淺談抑癌基因在肺癌治療中的新進(jìn)展

1、淺談抑癌基因在肺癌治療中的新進(jìn)展    肺癌是當(dāng)前最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率逐年升高。由于大多數(shù)肺癌患者臨床確診時已屬晚期，其中50%以上患者不能手術(shù)，而絕大部分非小細(xì)胞肺癌（nsclc）患者（占肺癌的75%80%，包括鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌等）對現(xiàn)行放療和化療又不夠敏感，因此肺癌的治療成為臨床治療一大難題。近來人們研究的熱點集中到肺癌的基因治療上，并取得了許多重要進(jìn)展?，F(xiàn)主要對肺癌的基因治療方法之一?抑癌基因治療肺癌的研究新進(jìn)展作一綜述。 一、抑癌基因及其與細(xì)胞周期關(guān)系 抑癌基因（tumor suppressor gene）指正常細(xì)胞內(nèi)存在的

2、，能抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生的一類基因群，當(dāng)它們受到各種因子的作用失活后，細(xì)胞的生長分化失控，增加了細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的可能性。目前已分離克隆的抑癌基因有rb、p53、p16、p33ing1、nm23、timp、kai1、aph、mcc、apc、dcc、brca1等，最近被認(rèn)為候選抑癌基因的有fhit、pten/mmac1/tep1等。 rb基因又名成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因, 是最早發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因, 定位于人染色體13q14上，編碼的一組dna結(jié)合蛋白與細(xì)胞分化的過程有關(guān)，具有抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力。與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因目前認(rèn)為是p53基因，該基因定位于17p13.1, 編碼的核磷酸蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活的

3、作用，正常的p53基因具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，且dna損傷后可觸發(fā)細(xì)胞凋亡，防止惡變。近幾年來發(fā)現(xiàn)的p16基因即多腫瘤抑制基因1(multiple tumor suppressor 1, mts1) ，定位于人類多種惡性腫瘤頻繁發(fā)生缺失的染色體區(qū)域9p21，p16表達(dá)產(chǎn)物的基本功能是作為細(xì)胞周期素依賴激酶4(cyclin dependent kinase 4,cdk4)抑制蛋白。 新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因p33ing1，定位于染色體11q33，需依賴于野生型p53，才能發(fā)揮細(xì)胞生長的抑制效應(yīng)。而定位在人染色體5q21的抑癌基因mcc、apc在肺癌中經(jīng)常表現(xiàn)為純合性缺失，在小細(xì)胞肺癌（sclc)

4、細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，抑癌基因aph、mcc、apc的表達(dá)低下，提示它們可能與sclc的形成有關(guān)。nm23、timp、kai1基因的作用是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。dcc（結(jié)直腸癌缺失基因）是在結(jié)腸癌中新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因。 brca1抑癌基因主要與家族性乳腺癌和卵巢癌的發(fā)生有關(guān)。fhit基因定位于人染色體3p14.2，與肺癌、乳腺癌、腸癌、胰腺癌等有關(guān)，染色體3p是乳腺癌、肺癌、卵巢癌等腫瘤的經(jīng)常缺失區(qū)，抑癌基因aph也位于3p區(qū)（3p21.3）。pten/mmac1/tep1基因定位于人染色體10q23，在肺癌發(fā)現(xiàn)有突變。 抑癌基因的抑癌功能主要是通過在細(xì)胞增殖周期對細(xì)胞分裂和生長進(jìn)行負(fù)調(diào)控，防止細(xì)胞周期失控變成

