羊痘的診斷與疫苗研究進展.docx

1、羊痘的診斷與疫苗研究進展李楊'，顏新敏I,吳國華I,李健I,葉奕優(yōu)2,趙志荀'朱海霞I,張志東二張強'(1.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅蘭州730046；2.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心，廣東深圳518045)中圖分類號：S852.65*4文獻標志碼:A文章編號:0529-6005(2017)06-0086-03羊痘病毒粒子大小約為150Kbp,分子量約為73-91MDao該病毒能引起羊的急性、熱性、接觸性傳染病，因其病毒結構及其發(fā)病癥狀和人類的天收稿日期：2016-07-19基金項目：國家垂點研發(fā)計劃課題(2016Y

2、FD0500907)；甘肅省國際科技合作專項(16O4WKCA012)；甘肅省國際科技合作專項(15O4WKCAO55)作者簡介:李楊(1990-),男，碩士生，研究方向為分子免疫與環(huán)境控制，E-mail；843290952通訊作者:顏新敏,E-mail：qzhangl616；張強,E-mail:qzhang616花很像，又稱“羊天花”。根據(jù)分離的毒株不同，羊群的發(fā)病率為75%-100%,死亡率在10%58%°目前沒有特效治療藥，只有通過實驗室診斷和免疫預防來減少疾病的發(fā)生。1血清學診斷瓊脂免疫擴散試驗(AGPT)：早在1963年Bhalnbani和krish就應用同源或異源血清通過

3、瓊脂擴散試驗對羊痘病進行診斷，但是存在羊痘和傳染性膿皰性皮炎(CPD)的抗原交叉反應。1986年對常規(guī)的AGPT做了改進，采用S35蛋氨酸標記抗已初見成效但是仍然有一些問題存在，比如中藥組方各味中藥在抵抗真菌毒素的時候可能會出現(xiàn)拮抗作用使得效果不好，決定組方就必須嚴格檢查其中的成分。另外中藥儲存中真菌毒素的殘留也是不可忽視的問題，由于藥用植物除了藥用成分以外還有其他營養(yǎng)物質，因此在加工、運輸、貯藏中如不注意就會引起真菌毒素的感染。有文獻*5】就對多種中藥進行了檢測發(fā)現(xiàn)，不管是國內還是國外藥用草藥均含有AF、赫曲霉毒素、展青霉素、伏馬菌素、玉米赤霉烯酮等。因此在治療真菌毒素是若用含有真菌毒素的中

4、藥不但不能緩解病情,輕者耽誤時間重者造成死亡。所以能開發(fā)出高效、簡便、快捷又不影響藥性的檢測真菌毒素的方法就顯得尤為重要了。參考文獻：1MorgaviDP,RileyRT.AnhistoricaloverviewoffielddiseaseoutbreaksknownorsuspectedtobecausedbyconsumptionoffeedscontaminatedwithFusariumtoxinsJ.AnimalFeedSci.Technol,2007,137：201-212.2 何曉芳.中草藥制劑在奄菌毒素控制中的研究進展J.國外畜牧學,2012,32(5):30-32.3 孫紅祥

5、.一些中藥及其揮發(fā)性成分抗精菌活性研究J.中國中藥雜志,2001,26(2):99-102柴夢穎、焦鐳.15種中草苛提取液抑真曲活性的研究J.農(nóng)產(chǎn)品加工,2012,5:61-64.4 紀麗蓮，張強華.八種菊科中草藥抗毒菌及飼料霉變的研究J.生命科學研究.2003,7(4)：350-354.6石達友，廖申權.郭劍英.等.硒與中藥對黃曲每毒素B1所致錐鴨生長性能下降的影響J.中國家禽.2010,32(10)：16-18.7 桂同旺.中草藥防治雞黃曲霉素中毒初探J.中料醫(yī)學雜志，2001,2：30.8 郭劍英，郭銘生,潘家強，等.黃曲穩(wěn)毒素BI、復方中藥和硒對肉雞肝組織勻漿中自由基代謝的影響J.中國

