第二章第二節(jié)分子熒光和磷光分析法

1、*第二章第二章 分子發(fā)光分析法分子發(fā)光分析法一、一、 儀器與結(jié)構(gòu)流程儀器與結(jié)構(gòu)流程instrument and general process 二、二、 熒光分析法和應(yīng)用熒光分析法和應(yīng)用fluorescence analysis and application三、三、 磷光分析法及應(yīng)用磷光分析法及應(yīng)用phosphorescence analysis and application第二節(jié)第二節(jié) 分子熒光與磷光分析法分子熒光與磷光分析法molecular luminescenceanalysis molecular fluorescence and phosphorescence analysis

2、 *一、儀器結(jié)構(gòu)流程一、儀器結(jié)構(gòu)流程 測(cè)量熒光的儀器主要由測(cè)量熒光的儀器主要由五個(gè)部分五個(gè)部分組成：激發(fā)光源、組成：激發(fā)光源、激發(fā)激發(fā)單色器、單色器、樣品池、樣品池、發(fā)射單色器和發(fā)射單色器和檢測(cè)器。檢測(cè)器。 特殊點(diǎn)特殊點(diǎn)：有兩個(gè)單色器，光源與檢測(cè)器通常成直角。：有兩個(gè)單色器，光源與檢測(cè)器通常成直角。高壓汞燈是以汞蒸氣放電發(fā)高壓汞燈是以汞蒸氣放電發(fā)光的光源，主要有光的光源，主要有365、405、436nm 的三條譜線(xiàn)的三條譜線(xiàn)，尤以，尤以365nm譜線(xiàn)最強(qiáng)，譜線(xiàn)最強(qiáng)，一般濾光片式的熒光計(jì)多采一般濾光片式的熒光計(jì)多采用它為激發(fā)光源用它為激發(fā)光源 光源要求強(qiáng)光源要求強(qiáng)度大、使用度大、使用波長(zhǎng)范圍寬波

3、長(zhǎng)范圍寬*1.1.定量依據(jù)與方法定量依據(jù)與方法(1)定量依據(jù)定量依據(jù) 熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度 If正比于正比于吸收的光量吸收的光量Ia和熒光量子效率和熒光量子效率 的乘積的乘積： If = Ia （1）式）式 根據(jù)吸收定律，根據(jù)吸收定律，I0入射光強(qiáng)度，入射光強(qiáng)度， It透射光強(qiáng)透射光強(qiáng)度，則度，則 Ia=I0- It （2）式）式 由朗由朗-比耳定律：比耳定律：A= lg(I0/It)= bc It=I010-A=I010- bc Ia = I0(1-10- b c ) （3）式）式 If = I0(1-10- bc ) = I0(1-e-2.3 b c ) （4）式）式 將上式展開(kāi)，得：將上式展

4、開(kāi)，得： 二、熒光分析方法與應(yīng)用二、熒光分析方法與應(yīng)用If = Kc當(dāng)當(dāng)I0一定時(shí)，得一定時(shí)，得! 332! 23232320f ).().(.IIbcbcbc濃度很低時(shí)（濃度很低時(shí)（A = bc 0.05時(shí)），時(shí)），得：得： If = 2.3 I0 b c I0It入射光入射光透過(guò)光透過(guò)光*定量關(guān)系的成立條件為：定量關(guān)系的成立條件為： bc小于小于0.05 ，此時(shí)，此時(shí) 與濃度與濃度無(wú)關(guān)，為定值；無(wú)關(guān)，為定值； 即這種線(xiàn)性關(guān)系即這種線(xiàn)性關(guān)系只有在極稀的溶液中才成立只有在極稀的溶液中才成立 對(duì)于較濃溶液，對(duì)于較濃溶液， 由于猝滅由于猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強(qiáng)現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強(qiáng)度

5、與濃度不成線(xiàn)性關(guān)系。度與濃度不成線(xiàn)性關(guān)系。If = 2.3 I0 b c If = Kc問(wèn)問(wèn):為什么熒光分析法的靈敏度比相應(yīng)的吸收光度法高為什么熒光分析法的靈敏度比相應(yīng)的吸收光度法高?熒光強(qiáng)度疊加在很小的背景值上，提高熒光訊號(hào)的放大熒光強(qiáng)度疊加在很小的背景值上，提高熒光訊號(hào)的放大倍數(shù)倍數(shù); I0A= lg(I0/It)*（2 2）定量方法）定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法： 配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測(cè)定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測(cè)定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，再在相同條件下測(cè)量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)，再在相同條件下測(cè)量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上求出濃度；上求出濃度；1.