5、無限制地增殖而實現(xiàn)的。 細(xì)胞周期中有兩個重要的調(diào)節(jié)點，即g1-s和g2-m調(diào)節(jié)點。細(xì)胞周期的運(yùn)行主要依賴于細(xì)胞周期依賴性激酶（cdk），該酶只有與細(xì)胞周期素（cyclins）結(jié)合才有活性，可促進(jìn)細(xì)胞周期中g(shù)1s和g2m的轉(zhuǎn)變。在細(xì)胞周期素中最有意義的是細(xì)胞周期蛋白d（cyclin d），它能激活cdk2、4、5，促進(jìn)細(xì)胞由g1期進(jìn)入s期，進(jìn)行dna合成。 目前認(rèn)為p53、p16、rb基因與g1-s調(diào)節(jié)點有關(guān)。p53基因的表達(dá)產(chǎn)物p53蛋白的作用機(jī)制主要是間接作用于細(xì)胞周期，p53可促進(jìn)p21蛋白（cdk2的抑制劑）的表達(dá)，從而在細(xì)胞周期中抑制g1期至s期的轉(zhuǎn)換，阻礙細(xì)胞進(jìn)入dna合成期，使細(xì)胞

6、分裂和生長受到抑制。而p16具有直接的細(xì)胞生長抑制效應(yīng)，p16與細(xì)胞周期蛋白d競爭同cdk4的結(jié)合，當(dāng)p16與cdk4結(jié)合后，cdk4/cyclin復(fù)合物活性受到抑制，細(xì)胞分裂生長受阻。cdk/cyclin復(fù)合物對rb蛋白具有磷酸化作用，rb被磷酸化后其g1期停滯作用喪失，而rb非磷酸化時可阻止細(xì)胞由g1期進(jìn)入s期。 p53基因較為特殊，與g2-m調(diào)節(jié)點又有一定關(guān)系，是參與細(xì)胞凋亡的重要基因。野生型p53基因使細(xì)胞在離子輻射、藥物刺激引起dna損傷后停留在g1期進(jìn)行修復(fù)，若dna修復(fù)失敗，細(xì)胞 就進(jìn)入凋亡。若p53基因發(fā)生突變，則細(xì)胞對dna損傷因素引起的細(xì)胞凋亡耐受性增加，因此突變型p53基

7、因可影響放療、化療的療效。細(xì)胞凋亡與cdk2基因編碼p34cdk2激酶（即m期促進(jìn)因子）的活化有關(guān)，p34cdk2具有g(shù)1s和g2m雙重作用，p34cdk2激酶過早激活，可引起dna裂解和細(xì)胞核破壞，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 一般認(rèn)為癌變的重要原因是細(xì)胞周期的失控。當(dāng)rb基因缺失、突變或磷酸化失活后，則促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入s期，當(dāng)p53、p16基因突變或缺失時，則可間接或直接造成具有促增殖活性的cdk的過度表達(dá)，產(chǎn)生細(xì)胞增殖失控導(dǎo)致癌變。 二、抑癌基因與肺癌的發(fā)生和發(fā)展 近年來隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，在分子水平認(rèn)識到肺癌的形成是一個多步驟的過程，有多種基因功能失常，包括原癌基因的激活與抑癌基因的滅活等，才導(dǎo)致

8、惡性腫瘤細(xì)胞增殖到腫瘤形成。與肺癌有關(guān)的原癌基因包括 myc、 ras 、erbb-1、 c-erbb-2、 bcl-2 、 c-fos 、c-jun、c-raf-1、c-src、 lck基因等，約30%的nsclc細(xì)胞系中有ras基因突變，幾乎所有的nsclc（95%的鱗癌，75%的腺癌）中可見到c-erbb-1蛋白的過度表達(dá)，c-erbb-2 在25%的nsclc細(xì)胞系中有過度表達(dá)，bcl-2基因在凋亡中起負(fù)調(diào)控作用，在nsclc中可有表達(dá)。與肺癌有關(guān)的抑癌基因有p53、rb、 p16 、aph、 mcc、apc、nm23 、kai1 等。bai等1通過對臨床肺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌的發(fā)

