DNA納米技術(shù)從試管走向細(xì)胞的歷程

1、DNA納米技術(shù)從試管走向細(xì)胞的歷程基于沃森-克里克堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，隨著合成成本的降低，DNA在構(gòu)建自組裝分子結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)分子裝置上得到了廣泛的應(yīng)用。在無(wú)細(xì)胞環(huán)境中，DNA納米技術(shù)的研究者對(duì)DNA復(fù)雜系統(tǒng)和定量反應(yīng)機(jī)制的研究已經(jīng)達(dá)到基因工程和細(xì)胞技術(shù)無(wú)法企及的程度。然而，DNA納米技術(shù)最有趣的應(yīng)用（最大地利用DNA系統(tǒng)尺寸小、生物相容性好以及可塑性強(qiáng)的性質(zhì)）都停留在生物界面的程度。這篇綜述里，我們回顧了DNA納米技術(shù)研究從試管到細(xì)胞的歷程。我們著重介紹了DNA成像探針、智能治療及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵性突破，同時(shí)展望了細(xì)胞DNA納米技術(shù)未來(lái)的挑戰(zhàn)和機(jī)遇。 DNA納米技術(shù)屬于純粹的分子生物工

2、程學(xué)技術(shù)。這一領(lǐng)域旨在將DNA作為工程學(xué)材料構(gòu)建分子結(jié)構(gòu)和裝置。DNA堿基互補(bǔ)配對(duì)的自然特性使得控制DNA間的相互作用變得簡(jiǎn)單，同時(shí)可以合理地設(shè)計(jì)具有精確尺寸的DNA納米結(jié)構(gòu)、自主移動(dòng)的分子馬達(dá)和處理信息的DNA回路。目前還沒(méi)有任何其它分子工程技術(shù)可以像DNA納米技術(shù)這樣完全從頭設(shè)計(jì)復(fù)雜多樣的類(lèi)分子生物系統(tǒng)。DNA納米技術(shù)的成功源于三個(gè)關(guān)鍵因素：1. 對(duì)DNA熱動(dòng)力學(xué)的認(rèn)知使得我們可以精確預(yù)測(cè)單鏈DNA自身折疊及DNA分子間的相互作用（1，2）；2. DNA合成成本不斷下降，質(zhì)量不斷提高（3）；3. 研究主要在無(wú)細(xì)胞環(huán)境中進(jìn)行，DNA不會(huì)受到的DNA/RNA酶以及細(xì)胞內(nèi)可能會(huì)出現(xiàn)的其它復(fù)雜因子

3、的干擾，故而可以朝著設(shè)計(jì)的預(yù)期發(fā)展。長(zhǎng)期以來(lái)，DNA納米技術(shù)的發(fā)展動(dòng)力是構(gòu)建智能治療劑、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、分子生物學(xué)工具以及其他可以與活細(xì)胞相互作用甚至能操控活細(xì)胞的裝置（4-7）（Fig.1）。這些應(yīng)用是核酸結(jié)構(gòu)和裝置的顯著優(yōu)勢(shì)，特別是它們尺寸小、生物相容性好以及可控的通過(guò)雜交與細(xì)胞核酸作用的明確性質(zhì)。然而，要實(shí)現(xiàn)DNA納米技術(shù)的應(yīng)用，必須解決從高度混合的反應(yīng)緩沖液到空間結(jié)構(gòu)化、內(nèi)容復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)依然可以進(jìn)行（Box 1）。在這篇綜述里，我們總結(jié)了最近將DNA納米技術(shù)應(yīng)用至細(xì)胞的研究進(jìn)程。我們著重于核酸納米裝置及結(jié)構(gòu)的合理設(shè)計(jì)、化學(xué)修飾，然后轉(zhuǎn)運(yùn)至哺乳細(xì)胞的過(guò)程。首先，我們簡(jiǎn)單回顧了細(xì)胞

4、外DNA納米技術(shù)的研究；然后，轉(zhuǎn)向更多的類(lèi)細(xì)胞環(huán)境的研究。在細(xì)胞裂解液或固定細(xì)胞等類(lèi)細(xì)胞環(huán)境下，可以不完全的部分模擬復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境，獲得相關(guān)數(shù)據(jù)。接下來(lái)，在介紹轉(zhuǎn)運(yùn)DNA裝置至細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)工作前，我們討論了最近一些證明DNA納米裝置可控的與細(xì)胞表面蛋白相互作用的研究成果。緊接著介紹了在活細(xì)胞內(nèi)工作的裝置，同時(shí)回顧了利用DNA探針和邏輯門(mén)檢測(cè)、分析和調(diào)控細(xì)胞內(nèi)RNA水平的早期工作。我們通過(guò)著重介紹在活細(xì)胞內(nèi)增強(qiáng)DNA裝置表現(xiàn)的RNA成像探針、siRNAs或者ASOs的設(shè)計(jì)原則來(lái)介紹這一部分工作。最后，我們介紹了與DNA納米技術(shù)很大程度上有著相同目標(biāo)但又用于遺傳編碼和轉(zhuǎn)錄RNA的RNA納米技術(shù)和R