6、家食,2012,34(7)：19-22.9 李楊，高祝，榮茜，等.“夏方柴苓顆?！狈乐硒嘃S曲霉毒素B1慢性中毒的作用機理J.浙江農(nóng)業(yè)學報,2015,27(8):1337-】344.10李物，高祝，榮茜，等.復方柴苓顆粒對鴨黃曲霉毒素慢性中毒CYP450酶活性的影響J.浙江農(nóng)業(yè)學報,2016,28(1):33-37.11李英倫，葉剛，賀常亮.復方柴苓顆粒對實驗性櫻桃谷鴨黃曲霉毒素中毒導致的肝損傷和氧化損傷的動態(tài)觀C.中國“活獸慈舟”學術研討會論文集，四川：2013：152-158,【12靳如文.中藥顆粒劑保肝護腎脫獐素的研制D.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學,2013.13 孫美涵.金葛解毒散對奶牛乳汁中黃

7、曲每毒素Ml殘留的影響DJ.黑龍江:黑龍江八一農(nóng)墾大學,2016.14 MManafi.HKhosravinia.EffectsofAflatoxinonthePerformanceofBroilerBreedersandItsAlleviationthroughHerbalMycotoxinBinderJ.JAgrSciTech,2013,15：55-63.15 SwathiA.JagadeeshS.ShridharNBal.EffectofHerbalMycotoxinBindersinAmeliorationofInducedMycotoxicosisinWhitelieghomLayi

8、ngHensJ.STARJournalSciTechnolArtsResJ,2014,3(3)：63-69.16 黃莉，張浩，丁偉琴，等.中藥中寅麻隹素污染問題J.海峽藥學,2009.21(6):95-99.17JAslamN,RodriguesI,McgillDM,e/al.TransferofaflatoxinsfromnaturallycontaminatedfeedtomilkofNii-RavibuffaloesfedamycotoxinbinderJ.AnimalProductionScience,2015.56.原，提高了檢測的靈敏度。對流免疫電泳（CIEP）:1985年建立了對

9、流免疫電泳快速診斷綿羊痘的方法,CIEP在檢測感染組織和細胞中的特異性抗原比AGPT敏感和快速。1999年Rao等設計電泳時用巴比妥緩沖液代替普通的鹽溶液極大地提高了CIEP的敏感性。熒光抗體技術（FAT）:1986年Soman等通過FAT對感染羊腎細胞和睪丸細胞的羊痘病毒抗原進行檢測。此方法快速簡單，在抗原感染14-24h之間就能被檢測到。也能夠檢測到感染動物水皰瘡液、皮膚、LK和LT細胞中的羊痘病毒抗原。血凝試驗（HemagglutinationTest,HT）：羊痘病毒因對動物紅細胞不產(chǎn)生凝集作用，用致敏的綿羊紅細胞來進行血凝試驗。1989年,Joshi等通過將羊痘抗體連接到葡萄球菌A蛋

10、白（SPA）上,成功的建立了檢測羊痘的協(xié)同凝集試驗。2005年,王開功等采用兔抗山羊痘病毒IgG致敏綿羊紅細胞建立的反向間接血凝試驗，對山羊痘病毒抗原具有特異性和敏感性，對疫區(qū)采集的山羊痘待檢抗原的檢測結果表明，反向間接血凝法的敏感性比瓊脂免疫擴散試驗高。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）:ELISA是抗原抗體反應與酶促反應相結合的一種技術，因其快速、便利、特異性強等特點被應用于羊痘病的診斷。1988年,Sharma等首次將ELISA用于山羊痘病毒的檢測，通過用活的和滅活的抗原與高免血清檢測山羊痘的血清與抗體，但是實驗背景高，且假陽性結果較高。隨后應用皮膚活檢建立了免疫捕獲ELISA,該方法特異性

11、能達到80%-100%，敏感性能達到70%-86%o1998年,建立了檢測山羊痘病毒的dot-EUSA檢測方法，通過dot-ELISA和CIEP兩種方法對西孟加拉的38個疑似羊痘病毒感染的樣品進行檢測，結果顯示dot-ELISA方法能檢出28份陽性，檢出率為68.4%,而CIEP能檢出21份陽性,檢出率為55.3%。用已知的陽性樣品作對照，dot-EUSA顯示100%的相關性,CIEP只有80%odot-ELISA有較高的敏感性和特異性,并能用于野外診斷。2008年吳國華等建立了羊痘病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法，用該方法檢測羊傳染性膿皰病毒和口蹄疫病毒，顯示無交叉反應，具有較高的特異性,與

