人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增及向成軟骨樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化_圖文

1、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增及向成軟骨樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化邱麗燕,王金福(浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 浙江杭州 310012摘要 從人骨髓中分離和培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞,在原代和傳代培養(yǎng)中其形態(tài)學(xué)上均為貼壁、纖維狀的細(xì)胞,隨著代次的增加細(xì)胞形態(tài)更加趨于一致。流式細(xì)胞儀鑒定CD45、CD34、CD117、HLA-DR 陰性,CD29、CD166陽(yáng)性,并隨著培養(yǎng)的MSCs 代次的增加,陽(yáng)性比率和陰性比率出現(xiàn)相應(yīng)的上升和降低,說(shuō)明細(xì)胞純度增加。第三代的MSCs 大約有80%處于G 0/G 1期,S+G 2+M 期約20%左右,說(shuō)明MSCs 有強(qiáng)大的增殖潛能。MSCs 在傳代培養(yǎng)中的最適接種密度約為5.0×10

2、3/cm 2 左右。MSCs 在體外經(jīng)歷了滯緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、平穩(wěn)期三個(gè)時(shí)期,傳代培養(yǎng)的MSCs 生長(zhǎng)速度比原代的MSCs 明顯快很多。采用程序降溫法對(duì)MSCs 進(jìn)行凍存,6090天后對(duì)凍存的MSCs 進(jìn)行復(fù)蘇,發(fā)現(xiàn)MSCs 仍可在體外良好生長(zhǎng)46代,特定的MSCs 樣本可以擴(kuò)增10代,說(shuō)明經(jīng)過(guò)凍存的細(xì)胞仍具有良好的增殖能力。對(duì)四例標(biāo)本的前三代MSCs 在體外利用TGF 1和維生素C 誘導(dǎo)兩周后,用RT-PCR 證明MSCs 表達(dá)軟骨特異性的II 型前膠原的mRNA ,說(shuō)明我們培養(yǎng)的細(xì)胞具有向成軟骨樣細(xì)胞分化的潛能,由此進(jìn)一步證實(shí)其為MSCs 。關(guān)鍵詞 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 擴(kuò)增 成軟骨樣細(xì)胞Ex

3、pansion and Chondrogenic Induction of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Qiu Liyan, Wang Jinfu(College of Life Science, Zhejiang University, Hangzhou, Zhejiang 310012Abstract MSCs from human BM were isolated by Ficoll density centrifugation and cultured expanded in DMEM-LG containing FBS. MSCs

4、 are adherent and fibroblastic, and maintained similar morphology with passaging. Flow cytometry analysis indicated that MSCs were universally positive for CD29, CD166, and negative for CD34, CD45, CD117, and HLA-DR. At passage 3, cell cycle status analysis by measuring DNA content revealed that a s

5、mall population of the cells was engaged in proliferation (S+G 2+M=20%, and more than 80% of cells were in G 0/G 1 phase. The number of cells in G 0/G 1 phase decreased with passage. In passage culture, It is proper for the cells plated at the density of 5000 cells/cm 2 to propagate. The MSCs of pas

6、sage 1 to 3 were froze in liquid nitrogen by two-step frozen procedure ,after 6090 days, we thawed the frozen MSCs and found the cells can proliferate about 46 passages in vitro ,10 passages especially for sample 17. It suggested that the frozen MSCs still have good expansion ability. At passage 1 t

7、o 3, four cases was induced by the combination of TGF-1 and Vitamine C in vitro for two weeks and expressed articular cartilage matrix-procollagen II mRNA.Key word Mesenchymal stem cells (MSCs, expansion, chondrocyte骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells ,MSCs是存在于骨髓中的一類多能干細(xì)胞。Friedenstein 等1首先發(fā)現(xiàn)MSCs 在體外可分化為

8、骨和軟骨組織,即使經(jīng)過(guò)20-30次細(xì)胞分裂后,其分化特性也不會(huì)消失。Pittenger 等2通過(guò)擴(kuò)增單個(gè)MSCs 的克隆后,在不同的條件下誘導(dǎo)其分化,結(jié)果分別分化出骨,軟骨,脂肪組織。隨后,Piersma 等人發(fā)現(xiàn)MSCs 在體外除了可以誘導(dǎo)分化為骨、軟骨、脂肪外,甚至還可以分化為肌肉組織3, 4。最近又有學(xué)者證實(shí)MSCs 可以向神經(jīng)細(xì)胞、造血細(xì)胞等多種終末分化細(xì)胞分化5-7。Friedenstein 等1建立了MSCs 分離及擴(kuò)增的方法,并多次對(duì)該方法進(jìn)行了改進(jìn)。但是,人們對(duì)這種細(xì)胞本身的認(rèn)識(shí)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。至今還未能篩選到MSCs 特異性的標(biāo)記分子,尚未能建立鑒定MSCs 的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),不同實(shí)驗(yàn)

