羊痘的診斷與疫苗研究進(jìn)展.docx

1、羊痘的診斷與疫苗研究進(jìn)展李楊'，顏新敏I,吳國華I,李健I,葉奕優(yōu)2,趙志荀'朱海霞I,張志東二張強(qiáng)'(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730046；2.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳518045)中圖分類號(hào)：S852.65*4文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號(hào):0529-6005(2017)06-0086-03羊痘病毒粒子大小約為150Kbp,分子量約為73-91MDao該病毒能引起羊的急性、熱性、接觸性傳染病，因其病毒結(jié)構(gòu)及其發(fā)病癥狀和人類的天收稿日期：2016-07-19基金項(xiàng)目：國家垂點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題(2016Y

2、FD0500907)；甘肅省國際科技合作專項(xiàng)(16O4WKCA012)；甘肅省國際科技合作專項(xiàng)(15O4WKCAO55)作者簡(jiǎn)介:李楊(1990-),男，碩士生，研究方向?yàn)榉肿用庖吲c環(huán)境控制，E-mail；843290952通訊作者:顏新敏,E-mail：qzhangl616；張強(qiáng),E-mail:qzhang616花很像，又稱“羊天花”。根據(jù)分離的毒株不同，羊群的發(fā)病率為75%-100%,死亡率在10%58%°目前沒有特效治療藥，只有通過實(shí)驗(yàn)室診斷和免疫預(yù)防來減少疾病的發(fā)生。1血清學(xué)診斷瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGPT)：早在1963年Bhalnbani和krish就應(yīng)用同源或異源血清通過

3、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)對(duì)羊痘病進(jìn)行診斷，但是存在羊痘和傳染性膿皰性皮炎(CPD)的抗原交叉反應(yīng)。1986年對(duì)常規(guī)的AGPT做了改進(jìn)，采用S35蛋氨酸標(biāo)記抗已初見成效但是仍然有一些問題存在，比如中藥組方各味中藥在抵抗真菌毒素的時(shí)候可能會(huì)出現(xiàn)拮抗作用使得效果不好，決定組方就必須嚴(yán)格檢查其中的成分。另外中藥儲(chǔ)存中真菌毒素的殘留也是不可忽視的問題，由于藥用植物除了藥用成分以外還有其他營養(yǎng)物質(zhì)，因此在加工、運(yùn)輸、貯藏中如不注意就會(huì)引起真菌毒素的感染。有文獻(xiàn)*5】就對(duì)多種中藥進(jìn)行了檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不管是國內(nèi)還是國外藥用草藥均含有AF、赫曲霉毒素、展青霉素、伏馬菌素、玉米赤霉烯酮等。因此在治療真菌毒素是若用含有真菌毒素的中

4、藥不但不能緩解病情,輕者耽誤時(shí)間重者造成死亡。所以能開發(fā)出高效、簡(jiǎn)便、快捷又不影響藥性的檢測(cè)真菌毒素的方法就顯得尤為重要了。參考文獻(xiàn)：1MorgaviDP,RileyRT.AnhistoricaloverviewoffielddiseaseoutbreaksknownorsuspectedtobecausedbyconsumptionoffeedscontaminatedwithFusariumtoxinsJ.AnimalFeedSci.Technol,2007,137：201-212.2 何曉芳.中草藥制劑在奄菌毒素控制中的研究進(jìn)展J.國外畜牧學(xué),2012,32(5):30-32.3 孫紅祥

5、.一些中藥及其揮發(fā)性成分抗精菌活性研究J.中國中藥雜志,2001,26(2):99-102柴夢(mèng)穎、焦鐳.15種中草苛提取液抑真曲活性的研究J.農(nóng)產(chǎn)品加工,2012,5:61-64.4 紀(jì)麗蓮，張強(qiáng)華.八種菊科中草藥抗毒菌及飼料霉變的研究J.生命科學(xué)研究.2003,7(4)：350-354.6石達(dá)友，廖申權(quán).郭劍英.等.硒與中藥對(duì)黃曲每毒素B1所致錐鴨生長(zhǎng)性能下降的影響J.中國家禽.2010,32(10)：16-18.7 桂同旺.中草藥防治雞黃曲霉素中毒初探J.中料醫(yī)學(xué)雜志，2001,2：30.8 郭劍英，郭銘生,潘家強(qiáng)，等.黃曲穩(wěn)毒素BI、復(fù)方中藥和硒對(duì)肉雞肝組織勻漿中自由基代謝的影響J.中國