12、瓊脂擴散試驗對比，其敏感性高48倍，可用于對山羊痘病毒和綿羊痘病毒的檢測。2分子生物學診斷基于臨床癥狀和血清學的診斷并不總是可靠的，所以為了克服這些限制，簡單、快速、特異地PCR技術成為檢測羊痘病毒并區(qū)分LSDV的有效手段。根據(jù)羊痘病毒的衣殼蛋白P32基因序列設計了相應的引物，分別建立了檢測羊痘的PCR方法，成功的從樣品中擴增出目的條帶。Markoulatos針對SPPV的ITR和a微管蛋白基因設計2對引物，建立了用于檢測皮膚組織中SPPV的多重PCR技術，該方法敏感性和特異性較好,24h內就可作出檢測，但偶爾會出現(xiàn)假陰性結果。Hosamani根據(jù)山羊痘病毒和綿羊痘病毒P32基因序列的差異，建

13、立了區(qū)分GTPV和SPPV的聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性分析技術（PCR-RFLP）。2010年，Lamien根據(jù)G蛋白偶聯(lián)趨化因子受體基因建立了q-PCR方法，該方法使用雙雜交探針,根據(jù)熒光溶解曲線,可以種屬鑒別及基因分型。2008年，韓若嬋等根據(jù)P32基因和末端反向重復序列基因片段設2對引物，建立多重PCR檢測方法，用此方法檢測口蹄疫病毒和羊口瘡病毒，結果均為陰性。2014年，趙志荀等的基于羊痘病毒的保守序列ITR設計三套引物，建立了區(qū)分綿羊痘和山羊痘的環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP），并對48份綿羊痘感染樣品和87份山羊痘感染樣品進行檢測，檢出率分別為100%和98.8%o3疫苗及

14、免疫3.1血清接種用發(fā)病并恢復健康的羊的血清或者抗羊痘病毒的血清接種羊，但是，其溫和的保護和血清免疫的失敗、致敏淋巴細胞，使之不能作為長期有效的免疫方法。3.2弱毒疫苗1957年，我國袁慶志等等通過將綿羊痘病毒在綿羊與雞胚之間交替?zhèn)鞔?，使病毒毒力減弱,并保持了良好的免疫原性。目前我國使用最多的仍然是沈榮顯分離的山羊痘病毒太原株經(jīng)雞胚減毒后的弱毒疫苗,命名為AV41疫苗株，該疫苗免疫動物后免疫持續(xù)期能到1年左右，既能抵抗山羊痘病毒感染又能抵抗綿羊痘病毒感染。印度研制的經(jīng)Vero細胞致弱的山羊痘病毒的活疫苗，接種102.5TCID為的劑量，能提供46月齡的山羊52個月的保護3）。肯尼亞綿羊山羊02

15、40株是在自然條件下，同一個屬的病毒出現(xiàn)重組并分離得到的,此疫苗株能夠很好保護綿羊和山羊，在非洲的一些國家用于綿羊和山羊的接種免疫。但是弱毒疫苗存在免疫動物后毒力返強和散毒的風險，因此非常有必要研制出更加安全有效的疫苗。3.3多肽疫苗綿羊痘病毒的VP3蛋白被證明是免疫性蛋白，并且在兔體內能引起高水平的體液免疫和細胞免疫F）。用弗氏不完全佐劑乳化的VP3蛋白免疫羊可誘導產(chǎn)生1：256滴度的血清抗體，對免疫VP3后接種病毒21d的羊提供67%的保護°羊痘病毒的另一種結構蛋白-P32蛋白，是近些年的研究熱點，它有很好的免疫原性，能夠誘導中和抗體的產(chǎn)生，但是由于P32蛋白表達量低并且不穩(wěn)定，

16、這在一定程度上制約著此方法的應用前景。因此，找到另一種免疫原性更好，表達量、穩(wěn)定性更好的基因勢在必行。3.4活載體疫苗隨著分子技術的發(fā)展，以羊痘病毒作為活載體的研究取得了一些進展。羊痘病毒作為活載體有很多優(yōu)點，其基因組結構明確，穩(wěn)定性強,基因組容量大，可容納至少25Kb的外源基因而不失去感染力，有多個復制非必需區(qū)，對外源基因的插入耐受性強。羊痘病毒宿主范圍窄，只感染羊,對其他動物安全性高，并且能引起強烈的細胞免疫。Romero等【鳳構建的牛瘟病毒H基因的重組山羊痘病毒，動物試驗顯示，體內存在滴度較高的山羊痘病毒中和抗體和牛瘟病毒中和抗體。另外，Wade-Evans等構建表達了藍舌病VP7基因的

