急性白血病患者白血病細胞DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ活性與多藥耐藥的研究

1、急性白血病患者白血病細胞DNA拓撲異構(gòu)酶活性與多藥耐藥的研究摘要目的：探討急性白血病患者白血病細胞DNA拓撲異構(gòu)酶(DNA Topo)活性與多藥耐藥的關(guān)系。方法：采用溴乙錠熒光法對17例初治化療前及20例化療后的急性白血病患者外周血或骨髓白血病細胞DNA Topo活性進行測定，采用抗多藥耐藥單抗JSB-檢測18例化療后患者p-糖蛋白表達，采用RT-PCR法檢測mdr-1基因表達。結(jié)果：白血病患者化療前組Topo活性(0.64150.0561)較健康對照組(0.23040.0591)顯著增高(P0.005)。化療后患者白血病細胞Topo活性(0.35630.1011)較化療前組顯著降低(P0.0

2、5)。15例臨床療效差，其中12例p170及mdr-1基因表達陽性、3例表達陰性，而Topo活性均降低。結(jié)論：Topo活性下降可能是患者對抗腫瘤藥表現(xiàn)耐藥的另一重要原因。關(guān)鍵詞白血病，急性拓撲異構(gòu)酶抗藥性，多藥 Study on the relationship between DNA topoisomerase activity and multidrug resistance in leukemic cellsZheng Wenli, Xie Zhaoxia, Tang Guocheng, et al. Department of Hematology, Xiangya Hospital,

3、 Hunan Medical University, Changsha410008AbstractObjective:To explore the relationship between DNA topoisomerase (Topo ) activity and multidrug resistance in acute leukemia(AL). Methods: Topo activities were measured in peripheral blood or bone marrow leukemia cells from 17 pretreated patients and 2

4、0 after combination chemotherapy by fluorometric assay. In the same time, multidrug resistant p-glycoprotein expression was detected by immunohistochemistry using JSB-1 monoclonal antibody and mdr-1 gene expression was assayed by RT-PCR in 18 post-chemotherapy patients. Results: Topo activities were

5、 significantly higher in pretreated AL patients (0.64150.0561) than in healthy blood donors (0.23040.0591)(P0.005) and significantly lower in post-chemotherapy patients (0.35630.1011) than in pretreated ones (P0.005). Among 15 poorly responsed patients, 12 were p170 positive and mdr-1 overexpression

6、, 3 case were p170 negative. Topo activity was also decreased in these poor responsers. Conclusion: Decreased Topo activity may be another factor in multidrug resistance.Key wordsLeukemia,acuteTopoisomerase Resistance,multidrug多藥耐藥(MDR)機制是腫瘤化療的研究重點，其中較重要并研究得較深入的是mdr-1基因編碼的p-糖蛋白過度表達及其逆轉(zhuǎn)途徑1，然而耐藥產(chǎn)生是多因素

7、和復(fù)雜的，近幾年來越來越多的資料表明DNA拓撲異構(gòu)酶(Topo )的變化也是多藥耐藥的因素之一2。我們檢測了急性白血病患者白血病細胞DNA Topo活性，mdr-1基因表達p170水平，研究其與化療耐藥關(guān)系，旨在探討多藥耐藥機制，為治療耐藥白血病尋找新的線索。材料和方法1研究對象急性白血病為本院門診及住院患者34例，經(jīng)臨床及骨髓細胞形態(tài)與細胞化學(xué)染色確診。男22例，女12例，年齡1663歲，中位數(shù)35歲，其中急性非淋巴細胞白血病(ANLL) 20例、急性淋巴細胞白血病(ALL) 14例。正常對照組22名，男性14名，女性8名，年齡1643歲，中位數(shù)34歲，為本院獻血員。2試劑JSB-單抗為美國

8、Signet Labortories產(chǎn)品；生物素-親和素過氧化物酶復(fù)合物(ABC)試劑為美國Vector Labortories產(chǎn)品；mdr-1 RT-PCR試劑盒由北京京海生物工程公司提供；甲基磺酰氟(PMSF)，二硫蘇糖醇(DTT)為華美生物工程公司產(chǎn)品。3方法3.1標本采集：取患者外周血810ml或骨髓34ml，健康人外周血6ml，肝素50U/ml抗凝，Hanks液稀釋后，加入淋巴細胞分離液，離心，吸取單個核細胞層，1%冰醋酸溶解殘余紅細胞30秒，4 PBS洗滌3次，顯微鏡下計數(shù)，調(diào)整細胞至(25)106/ml。3.2Topo 活性檢測3：采用低濃度溴乙錠熒光測定法，取上述部分懸液離心5