6、家食,2012,34(7)：19-22.9 李楊，高祝，榮茜，等.“夏方柴苓顆?！狈乐硒嘃S曲霉毒素B1慢性中毒的作用機(jī)理J.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015,27(8):1337-】344.10李物，高祝，榮茜，等.復(fù)方柴苓顆粒對(duì)鴨黃曲霉毒素慢性中毒CYP450酶活性的影響J.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2016,28(1):33-37.11李英倫，葉剛，賀常亮.復(fù)方柴苓顆粒對(duì)實(shí)驗(yàn)性櫻桃谷鴨黃曲霉毒素中毒導(dǎo)致的肝損傷和氧化損傷的動(dòng)態(tài)觀C.中國“活獸慈舟”學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集，四川：2013：152-158,【12靳如文.中藥顆粒劑保肝護(hù)腎脫獐素的研制D.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.13 孫美涵.金葛解毒散對(duì)奶牛乳汁中黃

7、曲每毒素Ml殘留的影響DJ.黑龍江:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué),2016.14 MManafi.HKhosravinia.EffectsofAflatoxinonthePerformanceofBroilerBreedersandItsAlleviationthroughHerbalMycotoxinBinderJ.JAgrSciTech,2013,15：55-63.15 SwathiA.JagadeeshS.ShridharNBal.EffectofHerbalMycotoxinBindersinAmeliorationofInducedMycotoxicosisinWhitelieghomLayi

8、ngHensJ.STARJournalSciTechnolArtsResJ,2014,3(3)：63-69.16 黃莉，張浩，丁偉琴，等.中藥中寅麻隹素污染問題J.海峽藥學(xué),2009.21(6):95-99.17JAslamN,RodriguesI,McgillDM,e/al.TransferofaflatoxinsfromnaturallycontaminatedfeedtomilkofNii-RavibuffaloesfedamycotoxinbinderJ.AnimalProductionScience,2015.56.原，提高了檢測(cè)的靈敏度。對(duì)流免疫電泳（CIEP）:1985年建立了對(duì)

9、流免疫電泳快速診斷綿羊痘的方法,CIEP在檢測(cè)感染組織和細(xì)胞中的特異性抗原比AGPT敏感和快速。1999年Rao等設(shè)計(jì)電泳時(shí)用巴比妥緩沖液代替普通的鹽溶液極大地提高了CIEP的敏感性。熒光抗體技術(shù)（FAT）:1986年Soman等通過FAT對(duì)感染羊腎細(xì)胞和睪丸細(xì)胞的羊痘病毒抗原進(jìn)行檢測(cè)。此方法快速簡(jiǎn)單，在抗原感染14-24h之間就能被檢測(cè)到。也能夠檢測(cè)到感染動(dòng)物水皰瘡液、皮膚、LK和LT細(xì)胞中的羊痘病毒抗原。血凝試驗(yàn)（HemagglutinationTest,HT）：羊痘病毒因?qū)?dòng)物紅細(xì)胞不產(chǎn)生凝集作用，用致敏的綿羊紅細(xì)胞來進(jìn)行血凝試驗(yàn)。1989年,Joshi等通過將羊痘抗體連接到葡萄球菌A蛋

10、白（SPA）上,成功的建立了檢測(cè)羊痘的協(xié)同凝集試驗(yàn)。2005年,王開功等采用兔抗山羊痘病毒IgG致敏綿羊紅細(xì)胞建立的反向間接血凝試驗(yàn)，對(duì)山羊痘病毒抗原具有特異性和敏感性，對(duì)疫區(qū)采集的山羊痘待檢抗原的檢測(cè)結(jié)果表明，反向間接血凝法的敏感性比瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)高。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）:ELISA是抗原抗體反應(yīng)與酶促反應(yīng)相結(jié)合的一種技術(shù)，因其快速、便利、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)被應(yīng)用于羊痘病的診斷。1988年,Sharma等首次將ELISA用于山羊痘病毒的檢測(cè)，通過用活的和滅活的抗原與高免血清檢測(cè)山羊痘的血清與抗體，但是實(shí)驗(yàn)背景高，且假陽性結(jié)果較高。隨后應(yīng)用皮膚活檢建立了免疫捕獲ELISA,該方法特異性

11、能達(dá)到80%-100%，敏感性能達(dá)到70%-86%o1998年,建立了檢測(cè)山羊痘病毒的dot-EUSA檢測(cè)方法，通過dot-ELISA和CIEP兩種方法對(duì)西孟加拉的38個(gè)疑似羊痘病毒感染的樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示dot-ELISA方法能檢出28份陽性，檢出率為68.4%,而CIEP能檢出21份陽性,檢出率為55.3%。用已知的陽性樣品作對(duì)照，dot-EUSA顯示100%的相關(guān)性,CIEP只有80%odot-ELISA有較高的敏感性和特異性,并能用于野外診斷。2008年吳國華等建立了羊痘病毒雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，用該方法檢測(cè)羊傳染性膿皰病毒和口蹄疫病毒，顯示無交叉反應(yīng)，具有較高的特異性,與