9、室的數(shù)據(jù)之間的可比性較差。所以,尋求MSCs 的穩(wěn)定培養(yǎng)條件還有待進(jìn)一步的研究。本文通過(guò)分離和體外培養(yǎng)擴(kuò)增MSCs ,觀察MSCs 的形態(tài),測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)態(tài),尋求MSCs合適的接種密度,利用流式細(xì)胞儀對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)記的測(cè)定和細(xì)胞周期的分析,并且通過(guò)體外誘導(dǎo)MSCs向軟骨方向分化,檢測(cè)軟骨特有的II型前膠原mRNA的表達(dá),從而研究MSCs的生物學(xué)性狀,為將來(lái)MSCs在組織工程,細(xì)胞工程,基因治療以及臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。1 材料和方法1.1 MSCs的分離和培養(yǎng):取成人骨髓3-5ml,用等量的PBS洗滌后900×g離心。沉淀用含10% FBS的DMEM-LG 培養(yǎng)液重新混勻后,用F

10、icoll分離液分離和收集單個(gè)核細(xì)胞層。調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至5×106/ml,接種于底面積為25cm2的培養(yǎng)瓶中,放置于37,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),48h后更換培養(yǎng)液。當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)到培養(yǎng)瓶底的大約90%時(shí),用消化液消化和懸浮細(xì)胞。經(jīng)離心洗滌后,重新懸浮細(xì)胞。按1:3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。1.2流式細(xì)胞儀分析培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)到大約80-90%融合后,用消化液消化成單細(xì)胞懸液,400×g離心后收集細(xì)胞。分別加入熒光標(biāo)記的抗體,4孵育30min,然后PBS洗去未標(biāo)記抗體,10g/L多聚甲醛固定。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞CD34、CD29、CD45、CD166、CD117、HLA-DR表面抗

11、原。每個(gè)樣本至少分析1×105個(gè)細(xì)胞。1.3細(xì)胞周期的測(cè)定將貼壁細(xì)胞消化,70%冷乙醇4固定24h,PBS液洗滌細(xì)胞二遍, 10mg/mlPI染液染色(4避光30min,用流式細(xì)胞儀FACScan檢測(cè),Multicycle軟件分析結(jié)果。1.4接種密度取生長(zhǎng)旺盛時(shí)期的細(xì)胞,以如下密度:1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0×103/cm2接種于12孔板中。培養(yǎng)10天后用消化液消化,并記數(shù)細(xì)胞量。以接種密度為橫坐標(biāo),細(xì)胞擴(kuò)增的倍數(shù)為縱坐標(biāo)作圖,尋找最合適的細(xì)胞接種密度.1.5生長(zhǎng)曲線的測(cè)定取生長(zhǎng)良好的MSCs的P2,P4,P6代細(xì)胞,以

12、1×104個(gè)/孔接種于24孔板中,加入含10%FBS的DMEM-LG培養(yǎng)液,每24h計(jì)數(shù)3孔細(xì)胞。以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo),天數(shù)為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。1.6 MSCs的凍存將生長(zhǎng)情況良好的P1、P2、P3代的MSCs用消化液消化成單細(xì)胞懸液,400×g離心后收集細(xì)胞沉淀。用凍存液重懸細(xì)胞,使細(xì)胞密度達(dá)到1×106個(gè)/ml。于4冰箱中平衡后,放入預(yù)冷4的程序降溫儀中,用兩步降溫法:第一階段:4-40,降溫速率1/min;第二階段:-40-80,降溫速率為5/min。然后-196液氮罐內(nèi)保存。復(fù)溫時(shí)從液氮中取出樣品立即放入40水浴鍋內(nèi)搖動(dòng)凍存管,1-2min復(fù)溫完畢, 4

13、00×g離心后收集細(xì)胞,加入新鮮培養(yǎng)液放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.7 成軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)選前三代生長(zhǎng)良好的MSCs,消化后制成單細(xì)胞懸液,以3×104/ml的密度接種于細(xì)胞瓶中。待細(xì)胞達(dá)到80-90%融合后,實(shí)驗(yàn)組3瓶加入成軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)液(DEME高糖培養(yǎng)液,10%胎牛血清,100u/ml青霉素,100g/ml鏈霉素,TGF110ng/ml,抗壞血酸50µg/ml,對(duì)照組繼續(xù)用常規(guī)培養(yǎng)液,每隔三天換液一次。14天后終止誘導(dǎo)。提取總RNA,設(shè)計(jì)II型前膠元的引物序列,COL(II上游:5-TTCAGC TATGGAGATGACAATC-3,下游:5-AGAGTCCT

