淺談抑癌基因在肺癌治療中的新進展

1、淺談抑癌基因在肺癌治療中的新進展    肺癌是當前最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率逐年升高。由于大多數(shù)肺癌患者臨床確診時已屬晚期，其中50%以上患者不能手術，而絕大部分非小細胞肺癌（nsclc）患者（占肺癌的75%80%，包括鱗癌、腺癌、大細胞癌等）對現(xiàn)行放療和化療又不夠敏感，因此肺癌的治療成為臨床治療一大難題。近來人們研究的熱點集中到肺癌的基因治療上，并取得了許多重要進展?，F(xiàn)主要對肺癌的基因治療方法之一?抑癌基因治療肺癌的研究新進展作一綜述。 一、抑癌基因及其與細胞周期關系 抑癌基因（tumor suppressor gene）指正常細胞內存在的

2、，能抑制細胞轉化和腫瘤發(fā)生的一類基因群，當它們受到各種因子的作用失活后，細胞的生長分化失控，增加了細胞惡性轉化的可能性。目前已分離克隆的抑癌基因有rb、p53、p16、p33ing1、nm23、timp、kai1、aph、mcc、apc、dcc、brca1等，最近被認為候選抑癌基因的有fhit、pten/mmac1/tep1等。 rb基因又名成視網(wǎng)膜細胞瘤基因, 是最早發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因, 定位于人染色體13q14上，編碼的一組dna結合蛋白與細胞分化的過程有關，具有抑制細胞轉化的能力。與人類腫瘤相關性最高的基因目前認為是p53基因，該基因定位于17p13.1, 編碼的核磷酸蛋白具有轉錄激活的

3、作用，正常的p53基因具有抑制腫瘤細胞生長的作用，且dna損傷后可觸發(fā)細胞凋亡，防止惡變。近幾年來發(fā)現(xiàn)的p16基因即多腫瘤抑制基因1(multiple tumor suppressor 1, mts1) ，定位于人類多種惡性腫瘤頻繁發(fā)生缺失的染色體區(qū)域9p21，p16表達產(chǎn)物的基本功能是作為細胞周期素依賴激酶4(cyclin dependent kinase 4,cdk4)抑制蛋白。 新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因p33ing1，定位于染色體11q33，需依賴于野生型p53，才能發(fā)揮細胞生長的抑制效應。而定位在人染色體5q21的抑癌基因mcc、apc在肺癌中經(jīng)常表現(xiàn)為純合性缺失，在小細胞肺癌（sclc)

4、細胞系中發(fā)現(xiàn)，抑癌基因aph、mcc、apc的表達低下，提示它們可能與sclc的形成有關。nm23、timp、kai1基因的作用是抑制腫瘤轉移。dcc（結直腸癌缺失基因）是在結腸癌中新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因。 brca1抑癌基因主要與家族性乳腺癌和卵巢癌的發(fā)生有關。fhit基因定位于人染色體3p14.2，與肺癌、乳腺癌、腸癌、胰腺癌等有關，染色體3p是乳腺癌、肺癌、卵巢癌等腫瘤的經(jīng)常缺失區(qū)，抑癌基因aph也位于3p區(qū)（3p21.3）。pten/mmac1/tep1基因定位于人染色體10q23，在肺癌發(fā)現(xiàn)有突變。 抑癌基因的抑癌功能主要是通過在細胞增殖周期對細胞分裂和生長進行負調控，防止細胞周期失控變成

5、無限制地增殖而實現(xiàn)的。 細胞周期中有兩個重要的調節(jié)點，即g1-s和g2-m調節(jié)點。細胞周期的運行主要依賴于細胞周期依賴性激酶（cdk），該酶只有與細胞周期素（cyclins）結合才有活性，可促進細胞周期中g1s和g2m的轉變。在細胞周期素中最有意義的是細胞周期蛋白d（cyclin d），它能激活cdk2、4、5，促進細胞由g1期進入s期，進行dna合成。 目前認為p53、p16、rb基因與g1-s調節(jié)點有關。p53基因的表達產(chǎn)物p53蛋白的作用機制主要是間接作用于細胞周期，p53可促進p21蛋白（cdk2的抑制劑）的表達，從而在細胞周期中抑制g1期至s期的轉換，阻礙細胞進入dna合成期，使細胞

