QIU Jian-yong(Institute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)XU Xin(Guang don

4、g Minimally Invasive Neurosurgery Medical Center,Guang zhou 510630,China)DUAN Xiao-qin(Institute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)JU Gong(Institute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)Abstract：ObjectiveTo observe

5、alterations in Fos protein expression in middle-caudal segment of the normal rat medulla oblongata after the unilateral caudate putamen nucleus was irradiated with different dosage of gamma knife.MethodsThe caudate putamen nucleus was irradiated with various dosage from 10Gy to 100Gy of gamma knife.

6、The rats were sacrificed 3 months after irradiation and fixed and cut with cryostat.The sections of the medulla oblongata were reacted with anti-Fos protein immunohistochemical ABC method.ResultsAt low dosage,Fos positive nucleus was observed in medullary visceral zone,caudal subnucleus of trigemina

7、l nerve,intertrigeminal nucleus of trigeminal nerve,dorsal medullary reticular nucleus and inferior olive nucleus.With the dosage increasing,both the number and distribution scope of positive nucleus was increased.In the high dosage group,three types of Fos positive expression appeared in ventrolate

8、ral medulla oblongata nucleus.The three types were:only the nucleus was stained;only cytoplasm was stained;both nucleus and cytoplasm were stained.ConclusionThough a local nucleus in the forebrain was exposed to gamma knife,the distant area of middle-caudal segment of the medulla oblongata showed Fo

9、s positive reaction and the reaction was positively related with dosage.Key words：Gamma knife;Medulla oblongata;Fos;Medullary visceral zone;Immunohistochemistry-刀定位照射是某些顱內(nèi)疾病(腦血管畸形、腦腫瘤及腦功能性疾病)的非手術(shù)治療方法之一。有關(guān)-刀的放射神經(jīng)生物學(xué)的基礎(chǔ)研究雖有一些報(bào)告，但仍比較薄弱，Kandziolka等13曾做過比較系統(tǒng)的觀察，他曾用-刀(30、40、50、60、70、80、100、150、200Gy)定位照射一

10、側(cè)尾狀核頭部，動(dòng)物成活90d后靶區(qū)的組織學(xué)變化，結(jié)果照射劑量少于70Gy，在光鏡下未見到組織學(xué)的改變；在70100Gy發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元的大小與形態(tài)有變化，小動(dòng)脈壁增厚，血紅細(xì)胞或蛋白滲出血管外，并有點(diǎn)狀壞死；150200Gy照射后17d腦未出現(xiàn)病理學(xué)改變，14d出現(xiàn)靶區(qū)的腦水腫，21d后靶區(qū)出現(xiàn)一直徑為4mm的壞死。這一結(jié)果初步提示了靶區(qū)腦組織的變化與劑量及成活時(shí)間的關(guān)系，由于他們只是用組織學(xué)方法僅觀察了靶區(qū)組織的變化，說明的問題很局限，因此有必要對-刀照射正常大鼠腦部后，腦組織的變化進(jìn)行更深入的研究。為此我們進(jìn)行了兩方面的工作，第1用100Gy劑量的-刀照射正常大鼠一側(cè)尾狀核頭部，動(dòng)物分別成活0.

11、5、1、3、6、12h及1、3、7、14、30和90d后，采用組織學(xué)方法(HE染色)，組織化學(xué)方法(NADPH-diaphorase染色)，抗Fos蛋白，抗GFAP，抗0x42，和抗HSP70等免疫組織化學(xué)技術(shù)，觀察全腦(包括靶區(qū)和非靶區(qū))血管內(nèi)皮，神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的變化及其與時(shí)間的效應(yīng)關(guān)系。第2用10、20、30、40、50、60、70、80、90和100Gy的-刀照射正常大鼠一側(cè)尾狀核頭部，動(dòng)物均成活90d，采用上述方法觀察全腦組織的變化及其劑量的效應(yīng)關(guān)系。我們僅就用10Gy至100Gy不同劑量的-刀照射后延髓內(nèi)Fos蛋白的表達(dá)及變化作一報(bào)告，其他結(jié)果另行報(bào)告(請參閱“全國