14、AGAGTGACTGAG-3,產(chǎn)物片斷475bp,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后觀察,檢測(cè)II型前膠元mRNA的表達(dá)。2 結(jié)果2.1 MSCs的培養(yǎng)擴(kuò)增及形態(tài)特征從骨髓中分離單個(gè)核細(xì)胞接種培養(yǎng)后,24h即可觀察到部分細(xì)胞貼壁,貼壁的細(xì)胞大部分為圓形,橢圓形,有少數(shù)伸出突起的細(xì)胞;48-72h可觀察到貼壁的細(xì)胞大部分呈纖維狀,也有少量的為寬闊、平坦的三角狀、星狀等;接種后5-7天,可見(jiàn)明顯的集落形成(圖1A。集落中的細(xì)胞不斷擴(kuò)增,呈放射狀向周圍擴(kuò)展,逐漸與鄰近集落相融合。大約14-17天的時(shí)間,原代培養(yǎng)的細(xì)胞相互匯合可達(dá)到90%的生長(zhǎng)表面。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞24h之內(nèi),絕大部分細(xì)胞貼

15、壁且成纖維狀,更換培養(yǎng)液將未貼壁的造血細(xì)胞排除,約4-7天傳代培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到90%的融合(圖1B。經(jīng)傳代培養(yǎng)后,細(xì)胞的形態(tài)更加趨于一致。 A B圖1 原代MSCs形成的集落(A和傳代培養(yǎng)形成貼壁細(xì)胞層的MSCs(B(10×10倍 Figure 1. MSC colonies in the first generation culture (A and the confluent MSC layer inthe passaging culture (B (10×102.2 細(xì)胞周期結(jié)果用流式細(xì)胞儀測(cè)定人MSCs內(nèi)DNA的含量,第3代細(xì)胞處于分裂期(S+G2+M的約19.5%左

16、右,處于G0/G1期的細(xì)胞的約81.5%左右(如圖2。 圖2:人MSCs細(xì)胞周期檢測(cè)Figure 2. The cell cycle of MSCs during the Log phase of growth.On the average, 81.5% of cells were at G0/G1, 12.6% at S, and 5.9% at G2/M phase of cell cycle2.3 MSCs表面標(biāo)記物的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析,培養(yǎng)的MSCs CD45、CD34、CD117和HLA-DR陰性,CD29、CD166陽(yáng)性(圖3。對(duì)同一標(biāo)本的第二代至第四代進(jìn)行MS

17、Cs表面標(biāo)記物的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)不但同一代細(xì)胞不同標(biāo)記物陽(yáng)性或陰性的比例不同,不同代次的細(xì)胞同一標(biāo)記物的比例也不同。隨代次的增加,其中CD166的陽(yáng)性比例由68.9%上升到93.5%,CD29的陽(yáng)性比例由48.8%上升到87.4%。 HLA-DR CD29 CD45 CD34 CD117 CD166圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs表面標(biāo)記物Figure 3. Flow cytometry analysis of MSCs It indicates that MSCs were universally positive for CD29, CD166,and negative for CD34, CD45

18、, CD117, and HLA-DR.2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線MSCs的生長(zhǎng)曲線呈S型,符合Loigistic生長(zhǎng)曲線。骨髓MSCs傳代培養(yǎng)的細(xì)胞較原代的細(xì)胞生長(zhǎng)要快,一般在接種后的第47天即可鋪滿培養(yǎng)底面;多數(shù)樣本在第710代出現(xiàn)衰老現(xiàn)象?？梢园l(fā)現(xiàn)傳代培養(yǎng)具有以下特征(如圖4:(1每次傳代培養(yǎng)的生長(zhǎng)滯緩期24 36h;(2每次傳代培養(yǎng)的骨髓MSCs對(duì)數(shù)增殖期為24天;(3對(duì)數(shù)增殖期結(jié)束后,進(jìn)入平臺(tái)期。圖4是標(biāo)本15的P2、P4、P6代傳代培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線,隨著代次的增加,MSCs 的增殖能力開(kāi)始減弱。 圖4 人骨髓MSCs 的P2、P4、P6代傳代培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線Figure 4. Growth dynamics of MSCs in P2, P4 and P6 passages2.5 最適接種密度將生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞以不同密度接種于12孔板中,倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。以13×10