6、分裂和生長受到抑制。而p16具有直接的細胞生長抑制效應，p16與細胞周期蛋白d競爭同cdk4的結合，當p16與cdk4結合后，cdk4/cyclin復合物活性受到抑制，細胞分裂生長受阻。cdk/cyclin復合物對rb蛋白具有磷酸化作用，rb被磷酸化后其g1期停滯作用喪失，而rb非磷酸化時可阻止細胞由g1期進入s期。 p53基因較為特殊，與g2-m調節(jié)點又有一定關系，是參與細胞凋亡的重要基因。野生型p53基因使細胞在離子輻射、藥物刺激引起dna損傷后停留在g1期進行修復，若dna修復失敗，細胞 就進入凋亡。若p53基因發(fā)生突變，則細胞對dna損傷因素引起的細胞凋亡耐受性增加，因此突變型p53基

7、因可影響放療、化療的療效。細胞凋亡與cdk2基因編碼p34cdk2激酶（即m期促進因子）的活化有關，p34cdk2具有g1s和g2m雙重作用，p34cdk2激酶過早激活，可引起dna裂解和細胞核破壞，導致細胞凋亡。 一般認為癌變的重要原因是細胞周期的失控。當rb基因缺失、突變或磷酸化失活后，則促進細胞進入s期，當p53、p16基因突變或缺失時，則可間接或直接造成具有促增殖活性的cdk的過度表達，產(chǎn)生細胞增殖失控導致癌變。 二、抑癌基因與肺癌的發(fā)生和發(fā)展 近年來隨著分子生物學研究的進展，在分子水平認識到肺癌的形成是一個多步驟的過程，有多種基因功能失常，包括原癌基因的激活與抑癌基因的滅活等，才導致

8、惡性腫瘤細胞增殖到腫瘤形成。與肺癌有關的原癌基因包括 myc、 ras 、erbb-1、 c-erbb-2、 bcl-2 、 c-fos 、c-jun、c-raf-1、c-src、 lck基因等，約30%的nsclc細胞系中有ras基因突變，幾乎所有的nsclc（95%的鱗癌，75%的腺癌）中可見到c-erbb-1蛋白的過度表達，c-erbb-2 在25%的nsclc細胞系中有過度表達，bcl-2基因在凋亡中起負調控作用，在nsclc中可有表達。與肺癌有關的抑癌基因有p53、rb、 p16 、aph、 mcc、apc、nm23 、kai1 等。bai等1通過對臨床肺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌的發(fā)

9、展中，可同時有抑癌基因p53突變和癌基因 myc過度表達，而p53基因不是預后標記，決定預后的因素是myc過度表達。 rb基因的缺失最初是在家族性成視網(wǎng)膜細胞瘤研究中發(fā)現(xiàn)的，后來在許多腫瘤細胞中都可觀察到rb基因的缺失或失活，如小細胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、骨肉瘤等，在肺癌組織和細胞系中rb基因異常多表現(xiàn)為雜合子丟失、基因突變等。michael等2研究發(fā)現(xiàn)88%的sclc和12%的nsclc細胞系中存在rb基因產(chǎn)物表達的缺失。 p53基因突變在人類許多常見腫瘤中均可檢測到，包括肝癌、胃癌、大腸癌、食道癌、子宮癌，肺癌等，p53基因突變是不同類型肺癌中最常見的基因改變，且出現(xiàn)的頻率比其它

10、腫瘤要高得多。takahashi等3發(fā)現(xiàn)sclc中p53基因突變率最高，可達80%，nsclc中p53基因突變率也可達60%。 p16基因的正常功能丟失的主要方式是p16基因的純合性缺失，在人類眾多惡性腫瘤中相當普遍存在p16基因的純合性缺失，包括惡性間皮瘤、神經(jīng)膠質瘤、黑色素瘤、星形細胞瘤、白血病、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、骨肉瘤、食管癌、胰腺癌等。michael等2發(fā)現(xiàn)23% nsclc 細胞株可檢測到p16基因的純合性缺失，而只有1% 的sclc細胞株存在p16基因缺失。 washimi等4對原發(fā)性肺癌的檢測發(fā)現(xiàn)30%的nsclc有p16的純合性缺失，而sclc中未發(fā)現(xiàn)。許多研究結果2,4-

11、6 均表明，p16基因的失活在nsclc形成中起重要作用，與sclc的形成關系不大，在sclc的細胞株及原發(fā)腫瘤中很少檢測到p16基因的改變，而在nsclc的細胞株及原發(fā)腫瘤中常見p16基因純合性缺失。kratzke等7還發(fā)現(xiàn)p16純合性缺失的檢出率在nsclc晚期比早、中期高得多，這就使p16基因具有一定的nsclc臨床預后判斷的意義。 候選抑癌基因fhit在nsclc及sclc中經(jīng)常出現(xiàn)缺失，fhit在肺癌中的缺失一般提示預后差。而候選抑癌基因pten/mmac1/tep1的突變在肺癌的發(fā)生中目前認為只與sclc有關，與nsclc關系不大。 三、抑癌基因與肺癌基因治療研究 肺癌的基因治療是