12、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)對(duì)比，其敏感性高48倍，可用于對(duì)山羊痘病毒和綿羊痘病毒的檢測(cè)。2分子生物學(xué)診斷基于臨床癥狀和血清學(xué)的診斷并不總是可靠的，所以為了克服這些限制，簡(jiǎn)單、快速、特異地PCR技術(shù)成為檢測(cè)羊痘病毒并區(qū)分LSDV的有效手段。根據(jù)羊痘病毒的衣殼蛋白P32基因序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物，分別建立了檢測(cè)羊痘的PCR方法，成功的從樣品中擴(kuò)增出目的條帶。Markoulatos針對(duì)SPPV的ITR和a微管蛋白基因設(shè)計(jì)2對(duì)引物，建立了用于檢測(cè)皮膚組織中SPPV的多重PCR技術(shù)，該方法敏感性和特異性較好,24h內(nèi)就可作出檢測(cè)，但偶爾會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。Hosamani根據(jù)山羊痘病毒和綿羊痘病毒P32基因序列的差異，建

13、立了區(qū)分GTPV和SPPV的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)（PCR-RFLP）。2010年，Lamien根據(jù)G蛋白偶聯(lián)趨化因子受體基因建立了q-PCR方法，該方法使用雙雜交探針,根據(jù)熒光溶解曲線,可以種屬鑒別及基因分型。2008年，韓若嬋等根據(jù)P32基因和末端反向重復(fù)序列基因片段設(shè)2對(duì)引物，建立多重PCR檢測(cè)方法，用此方法檢測(cè)口蹄疫病毒和羊口瘡病毒，結(jié)果均為陰性。2014年，趙志荀等的基于羊痘病毒的保守序列ITR設(shè)計(jì)三套引物，建立了區(qū)分綿羊痘和山羊痘的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP），并對(duì)48份綿羊痘感染樣品和87份山羊痘感染樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出率分別為100%和98.8%o3疫苗及

14、免疫3.1血清接種用發(fā)病并恢復(fù)健康的羊的血清或者抗羊痘病毒的血清接種羊，但是，其溫和的保護(hù)和血清免疫的失敗、致敏淋巴細(xì)胞，使之不能作為長(zhǎng)期有效的免疫方法。3.2弱毒疫苗1957年，我國袁慶志等等通過將綿羊痘病毒在綿羊與雞胚之間交替?zhèn)鞔?，使病毒毒力減弱,并保持了良好的免疫原性。目前我國使用最多的仍然是沈榮顯分離的山羊痘病毒太原株經(jīng)雞胚減毒后的弱毒疫苗,命名為AV41疫苗株，該疫苗免疫動(dòng)物后免疫持續(xù)期能到1年左右，既能抵抗山羊痘病毒感染又能抵抗綿羊痘病毒感染。印度研制的經(jīng)Vero細(xì)胞致弱的山羊痘病毒的活疫苗，接種102.5TCID為的劑量，能提供46月齡的山羊52個(gè)月的保護(hù)3）?？夏醽喚d羊山羊02

15、40株是在自然條件下，同一個(gè)屬的病毒出現(xiàn)重組并分離得到的,此疫苗株能夠很好保護(hù)綿羊和山羊，在非洲的一些國家用于綿羊和山羊的接種免疫。但是弱毒疫苗存在免疫動(dòng)物后毒力返強(qiáng)和散毒的風(fēng)險(xiǎn)，因此非常有必要研制出更加安全有效的疫苗。3.3多肽疫苗綿羊痘病毒的VP3蛋白被證明是免疫性蛋白，并且在兔體內(nèi)能引起高水平的體液免疫和細(xì)胞免疫F）。用弗氏不完全佐劑乳化的VP3蛋白免疫羊可誘導(dǎo)產(chǎn)生1：256滴度的血清抗體，對(duì)免疫VP3后接種病毒21d的羊提供67%的保護(hù)°羊痘病毒的另一種結(jié)構(gòu)蛋白-P32蛋白，是近些年的研究熱點(diǎn)，它有很好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，但是由于P32蛋白表達(dá)量低并且不穩(wěn)定，

16、這在一定程度上制約著此方法的應(yīng)用前景。因此，找到另一種免疫原性更好，表達(dá)量、穩(wěn)定性更好的基因勢(shì)在必行。3.4活載體疫苗隨著分子技術(shù)的發(fā)展，以羊痘病毒作為活載體的研究取得了一些進(jìn)展。羊痘病毒作為活載體有很多優(yōu)點(diǎn)，其基因組結(jié)構(gòu)明確，穩(wěn)定性強(qiáng),基因組容量大，可容納至少25Kb的外源基因而不失去感染力，有多個(gè)復(fù)制非必需區(qū)，對(duì)外源基因的插入耐受性強(qiáng)。羊痘病毒宿主范圍窄，只感染羊,對(duì)其他動(dòng)物安全性高，并且能引起強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫。Romero等【鳳構(gòu)建的牛瘟病毒H基因的重組山羊痘病毒，動(dòng)物試驗(yàn)顯示，體內(nèi)存在滴度較高的山羊痘病毒中和抗體和牛瘟病毒中和抗體。另外，Wade-Evans等構(gòu)建表達(dá)了藍(lán)舌病VP7基因的