9、00r/min，10分鐘，將離心沉淀細胞重新懸浮于細胞核緩沖液(A)中，調(diào)整細胞數(shù)21010/L，0放置15分鐘，反復(fù)吹打混勻，再在裂解液中加入等量細胞核緩沖液(B)，輕輕混勻，置4提取。2小時后，于4 12000r/min離心20分鐘，然后取上清液50l作微蛋白定量，并制作蛋白濃度標準曲線。酶反應(yīng)管加入等量蛋白酶提取液，未反應(yīng)管加相應(yīng)體積緩沖液后于37反應(yīng)30分鐘，-20迅速冷卻終止反應(yīng)。反應(yīng)混合液被稀釋入2.0ml熒光檢測液，設(shè)空白熒光檢測液對照管。采用熒光分光光度計檢測。計算酶活性，以反應(yīng)后熒光減弱的比率表示。3.3p-糖蛋白檢測4：用抗p-糖蛋白單抗JSB-1，以生物素-親和素過氧化物

10、酶復(fù)合物(ABC)法檢測，計數(shù)200個細胞，以陽性細胞大于10%作為陽性。3.4mdr-1檢測：采用RT-PCR試劑盒法進行檢測。總RNA提取：5106結(jié)果1急性白血病患者初治化療前白血病細胞Topo活性17例患者初診化療前Topo 活性顯著高于正常對照組(P0.005)(表1)。2急性白血病患者化療后白血病細胞DNA Topo活性20例患者中復(fù)治17例，初治3例，均接受3個療程以上化療(HOAP、VDP、COMP、Vp16或ACR、THP及表阿霉素等)。化療后組Topo 活性較化療前組明顯增高(P0.005)，化療后組較正常對照組Topo 活性明顯增高(P0.05 討論化療是目前治療急性白血

11、病的主要手段，而耐藥是治療失敗的重要原因，國內(nèi)外學(xué)者研究已表明p170高表達是MDR的主要機制，同時也發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，谷胱甘肽及谷胱甘肽過氧化物酶等細胞內(nèi)解毒酶活性增加，使藥物損害減低，也是MDR形成的重要原因之一。Topo 是調(diào)控DNA拓撲構(gòu)象的酶，參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組等許多重要活動。Tadao等5報道，在肺癌與正常組織發(fā)現(xiàn)肺癌組織中Topo 活性較周圍正常肺組織增高，這可能反映了腫瘤細胞的增殖特性。本研究結(jié)果也說明了治療前患者Topo 活性明顯增高，與原始及幼稚細胞升高及增殖細胞增多密切相關(guān)。本組患者化療后18例檢測p170/mdr-1基因表達，其中12例表達陽性，均為難治

12、與復(fù)發(fā)患者，6例表達陰性者中，3例呈完全緩解，p170/mdr-1檢測結(jié)果與臨床的符合率為83.3%。這說明p170/mdr-1基因高表達是MDR重要的耐藥機制，但本組資料中3例臨床療效差患者，無p170/mdr-1基因表達，提示有p170/mdr-1以外的因素在耐藥中起作用。Diffie等6報道阿霉素耐藥的P388白血病細胞內(nèi)，Topo 含量較敏感細胞降低76%。Ellen等7報道艾氏腹水(Ehrlich Acites)腫瘤細胞對柔紅霉素耐藥，發(fā)現(xiàn)MDR耐藥表型存在p170高表達，并且從耐藥細胞核中提取的Topo 活性比敏感細胞下降50%。說明Topo 活性與耐藥有關(guān)，同時與p170高表達有

13、關(guān)，所以腫瘤細胞的耐藥性在一定程度上與Topo 含量的下降有關(guān)。本組資料顯示：急性白血病患者化療后白血病細胞Topo 活性較化療前明顯降低，其中化療后12例p170/mdr-1表達陽性者，均為難治與復(fù)發(fā)患者，而p170/mdr-1表達陰性者3例，臨床療效差而Topo 活性均減低。兩組之間無明顯差異。以上結(jié)果表明p170/mdr-1基因高表達是白血病多藥耐藥的重要機制，而白血病細胞Topo 活性減低，也與多藥耐藥有一定的關(guān)系，也可能與p170/mdr-1機制共同起作用。參 考 文 獻1Chen CJ, Clark D, Ueda K, et al. Genomic organization of

14、 the human multidrug resistance (mdr1) gene and origin of P-glycoproteins. J Biol Chem, 1990, 265:506-514.2Paolo DL, Gapranico G, Binaschi M,et al. Evidence of DNA topoisomerase -dependent mechanisms of multidrug resistance in P388 leukemia cells. Mol Pharmacol, 1990, 37:11-16.3Andrea JE, Adachi K,

15、Morgan AR. Fluorometric assays for DNA topoisomerases and topoisomerasetargeted drug: quantitation of catalytic activity and DNA celeavage. Mol Pharmacol, 1991, 40:495-501.4謝兆霞. 抗MDR抗體檢測白血病細胞P-糖蛋白. 湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1992， 17：63-64.5Tadao H, Lsobe KI, Nakashima I, et al. Higher expression of topoisomerase in lung cancers than normal lung tissues: different expression pattern from topoisomerase I. Biochem Biophys Res Commun, 1993, 195:409-414.6Diffie AM, Bosman DJ, Goldenberg GJ. Evidence for a mutant allele of the gene for DN