12、指經(jīng)某種途徑引入外源基因到肺癌細胞以糾正或補償基因的缺陷，從而達到治療目的。肺癌的基因治療包括抑癌基因治療、反義基因治療、藥物敏感基因治療、耐藥基因治療、免疫基因治療等。 肺癌的發(fā)生源于多基因損傷，抑癌基因的缺失或突變是導致肺癌發(fā)生的原因之一。許多研究者都在探索肺癌的抑癌基因治療，即將外源正常的抑癌基因如rb基因、p53基因、p16基因等導入肺癌細胞，以恢復抑癌基因抑制細胞增殖的功能，從而抑制肺癌細胞的惡性增長，達到肺癌的治療作用。目前研究最多的是抑癌基因p53。takahashi等3發(fā)現(xiàn)，恢復單個抑癌基因的功能，可明顯有效抑制多基因改變引起的肺癌的發(fā)生和生長，該研究中利用野生型p53基因轉染

13、同時有p53突變或純合子缺失、癌基因 ras 突變、c-myc 過度表達的不同肺癌細胞系，結果均有生長抑制作用，而對于本身具有野生型p53基因的肺癌細胞，導入外源野生型p53基因后，產(chǎn)生的生長抑制作用則不明顯。fujiwara等8以逆轉錄病毒為載體將野生型p53基因轉染人nsclc細胞h226br，轉染后的細胞在體外生長明顯受到抑制。在裸鼠體內移植人肺癌細胞也發(fā)現(xiàn)p53基因對肺癌有明顯抑制作用。fujiwara等8在裸鼠氣管內接種p53突變的人肺癌細胞系h226br的細胞懸液，3天后用攜帶野生型p53基因的逆轉錄病毒進行治療，采用氣管滴入法，每日1次，連續(xù)3天，30天后觀察到治療組只有0%38

14、%的裸鼠肺內形成了腫瘤，而對照組中62%82% 的裸鼠發(fā)生了腫瘤，且治療組中裸鼠發(fā)生的腫瘤的體積亦明顯小于對照組。高振強等9在裸鼠成瘤試驗中發(fā)現(xiàn)導入野生型p53基因的人肺腺癌細胞系，成瘤晚，生長速度明顯減慢，其速度明顯低于對照細胞系和導入突變型p53基因的細胞系，結果證明p53基因有抑癌功能。zou等10在動物體內發(fā)現(xiàn)，氣管內腫塊局部注入脂質體和野生型p53基因復合物，可顯著抑制早期癌腫生長。在外源性野生型p53基因對人肺癌細胞生長的抑制作用的進一步研究中，汪蕙等11采用基因槍介導外源野生型p53基因，建立人肺巨細胞癌系801-d的轉染細胞系801-d- p53，結果表明，轉染細胞系801-d

15、-p53體外長期傳代有外源p53基因存在，轉染細胞生長明顯受到抑制，裸鼠異種移植致瘤性降低，腫瘤生長明顯緩慢。這是國內首次成功地運用基因槍轉移外源p53基因到人肺癌細胞。 大量的細胞、動物體內的研究表明，單獨運用病毒或非病毒為載體的野生型p53基因已經(jīng)具有明顯的抑制肺癌的效果。 盡管p16基因研究起步比p53基因晚，還有許多問題待解決，但由于p16基因的純合性缺失在許多惡性腫瘤中存在，且p16基因小，蛋白質相對分子質量僅為p53的1/4，便于重組和導入，因此理論上認為p16基因用于腫瘤的基因治療更為可行。jin 等12將野生型p16基因通過腺病毒載體導入p16基因缺失的肺癌細胞中，發(fā)現(xiàn)肺癌細胞

16、被阻滯在g1期，無法進入s期，導致肺癌細胞體內、體外生長受到抑制。研究結果為p16抑癌基因為肺癌基因治療提供了有力依據(jù)。 由于野生型p53基因在化療或放療引起的dna損傷而導致的細胞凋亡中是必需成分，因此化療或放療與p53基因聯(lián)合可具有更強的抗腫瘤性。fujiwara等13 研究發(fā)現(xiàn)腺病毒為載體的野生型p53基因可使人類nsclc細胞系h358對化療藥物順鉑（cddp）的敏感性在體外、裸鼠體內有所增強，而且p53基因與化療藥物順鉑聯(lián)合應用，可出現(xiàn)肺癌腫塊局部大片凋亡。roth等14 1996年提出利用腺病毒載體構建野生型p53表達質粒，聯(lián)合化療藥物順鉑治療nsclc的臨床方案，在臨床前的細胞及