12、首屆微侵襲神經(jīng)外科學(xué)術(shù)會議論文匯編”，廣州，1998：66119)。材料和方法共用SD成年雄性大鼠(體重200g)34只，其中實(shí)驗(yàn)組30只，對照組4只。1.實(shí)驗(yàn)組2.對照組和對照實(shí)驗(yàn)2.1正常對照組：2只正常大鼠未經(jīng)MRI和-刀處理，在深麻下按實(shí)驗(yàn)組方法對動(dòng)物進(jìn)行灌流固定、切片和免疫組織化學(xué)反應(yīng)。2.2對照實(shí)驗(yàn)：大鼠2只在麻醉下固定于專用固定架上，放在-刀室(不受-刀直接照射)30min，動(dòng)物成活90d按實(shí)驗(yàn)組步驟灌流固定，切片和免疫組織化學(xué)反應(yīng)。2.3替代實(shí)驗(yàn)：隨機(jī)抽取實(shí)驗(yàn)組切片若干，用KPBS替代第一抗體，浸泡切片48h(4)，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。結(jié)果未見到Fos陽性產(chǎn)物。結(jié)果1.正常對

13、照組和對照實(shí)驗(yàn)僅在延髓內(nèi)臟帶(MVZ)的孤束核(NTS)和腹外側(cè)延髓(VLM)有少數(shù)散在的Fos陽性胞核，其他部位為陰性。2.實(shí)驗(yàn)組為了敘述方便，我們參照有關(guān)文獻(xiàn)1，2將照射劑量分為3個(gè)劑量級，即低劑量級(1030Gy)，中劑量級(4060Gy)和高劑量級(70100Gy)。2.1低劑量組(1030Gy)：Fos陽性胞核出現(xiàn)在下列結(jié)構(gòu)，(1)MVZ中有少量Fos陽性胞核，主要分布于NTS的內(nèi)側(cè)亞核(1)，VLM的表面和腹外側(cè)網(wǎng)狀核(2)，而MVZ中間部(IRt)則較少。MVZ內(nèi)Fos陽性胞核的數(shù)量詳見表1。(2)雙側(cè)延髓背側(cè)網(wǎng)狀核內(nèi)有Fos表達(dá)(3)。(3)三叉神經(jīng)尾側(cè)亞核(Sc5)有少量Fo

14、s胞核，以淺層為主，其他層均散在出現(xiàn)，照射側(cè)多于非照射側(cè)；三叉神經(jīng)極間亞核以上部位則明顯減少。(4)雙側(cè)三叉神經(jīng)束間核也有少量Fos陽性胞核。    110Gy照射后，最后區(qū)平面MVZ內(nèi)孤束核(NTS)的Fos表達(dá)×100(下同)Fig.1Expression of Fos in NTS of MVZ at area postrema (AP) level of rat after irradiating with 10Gy of gamma knife. ×100(The same as follows)  &#

15、160; 210Gy照射后，最后區(qū)平面MVZ內(nèi)腹外側(cè)延髓(VLM)的Fos表達(dá)Fig.2Expression of Fos in VLM of MVZ at AP level of rat after irradiating with 10Gy    310Gy照射后，延髓背側(cè)網(wǎng)狀核的Fos表達(dá)Fig.3Expression of Fos in the dorsal reticular nucleus of the medulla oblongata of rat after irradiating with 10Gy表1低劑量組(1030Gy

16、)9只大鼠MVZ內(nèi)Fos陽性胞核的計(jì)數(shù)Table 1Enumeration of Fos positive nuclei in MVZ ofthe rat (n=9) irradiated by low-dose(10-30Gy)錐體交叉平面Pyr.level最后區(qū)平面AP.level閂平面Obex.level閂吻側(cè)平面rostal levelto obexNTS503852206108IRt901637870VLM8071 053402280總數(shù)total1 4002 068986458均數(shù)/只average/per rat155.5229.7109.550.9  