9、展中，可同時有抑癌基因p53突變和癌基因 myc過度表達(dá)，而p53基因不是預(yù)后標(biāo)記，決定預(yù)后的因素是myc過度表達(dá)。 rb基因的缺失最初是在家族性成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤研究中發(fā)現(xiàn)的，后來在許多腫瘤細(xì)胞中都可觀察到rb基因的缺失或失活，如小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、骨肉瘤等，在肺癌組織和細(xì)胞系中rb基因異常多表現(xiàn)為雜合子丟失、基因突變等。michael等2研究發(fā)現(xiàn)88%的sclc和12%的nsclc細(xì)胞系中存在rb基因產(chǎn)物表達(dá)的缺失。 p53基因突變在人類許多常見腫瘤中均可檢測到，包括肝癌、胃癌、大腸癌、食道癌、子宮癌，肺癌等，p53基因突變是不同類型肺癌中最常見的基因改變，且出現(xiàn)的頻率比其它

10、腫瘤要高得多。takahashi等3發(fā)現(xiàn)sclc中p53基因突變率最高，可達(dá)80%，nsclc中p53基因突變率也可達(dá)60%。 p16基因的正常功能丟失的主要方式是p16基因的純合性缺失，在人類眾多惡性腫瘤中相當(dāng)普遍存在p16基因的純合性缺失，包括惡性間皮瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、星形細(xì)胞瘤、白血病、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、骨肉瘤、食管癌、胰腺癌等。michael等2發(fā)現(xiàn)23% nsclc 細(xì)胞株可檢測到p16基因的純合性缺失，而只有1% 的sclc細(xì)胞株存在p16基因缺失。 washimi等4對原發(fā)性肺癌的檢測發(fā)現(xiàn)30%的nsclc有p16的純合性缺失，而sclc中未發(fā)現(xiàn)。許多研究結(jié)果2,4-

11、6 均表明，p16基因的失活在nsclc形成中起重要作用，與sclc的形成關(guān)系不大，在sclc的細(xì)胞株及原發(fā)腫瘤中很少檢測到p16基因的改變，而在nsclc的細(xì)胞株及原發(fā)腫瘤中常見p16基因純合性缺失。kratzke等7還發(fā)現(xiàn)p16純合性缺失的檢出率在nsclc晚期比早、中期高得多，這就使p16基因具有一定的nsclc臨床預(yù)后判斷的意義。 候選抑癌基因fhit在nsclc及sclc中經(jīng)常出現(xiàn)缺失，fhit在肺癌中的缺失一般提示預(yù)后差。而候選抑癌基因pten/mmac1/tep1的突變在肺癌的發(fā)生中目前認(rèn)為只與sclc有關(guān)，與nsclc關(guān)系不大。 三、抑癌基因與肺癌基因治療研究 肺癌的基因治療是

12、指經(jīng)某種途徑引入外源基因到肺癌細(xì)胞以糾正或補(bǔ)償基因的缺陷，從而達(dá)到治療目的。肺癌的基因治療包括抑癌基因治療、反義基因治療、藥物敏感基因治療、耐藥基因治療、免疫基因治療等。 肺癌的發(fā)生源于多基因損傷，抑癌基因的缺失或突變是導(dǎo)致肺癌發(fā)生的原因之一。許多研究者都在探索肺癌的抑癌基因治療，即將外源正常的抑癌基因如rb基因、p53基因、p16基因等導(dǎo)入肺癌細(xì)胞，以恢復(fù)抑癌基因抑制細(xì)胞增殖的功能，從而抑制肺癌細(xì)胞的惡性增長，達(dá)到肺癌的治療作用。目前研究最多的是抑癌基因p53。takahashi等3發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)單個抑癌基因的功能，可明顯有效抑制多基因改變引起的肺癌的發(fā)生和生長，該研究中利用野生型p53基因轉(zhuǎn)染

13、同時有p53突變或純合子缺失、癌基因 ras 突變、c-myc 過度表達(dá)的不同肺癌細(xì)胞系，結(jié)果均有生長抑制作用，而對于本身具有野生型p53基因的肺癌細(xì)胞，導(dǎo)入外源野生型p53基因后，產(chǎn)生的生長抑制作用則不明顯。fujiwara等8以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體將野生型p53基因轉(zhuǎn)染人nsclc細(xì)胞h226br，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在體外生長明顯受到抑制。在裸鼠體內(nèi)移植人肺癌細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)p53基因?qū)Ψ伟┯忻黠@抑制作用。fujiwara等8在裸鼠氣管內(nèi)接種p53突變的人肺癌細(xì)胞系h226br的細(xì)胞懸液，3天后用攜帶野生型p53基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行治療，采用氣管滴入法，每日1次，連續(xù)3天，30天后觀察到治療組只有0%38