6、 確定確定 ex和和 em (激發(fā)光譜和發(fā)射光譜激發(fā)光譜和發(fā)射光譜)；2. 確定適宜的條件確定適宜的條件: 試劑濃度、試劑濃度、pH、T、t 等；等；3. 以標(biāo)準(zhǔn)溶液做工作曲線(xiàn)；以標(biāo)準(zhǔn)溶液做工作曲線(xiàn)；4. 測(cè)未知樣的熒光強(qiáng)度測(cè)未知樣的熒光強(qiáng)度(If), 根據(jù)工作曲線(xiàn)計(jì)算熒光根據(jù)工作曲線(xiàn)計(jì)算熒光物質(zhì)的濃度物質(zhì)的濃度. If = Kc*3.3.熒光分析法的應(yīng)用熒光分析法的應(yīng)用(1)(1)無(wú)機(jī)化合物的分析無(wú)機(jī)化合物的分析 與有機(jī)試劑形成配合物后測(cè)量；可測(cè)量約與有機(jī)試劑形成配合物后測(cè)量；可測(cè)量約6060多種元素。多種元素。 鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采

7、用熒光分析法； 氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測(cè)定；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測(cè)定； 銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過(guò)氧化氫采用催化熒光法測(cè)定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過(guò)氧化氫采用催化熒光法測(cè)定； 鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y(cè)定鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y(cè)定( (液氮溫度液氮溫度-196-196) )； 鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測(cè)定鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測(cè)定 如：如：pH=8.50,Cu2+能催化過(guò)氧化氫氧化羅丹明能催化過(guò)氧化氫氧化羅丹明6G,使其發(fā)使其發(fā)生熒光猝滅生熒光猝滅,建立了測(cè)定微量建立了測(cè)定微量Cu2+的催化熒光分析法的催化熒光分析法. 如如:鈾的測(cè)定鈾的測(cè)定

8、:將將80gNaF壓制成片壓制成片,取含鈾溶液滴在片上取含鈾溶液滴在片上,在在1000燒成熔珠后測(cè)量燒成熔珠后測(cè)量.*(2)生物與有機(jī)化合物的分析生物與有機(jī)化合物的分析 脂肪族有機(jī)化合物脂肪族有機(jī)化合物般需要與某些試劑反般需要與某些試劑反應(yīng)后才能進(jìn)行熒光分析。應(yīng)后才能進(jìn)行熒光分析。 帶苯環(huán)的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯帶苯環(huán)的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸，可以直借用熒光法測(cè)定?；彼?，可以直借用熒光法測(cè)定。 見(jiàn)表見(jiàn)表. 芳香族化合物具有共軛的不飽和體系，多芳香族化合物具有共軛的不飽和體系，多能發(fā)熒光。此外，胺類(lèi)、蛋白質(zhì)、酶與輔酶能發(fā)熒光。此外，胺類(lèi)、蛋白質(zhì)、酶與輔酶、維生素等均可用熒光法

9、進(jìn)行分析。、維生素等均可用熒光法進(jìn)行分析。*磷光分析法基本原理磷光分析法基本原理一、磷光的產(chǎn)生和磷光強(qiáng)度一、磷光的產(chǎn)生和磷光強(qiáng)度 磷光是由處于第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的磷光是由處于第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的分子躍遷返回基態(tài)時(shí)所產(chǎn)生的輻射。分子躍遷返回基態(tài)時(shí)所產(chǎn)生的輻射。二、與熒光比較，磷光的特點(diǎn)：二、與熒光比較，磷光的特點(diǎn)： (1)磷光輻射的波長(zhǎng)比熒光長(zhǎng)；磷光輻射的波長(zhǎng)比熒光長(zhǎng)； (2)磷光的發(fā)光速率慢，但具有較長(zhǎng)的壽命；磷光的發(fā)光速率慢，但具有較長(zhǎng)的壽命； (3)磷光的壽命和輻射強(qiáng)度對(duì)于重原子和順磁性離子非常敏感磷光的壽命和輻射強(qiáng)度對(duì)于重原子和順磁性離子非常敏感 （4）發(fā)光效率受溫度

10、影響大。）發(fā)光效率受溫度影響大。 由于三重態(tài)的壽命長(zhǎng)，激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子發(fā)生碰撞由于三重態(tài)的壽命長(zhǎng)，激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子發(fā)生碰撞去激發(fā)的幾率增大，使磷光強(qiáng)度減弱甚至消失。去激發(fā)的幾率增大，使磷光強(qiáng)度減弱甚至消失。 當(dāng)磷光物質(zhì)濃度很小時(shí)：當(dāng)磷光物質(zhì)濃度很小時(shí)： Ip = Kc*2重原子效應(yīng)：重原子效應(yīng)：1增加試樣的剛性增加試樣的剛性3.室溫磷光室溫磷光(1)固體磷光法：在室溫下以固體基質(zhì)吸附磷光體，增加分子固體磷光法：在室溫下以固體基質(zhì)吸附磷光體，增加分子剛性剛性,減少三重態(tài)猝滅等非輻射躍遷，從而提高磷光量子效率減少三重態(tài)猝滅等非輻射躍遷，從而提高磷光量子效率。 濾紙、纖維素色層紙、氧化鋁、硅