17、60;  2.2中劑量組(4060Gy)，上述區(qū)域內(nèi)的Fos陽性胞核有所增加，(1)MVZ的NTS、VLM和IRt Fos陽性胞核增加明顯，形成一條弧形帶狀分布區(qū)，在VLM，F(xiàn)os陽性胞核分布于表面，外側(cè)網(wǎng)狀核小細(xì)胞部，腹外側(cè)網(wǎng)狀核和三叉下核(46)。MVZ內(nèi)的Fos陽性胞核計(jì)數(shù)詳見表2。(2)三叉神經(jīng)尾側(cè)亞核Fos陽性胞核有增加，仍以照射側(cè)較多。(3)雙側(cè)延髓背側(cè)網(wǎng)狀核有較多的Fos陽性胞核，位于NTS之腹外側(cè)，IRt背外側(cè)與三叉神經(jīng)尾側(cè)亞核背側(cè)之間。    450Gy照射后，閂平面MVZ內(nèi)NTS的Fos表達(dá)Fig.4Expression o

18、f Fos in NTS of MVZ at the obex level of rat after irradiating with 50Gy    550Gy照射后，閂平面MVZ內(nèi)中間網(wǎng)狀帶(IRt)的Fos表達(dá)Fig.5Expression of Fos in IRt of MVZ at the obex level of rat after irradiating with 50Gy    650Gy照射后，閂平面MVZ內(nèi)VLM的Fos表達(dá)Fig.6Expression of Fos in VLM of M

19、VZ at the obex level of rat after irradiating with 50Gy表2中劑量組(4060Gy)9只大鼠MVZ內(nèi)Fos陽性胞核的計(jì)數(shù)Table 2Enumeration of Fos positive nuclei in MVZ ofthe rat (n=9) irradiated by mid-dose(40-60Gy)錐體交叉平面Pyr.level最后區(qū)平面AP.level閂平面Obex.level閂吻側(cè)平面rostal levelto obexNTS8031 252406214IRt26146017898VLM1 0741 603504381總數(shù)

20、total2 1383 3151 188693均數(shù)/只average/per rat237.5268.3132.077     2.3高劑量組(70100Gy)，F(xiàn)os表達(dá)的主要特點(diǎn)如下：(1)MVZ內(nèi)Fos陽性胞核明顯增多，形成一條弧形帶狀區(qū)。NTS的Fos陽性胞核主要分布于弧束周圍(7)；VLM的Fos陽性胞核散在分布于VLM各結(jié)構(gòu)(8)；IRt有較多的散在Fos陽性胞核(9)。從錐體交叉平面至閂吻側(cè)平面，F(xiàn)os陽性胞核有所減少。MVZ內(nèi)Fos陽性胞核計(jì)數(shù)詳見表3。(2)雙側(cè)三叉神經(jīng)尾側(cè)亞核有較多的Fos陽性胞核，淺層較密集，深部各層也有散在分布；極

21、間亞核以前偶見Fos胞核。(3)雙側(cè)三叉脊束束間核有少量Fos陽性胞核。(4)雙側(cè)外側(cè)楔束核、下橄欖核有少量Fos陽性胞核。(5)雙側(cè)延髓背側(cè)網(wǎng)狀核有較密集的Fos陽性胞核。(6)在VLM觀察3種Fos陽性細(xì)胞(神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)，即Fos陽性胞核，胞漿為陰性；Fos陽性胞漿，胞核為陰性；胞漿和胞核均為Fos陽性(1012)。    770Gy照射后，最后區(qū)平面MVZ內(nèi)NTS的Fos表達(dá)Fig.7Expression of Fos in NTS of MVZ at AP level of rat after irradiating with 70Gy