14、%的裸鼠肺內(nèi)形成了腫瘤，而對照組中62%82% 的裸鼠發(fā)生了腫瘤，且治療組中裸鼠發(fā)生的腫瘤的體積亦明顯小于對照組。高振強(qiáng)等9在裸鼠成瘤試驗中發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入野生型p53基因的人肺腺癌細(xì)胞系，成瘤晚，生長速度明顯減慢，其速度明顯低于對照細(xì)胞系和導(dǎo)入突變型p53基因的細(xì)胞系，結(jié)果證明p53基因有抑癌功能。zou等10在動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，氣管內(nèi)腫塊局部注入脂質(zhì)體和野生型p53基因復(fù)合物，可顯著抑制早期癌腫生長。在外源性野生型p53基因?qū)θ朔伟┘?xì)胞生長的抑制作用的進(jìn)一步研究中，汪蕙等11采用基因槍介導(dǎo)外源野生型p53基因，建立人肺巨細(xì)胞癌系801-d的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系801-d- p53，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染細(xì)胞系801-d

15、-p53體外長期傳代有外源p53基因存在，轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長明顯受到抑制，裸鼠異種移植致瘤性降低，腫瘤生長明顯緩慢。這是國內(nèi)首次成功地運(yùn)用基因槍轉(zhuǎn)移外源p53基因到人肺癌細(xì)胞。 大量的細(xì)胞、動物體內(nèi)的研究表明，單獨運(yùn)用病毒或非病毒為載體的野生型p53基因已經(jīng)具有明顯的抑制肺癌的效果。 盡管p16基因研究起步比p53基因晚，還有許多問題待解決，但由于p16基因的純合性缺失在許多惡性腫瘤中存在，且p16基因小，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量僅為p53的1/4，便于重組和導(dǎo)入，因此理論上認(rèn)為p16基因用于腫瘤的基因治療更為可行。jin 等12將野生型p16基因通過腺病毒載體導(dǎo)入p16基因缺失的肺癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞

16、被阻滯在g1期，無法進(jìn)入s期，導(dǎo)致肺癌細(xì)胞體內(nèi)、體外生長受到抑制。研究結(jié)果為p16抑癌基因為肺癌基因治療提供了有力依據(jù)。 由于野生型p53基因在化療或放療引起的dna損傷而導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡中是必需成分，因此化療或放療與p53基因聯(lián)合可具有更強(qiáng)的抗腫瘤性。fujiwara等13 研究發(fā)現(xiàn)腺病毒為載體的野生型p53基因可使人類nsclc細(xì)胞系h358對化療藥物順鉑（cddp）的敏感性在體外、裸鼠體內(nèi)有所增強(qiáng)，而且p53基因與化療藥物順鉑聯(lián)合應(yīng)用，可出現(xiàn)肺癌腫塊局部大片凋亡。roth等14 1996年提出利用腺病毒載體構(gòu)建野生型p53表達(dá)質(zhì)粒，聯(lián)合化療藥物順鉑治療nsclc的臨床方案，在臨床前的細(xì)胞及

17、動物研究中發(fā)現(xiàn)p53基因可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，并引起腫塊局部的大片凋亡，單獨使用p53基因或順鉑治療nsclc，未觀察到明顯的凋亡發(fā)生。聯(lián)合p53基因及順鉑治療nsclc比單用其中之一，具有更顯著的腫瘤抑制作用。作者所在的研究中心開展了抑癌基因多方面的研究，采用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)p16、p53和p21基因單獨或共轉(zhuǎn)染到nsclc和sclc細(xì)胞系，結(jié)果表明p16、p53、p21可抑制nsclc細(xì)胞增殖，p16與p21基因或p16和p53基因聯(lián)合應(yīng)用能顯著增強(qiáng)對nsclc及sclc細(xì)胞增殖的抑制，以p16與p53作用更明顯。而且研究也證實p53基因可增強(qiáng)nsclc細(xì)胞化療敏感性。研究成果