17、動物研究中發(fā)現(xiàn)p53基因可增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，并引起腫塊局部的大片凋亡，單獨使用p53基因或順鉑治療nsclc，未觀察到明顯的凋亡發(fā)生。聯(lián)合p53基因及順鉑治療nsclc比單用其中之一，具有更顯著的腫瘤抑制作用。作者所在的研究中心開展了抑癌基因多方面的研究，采用陽離子脂質體介導p16、p53和p21基因單獨或共轉染到nsclc和sclc細胞系，結果表明p16、p53、p21可抑制nsclc細胞增殖，p16與p21基因或p16和p53基因聯(lián)合應用能顯著增強對nsclc及sclc細胞增殖的抑制，以p16與p53作用更明顯。而且研究也證實p53基因可增強nsclc細胞化療敏感性。研究成果

18、表明p53與p16基因聯(lián)合轉染或p53基因聯(lián)合化療，可能成為肺癌基因替代治療的更佳選擇。 目前肺癌的抑癌基因治療的臨床試驗已取得初步進展。最近roth等報道用p53基因聯(lián)合反義k-ras治療1例肺癌患者取得顯著療效。此臨床試驗源于1993 年anderson癌癥研究中心的roth15向美國重組dna委員會( rac)和美國國立衛(wèi)生研究院（nih）提出的利用抑癌基因p53和反義k-ras對nsclc進行腫瘤治療的臨床方案，此方案為利用逆轉錄病毒載體lnsx構建重組表達質粒，導入p53基因突變的nsclc細胞，臨床上選用內窺鏡或激光將大塊肺癌腫塊切除，在剩余微小腫瘤灶內注入逆轉錄病毒上清液。臨床前

19、的動物實驗結果表明，將野生型p53基因導入p53基因突變的肺癌細胞可以逆轉腫瘤的表型，可觀察到裸鼠體內的肺癌腫塊的范圍明顯縮小，同時通過動物實驗也證實了該方案的安全性，roth 等給小鼠注射350倍于擬用于人體的逆轉錄病毒上清液，結果未發(fā)現(xiàn)毒性。roth等16最近對21例晚期nsclc患者進行了p53基因替代療法的臨床試驗，利用腺病毒載體構建p53表達質粒，采用腫塊內直接注入方法，每月為病人進行1次p53基因替代療法，結果發(fā)現(xiàn)6名患者臨床表現(xiàn)有效，且腫瘤活檢有p53基因的明顯表達，并觀察到凋亡。martin等17對15例晚期nsclc患者進行野生型p53基因治療的臨床試驗，結果提示野生型p53

20、基因對于晚期nsclc患者是安全，易行，有效的。 四、問題與展望 肺癌的抑癌基因治療還處于不斷的探索中，目前已由基礎研究發(fā)展到臨床試驗，然而要應用于臨床，發(fā)展為一種肺癌的常規(guī)療法，還有一定距離。首先要解決肺癌的早期診斷問題，是否可將在肺癌早期就有的抑癌基因的改變如p53突變作為篩查指標，早期發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肺癌，進一步早期治療，通過抑癌基因導入，明顯有效抑制腫瘤生長，甚至逆轉腫瘤的表型。再則要看到肺癌聯(lián)合治療的可行性，因為肺癌的發(fā)生是多基因、多步驟的，因此可通過不同的?淦?所產(chǎn)生的合力，多方面共同對抗腫瘤，在肺癌的聯(lián)合治療方面有許多問題需要進一步深入研究，如除p53與p16基因以外其它抑癌基因共轉染

21、的抗腫瘤性，抑癌基因與各種dna破壞藥物的組合，以及抑癌基因與其它基因治療方法的聯(lián)合等。另外還有很多技術問題需解決，選擇高效和導向的理想載體系統(tǒng)，使抑癌基因在受體細胞中獲得安全高效穩(wěn)定表達，在肺癌多基因疾病中找尋有效的目的基因，以及建立動物模型，治療的安全性，等等。但可以預言，不遠將來，抑癌基因將在肺癌的基因治療中發(fā)揮重要作用，與目前常規(guī)的放療、化療以及其它基因治療方法一起聯(lián)合治療肺癌，產(chǎn)生強有力的抗腫瘤效果。  參考文獻 1bai l, sun y, li s. relation of p53 alteration and myc family gene overexpressio

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