22、    870Gy照射后，最后區(qū)平面MVZ內(nèi)IRt的Fos表達(dá)Fig.8Expression of Fos in IRt of MVZ at AP level of rat after irradiating with 70Gy    970Gy照射后，最后區(qū)平面MVZ內(nèi)VLM的Fos表達(dá)Fig.9Expression of Fos in VLM of MVZ at AP level of rat after irradiating with 70Gy    1070Gy照射

23、后，VLM內(nèi)3種Fos陽性細(xì)胞，. 胞核陽性者；. 胞漿陽性者；. 胞核胞漿均陽性者×200Fig.10Three kinds of Fos positive cells in VLM of rat after irradiating with 70GyFos positive only in nuclei of cells, Fos positive only in cytoplasm,Fos positive in both nuclei and cytoplasm.×200(The same as follows)    117

24、0Gy照射后，VLM內(nèi)胞核胞漿均Fos陽性細(xì)胞×200Fig.11Three kinds of Fos positive cells in VLM of rat after irradiating with 70GyFos positive only in nuclei of cells, Fos positive only in cytoplasm,Fos positive in both nuclei and cytoplasm.×200(The same as follows)    1270Gy照射后，VLM內(nèi)Fos陽性細(xì)胞&

25、#215;200Fig.12Fos positive cells in VLM after irradiating with 70Gy×200表3高劑量組(70100Gy)12只大鼠MVZ內(nèi)Fos陽性胞核的計(jì)數(shù)Table 3Enumeration of Fos positive nuclei in MVZ ofthe rat (n=12) irradiated by hight-dose(70-100Gy)錐體交叉平面Pyr.level最后區(qū)平面AP.level閂平面Obex.level閂吻側(cè)平面rostal levelto obexNTS1 2411 867608364IRt582

26、872378116VLM1 5082 043784420總數(shù)total3 3314 7821 770950均數(shù)/只average/per rat277.5498.5147.570.8     總之，從低劑量至高劑量延髓內(nèi)Fos陽性細(xì)胞數(shù)量增加，分布范圍也逐漸擴(kuò)大；MVZ是一個(gè)敏感區(qū)，F(xiàn)os陽性細(xì)胞較密集，特別是NTS和VLM，在錐體交叉平面和最后區(qū)平面Fos陽性胞核較多，向吻側(cè)至閂平面和閂吻側(cè)平面Fos表達(dá)有所減少；雙側(cè)三叉神經(jīng)尾側(cè)亞核有Fos表達(dá)，極間亞核以吻部位則極少；在高劑量組可見到3種Fos陽性細(xì)胞。 討論1.關(guān)于刀照射大鼠腦部模型的建立1.1靶

27、區(qū)位置的選定，本實(shí)驗(yàn)將靶區(qū)定于尾狀核頭部，其理由如下：(1)由于所用-刀裝置是用于人腦的，最小的準(zhǔn)直器直徑為4mm,這就決定了射線集中照射中心區(qū)，直徑最小為4mm，大鼠腦內(nèi)僅尾狀核頭部較大超過4mm，結(jié)構(gòu)比較單一，其他區(qū)域結(jié)構(gòu)復(fù)雜，涉及的核團(tuán)較多，增加了對結(jié)果解釋的難度；(2)由于大鼠腦子小，在MRI掃描上只有尾狀核頭部易于辨識；(3)國外已有學(xué)者用此作為靶區(qū)2。1.2照射劑量，我們選定從10Gy到100Gy的10個(gè)等級劑量，臨床治療用的劑量在此范圍內(nèi)3，雖然有的學(xué)者在動(dòng)物實(shí)施過150Gy和200Gy的照射，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了臨床的實(shí)際用量，故未選用。1.3動(dòng)物的成活時(shí)間，我們參考有關(guān)文獻(xiàn)13將-刀照