17、重組羊痘病毒。Aspdcn等構建表達狂犬病病毒糖蛋白的重組羊痘病毒，作為復制缺陷型疫苗。Berhe等構建表達小反芻獸疫病毒F基因的重組羊痘病毒都有很好的效果。4討論目前我國研究羊痘病毒的實驗室已經(jīng)研發(fā)出多個可以用于羊痘病毒診斷的分子和血清學診斷方法，但是各種原因，目前國內尚沒有商品化的診斷試劑盒問世，所以推動羊痘病毒診斷的標準化勢在必行。隨著分子生物學的迅猛發(fā)展，目前對羊痘病毒基因的理解也更加深入。羊痘病毒毒力基因、宿主范圍基因和宿主之間的關系等基礎研究的深入，為研發(fā)新的檢測方法和疫苗提供了依據(jù)。另外，羊痘病毒作為活病毒載體有著眾多優(yōu)點，研發(fā)羊痘病毒活載體為基礎的多價疫苗是今后一個重要的研究方

18、向。由于羊痘目前僅在亞洲和非洲發(fā)展中國家和落后國家大規(guī)模流行，歐洲早已消滅了羊痘病毒，因此發(fā)達國家對羊痘的研究較少。羊痘病毒的免疫和致病機制的研究幾乎是空白，因此，要加強和推動羊痘病毒的基礎研究，為羊痘的診斷、疫苗的研發(fā)和疾病的控制奠定基礎。參考文獻：1BhambaniBD,KrishnamurthyD.AnimmunodiffusiontestforlaboratorydiagnosisofsheeppoxandgoatpoxJJCompPathol,1963,73:349-357.2RaoTVS,PoonamMalik,AsgolaD.Evaluationofavidin-biotinEL

19、ISAforthedetectionofantibodiestogoatpoxvirususingnonin-fectiousdiagnosticreagentJ.ActaVirologica,1999,43:297-301.3 SomanJP.AntigenicdetectionofsheeppoxvirusinthesheepkidneyandtestescellculturesbyimmunoflourescenttestJ.IndianVetJ,1986,63(10)：793-795.4 王開功，虞天德,何光志.等.應用反向間接血凝試驗檢測山羊痘病毒抗原:J.山地農(nóng)業(yè)生物學報,2005

20、,24(1)：29-32.SharmaSN,NegiBS.YadavMP,efal.ApplicationofELISAinthedetectionofgoatpoxantigenandantibodiesJ.ActaVirologi-ca,1988,32:65-69.5 吳國華，張強，顏新敏，等.羊痘病毒雙抗體夾心EUSA檢測方法的建立J.江西農(nóng)業(yè)大學學報,2008,30(5):860-864.6 韓若嬋，張強，吳國華，等.羊痘病毒多重PCR檢測方法的建立J.中國獸醫(yī)科學,2008,38(3)：206-208.'8一ZhaoZ.FanB,WuG,etal.Developmentofl

21、oop-mediatedisothermalamplificationassayforspecificandrapiddetectionofdifferentialgoatPoxvirusandSheepPoxvirusJ.BmcMicrobiology,2014,14(1):1-10.9 袁慶志，李寶啟，沈榮顯.羊痘弱毒疫苗的研究一第一報羊痘病毒雞胚培養(yǎng)的研究J.畜牧獸醫(yī)學報，1957,2(1)：15-23.10 HosamaniM,NandiS,MondalB,etal.AVen>cell-attenuatedGoatpoxvirusprovidesprotectionagainst

22、virulentviruschallenge.J.ActaVirol函ca,2004.48(1)：1521.11 RaiA,SinghUS,PandeyKD,e*al.Characterizationofanimmunogenicviralproteinofsheeppoxvirus；J.IndianJVirol,1985,1(2):120-126.12 RaiA,GeelAC,PandeyKD,etal.ImmunogenicityofavirionpolypeptideofsheeppoxvirusinsheepfJ.IndianJVirol,1986,2(1):11-15.13,KomeroCH,BarrettT,KitchingRP,eral.Protectionofcattlea-gainstrinderpestandlumpyskindise