11、膠等濾紙、纖維素色層紙、氧化鋁、硅膠等 這種方法可減小質(zhì)點(diǎn)間的碰撞幾率這種方法可減小質(zhì)點(diǎn)間的碰撞幾率,以減小無(wú)輻射躍遷以減小無(wú)輻射躍遷.低低溫?zé)晒夥ň褪腔谶@一原理的：在低溫下（溫?zé)晒夥ň褪腔谶@一原理的：在低溫下（77K)，將試樣的，將試樣的乙醚或異戊醇溶液冷凍成透明玻璃狀后測(cè)定。乙醚或異戊醇溶液冷凍成透明玻璃狀后測(cè)定。 重原子的高核電荷使磷光分子的電子能級(jí)交錯(cuò)，容易重原子的高核電荷使磷光分子的電子能級(jí)交錯(cuò)，容易引起或增強(qiáng)磷光分子的自旋軌道偶合作用，從而使引起或增強(qiáng)磷光分子的自旋軌道偶合作用，從而使S1T1的的系間竄躍概率增大，有利于增大磷光效率。除了使用含有系間竄躍概率增大，有利于增大磷光

12、效率。除了使用含有重原子的溶劑外，還可采用重原子的溶劑外，還可采用Ag+鹽、鹽、Pb2+鹽和鹽和T1+鹽等重金鹽等重金屬鹽類(lèi)。屬鹽類(lèi)。三、為了獲得較強(qiáng)的磷光，宜采用以下措施三、為了獲得較強(qiáng)的磷光，宜采用以下措施:*(3)敏化磷光敏化磷光(2)膠束增穩(wěn)：膠束增穩(wěn)： 利用表面活性劑在臨界濃度形成具多相性的膠束，改變利用表面活性劑在臨界濃度形成具多相性的膠束，改變磷光體的微環(huán)境，增加定向約束力，使其剛性增強(qiáng)。從而減磷光體的微環(huán)境，增加定向約束力，使其剛性增強(qiáng)。從而減小碰撞等去活化的幾率，提高三重態(tài)的穩(wěn)定性小碰撞等去活化的幾率，提高三重態(tài)的穩(wěn)定性 如：在表面活性劑十二烷基硫酸鹽和重原子離子如：在表面活

13、性劑十二烷基硫酸鹽和重原子離子T1+ (鉈鉈，音，音ta)和和Pb2+的存在下，室溫可測(cè)定的存在下，室溫可測(cè)定10-610-7mol的萘、芘的萘、芘和聯(lián)苯，精密度達(dá)和聯(lián)苯，精密度達(dá)6%。采用這種方法，可采用這種方法，可測(cè)定測(cè)定10-9mol/L的可卡因。的可卡因。 分析物本分析物本身年個(gè)并不發(fā)身年個(gè)并不發(fā)磷光磷光,而是引而是引發(fā)受體發(fā)磷光發(fā)受體發(fā)磷光.*四、磷光分析儀器四、磷光分析儀器 熒光計(jì)上配上磷光測(cè)量附件即可對(duì)磷光進(jìn)行測(cè)量。在有熒光計(jì)上配上磷光測(cè)量附件即可對(duì)磷光進(jìn)行測(cè)量。在有熒光發(fā)射的同時(shí)測(cè)量磷光。熒光發(fā)射的同時(shí)測(cè)量磷光。 測(cè)量方法：測(cè)量方法：（1 1）通常借助于熒光和磷）通常借助于熒光

14、和磷光壽命的差別，在激發(fā)光被光壽命的差別，在激發(fā)光被旋轉(zhuǎn)斬光片阻斷時(shí)，熒光停旋轉(zhuǎn)斬光片阻斷時(shí)，熒光停止發(fā)射，而磷光則持續(xù)發(fā)射止發(fā)射，而磷光則持續(xù)發(fā)射。采用磷光鏡的裝置將熒光。采用磷光鏡的裝置將熒光隔開(kāi)。隔開(kāi)。（2 2）還可采用脈沖光源和）還可采用脈沖光源和可控檢測(cè)及時(shí)間分辨技術(shù)?？煽貦z測(cè)及時(shí)間分辨技術(shù)。 室溫測(cè)量時(shí)，不需要杜瓦瓶。室溫測(cè)量時(shí)，不需要杜瓦瓶。 與熒光計(jì)區(qū)別：與熒光計(jì)區(qū)別：1.樣品池樣品池 2.斬光器斬光器*三、磷光分析法的應(yīng)用三、磷光分析法的應(yīng)用1.1.稠環(huán)芳烴和稠環(huán)芳烴和石油產(chǎn)品石油產(chǎn)品分析分析 采取固體表面室溫磷光分析法快速靈敏測(cè)定稠環(huán)芳烴和采取固體表面室溫磷光分析法快速靈敏測(cè)定稠環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物（致癌物質(zhì)）；雜環(huán)化合物（致癌物質(zhì)）；如：芘、苯并芘、萘酚等，如：芘、苯并芘、萘酚等，見(jiàn)表見(jiàn)表2