28、射后，腦組織的放射神經(jīng)生物學(xué)效應(yīng)分為早期(即照后90d以內(nèi))，中期(照后90d至1年)和長期(照后1年以上)。我們觀察的是早期變化。2.關(guān)于Fos蛋白的表達(dá)及其意義2.1Fos蛋白表達(dá)顯示技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)c-fos早期原癌基因(c-fos proto oncogene)是存在于細(xì)胞內(nèi)的第三信使，當(dāng)受到刺激時(shí)，大多數(shù)細(xì)胞的反應(yīng)是c-fos mRNA和Fos蛋白的早期表達(dá)。用原位分子雜交技術(shù)顯示胞漿內(nèi)的c-fos mRNA，用免疫組織化學(xué)方法顯示胞核內(nèi)的Fos蛋白。c-fos mRNA和Fos蛋白的顯示技術(shù)作為神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)能形態(tài)學(xué)方法已被廣泛地采用4，5，6。當(dāng)機(jī)體受到刺激時(shí)，神經(jīng)系統(tǒng)與此機(jī)能相關(guān)的多

29、級神經(jīng)元可能出現(xiàn)陽性表達(dá)，而且非常敏感，這是其優(yōu)點(diǎn)。由于任何刺激均能引起相應(yīng)神經(jīng)元的c-fos表達(dá)，因此如何保證c-fos表達(dá)的特異性是至關(guān)重要的46。我們對實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了嚴(yán)格控制，盡量減少無關(guān)刺激對動(dòng)物的影響，并設(shè)置了對照組，從而保證結(jié)果的可靠性。2.2-刀照射后腦內(nèi)Fos陽性表達(dá)及其意義-刀照射后除靶區(qū)出現(xiàn)Fos陽性細(xì)胞外，在全腦某些非靶區(qū)部位(例如：皮質(zhì)、側(cè)腦室周圍的白質(zhì)、海馬以及下丘腦、杏仁中央核和延髓)也出現(xiàn)Fos陽性細(xì)胞，并顯示出與照射劑量和成活時(shí)間的相應(yīng)關(guān)系，有關(guān)結(jié)果另有報(bào)告7，故不贅述。我們發(fā)現(xiàn)在大劑量(70100Gy)照射或照后較長時(shí)間成活(3個(gè)月)后出現(xiàn)3種Fos陽性細(xì)胞，

30、即(1)胞核陽性，胞漿陰性；(2)胞核陰性，胞漿陽性；(3)胞核、胞漿均為陽性。我們認(rèn)為(1)為正常反應(yīng)細(xì)胞，(2)是嚴(yán)重受損細(xì)胞，(3)是中間過渡性細(xì)胞，并專題作了報(bào)告8，在此不重復(fù)。我們主要討論-刀照射尾狀核頭部后延髓內(nèi)Fos表達(dá)及其變化的意義。延髓內(nèi)臟帶(MVZ)是一個(gè)位于延髓中尾段，從背內(nèi)側(cè)，穿經(jīng)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)至腹外側(cè)延髓(VLM)的弧形帶狀區(qū)，呼吸中樞、心血管中樞等均位于MVZ內(nèi)，MVZ參與應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)，各種傷害性刺激(胃腸、心血管、軀體、內(nèi)分泌、免疫刺激)均引起MVZ內(nèi)神經(jīng)元的Fos表達(dá)，關(guān)于MVZ的結(jié)構(gòu)與機(jī)能，請參閱Rao和Ju的綜述9。-刀照射腦部，造成靶區(qū)腦組織的損傷，細(xì)胞變性、凋亡或壞死，因此靶區(qū)組織又形成了一個(gè)新的傷害性刺激源，通過神經(jīng)傳導(dǎo)或神經(jīng)體液途徑引起應(yīng)激反應(yīng)，MVZ內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生不同程度Fos表達(dá)。隨著照射劑量的增加，靶區(qū)組織的損傷也加重，應(yīng)激反應(yīng)也隨之加強(qiáng)，F(xiàn)os陽性細(xì)胞增多。錐體交叉平面和最后區(qū)平面MVZ內(nèi)Fos陽性胞核密集，向吻側(cè)至閂平面和閂吻側(cè)