17、重組羊痘病毒。Aspdcn等構(gòu)建表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白的重組羊痘病毒，作為復(fù)制缺陷型疫苗。Berhe等構(gòu)建表達(dá)小反芻獸疫病毒F基因的重組羊痘病毒都有很好的效果。4討論目前我國研究羊痘病毒的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)研發(fā)出多個(gè)可以用于羊痘病毒診斷的分子和血清學(xué)診斷方法，但是各種原因，目前國內(nèi)尚沒有商品化的診斷試劑盒問世，所以推動(dòng)羊痘病毒診斷的標(biāo)準(zhǔn)化勢(shì)在必行。隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，目前對(duì)羊痘病毒基因的理解也更加深入。羊痘病毒毒力基因、宿主范圍基因和宿主之間的關(guān)系等基礎(chǔ)研究的深入，為研發(fā)新的檢測(cè)方法和疫苗提供了依據(jù)。另外，羊痘病毒作為活病毒載體有著眾多優(yōu)點(diǎn)，研發(fā)羊痘病毒活載體為基礎(chǔ)的多價(jià)疫苗是今后一個(gè)重要的研究方

18、向。由于羊痘目前僅在亞洲和非洲發(fā)展中國家和落后國家大規(guī)模流行，歐洲早已消滅了羊痘病毒，因此發(fā)達(dá)國家對(duì)羊痘的研究較少。羊痘病毒的免疫和致病機(jī)制的研究幾乎是空白，因此，要加強(qiáng)和推動(dòng)羊痘病毒的基礎(chǔ)研究，為羊痘的診斷、疫苗的研發(fā)和疾病的控制奠定基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)：1BhambaniBD,KrishnamurthyD.AnimmunodiffusiontestforlaboratorydiagnosisofsheeppoxandgoatpoxJJCompPathol,1963,73:349-357.2RaoTVS,PoonamMalik,AsgolaD.Evaluationofavidin-biotinEL

19、ISAforthedetectionofantibodiestogoatpoxvirususingnonin-fectiousdiagnosticreagentJ.ActaVirologica,1999,43:297-301.3 SomanJP.AntigenicdetectionofsheeppoxvirusinthesheepkidneyandtestescellculturesbyimmunoflourescenttestJ.IndianVetJ,1986,63(10)：793-795.4 王開功，虞天德,何光志.等.應(yīng)用反向間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)山羊痘病毒抗原:J.山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào),2005

20、,24(1)：29-32.SharmaSN,NegiBS.YadavMP,efal.ApplicationofELISAinthedetectionofgoatpoxantigenandantibodiesJ.ActaVirologi-ca,1988,32:65-69.5 吳國華，張強(qiáng)，顏新敏，等.羊痘病毒雙抗體夾心EUSA檢測(cè)方法的建立J.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,30(5):860-864.6 韓若嬋，張強(qiáng)，吳國華，等.羊痘病毒多重PCR檢測(cè)方法的建立J.中國獸醫(yī)科學(xué),2008,38(3)：206-208.'8一ZhaoZ.FanB,WuG,etal.Developmentofl

21、oop-mediatedisothermalamplificationassayforspecificandrapiddetectionofdifferentialgoatPoxvirusandSheepPoxvirusJ.BmcMicrobiology,2014,14(1):1-10.9 袁慶志，李寶啟，沈榮顯.羊痘弱毒疫苗的研究一第一報(bào)羊痘病毒雞胚培養(yǎng)的研究J.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1957,2(1)：15-23.10 HosamaniM,NandiS,MondalB,etal.AVen>cell-attenuatedGoatpoxvirusprovidesprotectionagainst

22、virulentviruschallenge.J.ActaVirol函ca,2004.48(1)：1521.11 RaiA,SinghUS,PandeyKD,e*al.Characterizationofanimmunogenicviralproteinofsheeppoxvirus；J.IndianJVirol,1985,1(2):120-126.12 RaiA,GeelAC,PandeyKD,etal.ImmunogenicityofavirionpolypeptideofsheeppoxvirusinsheepfJ.IndianJVirol,1986,2(1):11-15.13,KomeroCH,BarrettT,KitchingRP,eral.Protectionofcattlea-gainstrinderpestandlumpyskindise