18、表明p53與p16基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染或p53基因聯(lián)合化療，可能成為肺癌基因替代治療的更佳選擇。 目前肺癌的抑癌基因治療的臨床試驗已取得初步進(jìn)展。最近roth等報道用p53基因聯(lián)合反義k-ras治療1例肺癌患者取得顯著療效。此臨床試驗源于1993 年anderson癌癥研究中心的roth15向美國重組dna委員會( rac)和美國國立衛(wèi)生研究院（nih）提出的利用抑癌基因p53和反義k-ras對nsclc進(jìn)行腫瘤治療的臨床方案，此方案為利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體lnsx構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入p53基因突變的nsclc細(xì)胞，臨床上選用內(nèi)窺鏡或激光將大塊肺癌腫塊切除，在剩余微小腫瘤灶內(nèi)注入逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液。臨床前

19、的動物實驗結(jié)果表明，將野生型p53基因?qū)雙53基因突變的肺癌細(xì)胞可以逆轉(zhuǎn)腫瘤的表型，可觀察到裸鼠體內(nèi)的肺癌腫塊的范圍明顯縮小，同時通過動物實驗也證實了該方案的安全性，roth 等給小鼠注射350倍于擬用于人體的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)毒性。roth等16最近對21例晚期nsclc患者進(jìn)行了p53基因替代療法的臨床試驗，利用腺病毒載體構(gòu)建p53表達(dá)質(zhì)粒，采用腫塊內(nèi)直接注入方法，每月為病人進(jìn)行1次p53基因替代療法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6名患者臨床表現(xiàn)有效，且腫瘤活檢有p53基因的明顯表達(dá)，并觀察到凋亡。martin等17對15例晚期nsclc患者進(jìn)行野生型p53基因治療的臨床試驗，結(jié)果提示野生型p53

20、基因?qū)τ谕砥趎sclc患者是安全，易行，有效的。 四、問題與展望 肺癌的抑癌基因治療還處于不斷的探索中，目前已由基礎(chǔ)研究發(fā)展到臨床試驗，然而要應(yīng)用于臨床，發(fā)展為一種肺癌的常規(guī)療法，還有一定距離。首先要解決肺癌的早期診斷問題，是否可將在肺癌早期就有的抑癌基因的改變?nèi)鏿53突變作為篩查指標(biāo)，早期發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肺癌，進(jìn)一步早期治療，通過抑癌基因?qū)耄黠@有效抑制腫瘤生長，甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤的表型。再則要看到肺癌聯(lián)合治療的可行性，因為肺癌的發(fā)生是多基因、多步驟的，因此可通過不同的?淦?所產(chǎn)生的合力，多方面共同對抗腫瘤，在肺癌的聯(lián)合治療方面有許多問題需要進(jìn)一步深入研究，如除p53與p16基因以外其它抑癌基因共轉(zhuǎn)染

21、的抗腫瘤性，抑癌基因與各種dna破壞藥物的組合，以及抑癌基因與其它基因治療方法的聯(lián)合等。另外還有很多技術(shù)問題需解決，選擇高效和導(dǎo)向的理想載體系統(tǒng)，使抑癌基因在受體細(xì)胞中獲得安全高效穩(wěn)定表達(dá)，在肺癌多基因疾病中找尋有效的目的基因，以及建立動物模型，治療的安全性，等等。但可以預(yù)言，不遠(yuǎn)將來，抑癌基因?qū)⒃诜伟┑幕蛑委熤邪l(fā)揮重要作用，與目前常規(guī)的放療、化療以及其它基因治療方法一起聯(lián)合治療肺癌，產(chǎn)生強(qiáng)有力的抗腫瘤效果。  參考文獻(xiàn) 1bai l, sun y, li s. relation of p53 alteration and myc family gene overexpressio

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