5、NA合成學(xué)。Figure 1| DNA納米技術(shù)在生物界面上的應(yīng)用 A，智能治療劑可以將結(jié)構(gòu)與分子邏輯結(jié)合，在特定的細(xì)胞或組織內(nèi)實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)治療（60）。B，DNA納米結(jié)構(gòu)可作為可設(shè)計(jì)的腳手架來(lái)附著藥物、靶標(biāo)鏈和脂雙分子層等其他修飾（78）。C，一系列新奇的敏感特定的成像探針，基于DNA設(shè)計(jì)的與RNA序列特異性相互作用的信號(hào)放大器（52）。D，DNA折紙和其它結(jié)構(gòu)可精確控制功能分子基團(tuán)的空間結(jié)構(gòu)，形成高效的細(xì)胞生物學(xué)定量檢測(cè)工具（66）。無(wú)細(xì)胞DNA納米技術(shù)為了在復(fù)雜潮濕的環(huán)境中可靠地實(shí)現(xiàn)功能，在活體用分子傳感器檢測(cè)環(huán)境變化；用分子馬達(dá)和致動(dòng)器適應(yīng)環(huán)境；用計(jì)算控制回路將傳感器信息轉(zhuǎn)換為馬達(dá)的運(yùn)行；用

6、特定結(jié)構(gòu)的元素來(lái)保護(hù)并組織這些部件。有趣的是，在無(wú)細(xì)胞環(huán)境下，DNA納米技術(shù)在組織大部分模擬復(fù)雜生物現(xiàn)象的分子馬達(dá)必須的大部分功能化組件上已經(jīng)有了一定的進(jìn)展。我們?cè)谶@里回顧了一些無(wú)細(xì)胞DNA納米技術(shù)的主要成果并指出了其在細(xì)胞環(huán)境中的潛在應(yīng)用。結(jié)構(gòu)DNA納米技術(shù)在上世紀(jì)80年代，Nadrian Seeman提出了DNA可以作為結(jié)構(gòu)工程學(xué)材料這一概念（8-10）。在1998年，Winfree等首次經(jīng)實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了大尺寸結(jié)構(gòu)的合成：他們證明納米尺寸的DNA小塊可以通過(guò)多條寡聚核苷酸鏈自組裝形成微米級(jí)的周期性排列的DNA陣列（11）。隨后，tile自組裝和相關(guān)技術(shù)被成功的應(yīng)用與構(gòu)建一系列的陣列和網(wǎng)絡(luò)DNA

7、結(jié)構(gòu)（11-19）。Rothemund通過(guò)DNA折紙將結(jié)構(gòu)DNA自組裝進(jìn)一步發(fā)展。DNA折紙術(shù)操作簡(jiǎn)單，結(jié)構(gòu)具有足夠的彈性來(lái)適應(yīng)幾乎所有的二維結(jié)構(gòu)，而且能夠穩(wěn)定高效的形成目標(biāo)結(jié)構(gòu)（20）。DNA折紙通過(guò)長(zhǎng)單鏈與大量短訂書(shū)鏈雜交折疊成目的結(jié)構(gòu)。這項(xiàng)技術(shù)被快速?gòu)V泛地應(yīng)用，而且廣泛的用于自組裝三維結(jié)構(gòu)（21-24）。DNA納米結(jié)構(gòu)一開(kāi)始是作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)工具和相似的應(yīng)用來(lái)研究，因?yàn)镈NA折紙上精確分布的腳手鏈，可以連接藥物和靶標(biāo)等官能基團(tuán)。另外，三維結(jié)構(gòu)可以設(shè)計(jì)成需載運(yùn)藥物的保護(hù)結(jié)構(gòu)。動(dòng)態(tài)DNA納米技術(shù)動(dòng)態(tài)DNA納米技術(shù)通過(guò)DNA酶催化或DNA鏈置換反應(yīng)介導(dǎo)的鏈雜交實(shí)現(xiàn)的自組裝構(gòu)建具有可移動(dòng)部件或時(shí)變行

8、為的裝置。動(dòng)態(tài)DNA納米技術(shù)可追溯至多方面的起源，包括Adleman關(guān)于DNA計(jì)算及功能化核酸的進(jìn)展和表征研究（25）。然而，真正開(kāi)啟這一領(lǐng)域的是Yurke及其合作者，他們證明功能化分子馬達(dá)可被合理地設(shè)計(jì)，并且僅通過(guò)雜交和鏈置換反應(yīng)實(shí)現(xiàn)周期性工作（26）。隨后，Winfree和Pierce課題組證明多重鏈置換反應(yīng)可以組合在一起構(gòu)建復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)（27，28）。由于DNA鏈置換級(jí)聯(lián)反應(yīng)原理簡(jiǎn)單，自從被應(yīng)用以來(lái)已經(jīng)被廣泛和有效地應(yīng)用于分子工程，成為大量動(dòng)態(tài)DNA裝置的工作原理。動(dòng)態(tài)DNA納米技術(shù)在分子馬達(dá)中的應(yīng)用（29，30）包括：沿軌道自主移動(dòng)的步行馬達(dá)（31-34）；分析復(fù)雜混合分子體系中信息

9、的分子回路（27，35-39）；可以檢測(cè)和放大信號(hào)的催化放大器（40-44）。很多這種系統(tǒng)有明顯的潛在生物學(xué)應(yīng)用，比如：Shapiro及其合作者利用DNA和限制酶構(gòu)建通體外過(guò)檢測(cè)和分析一類(lèi)基因調(diào)控類(lèi)似產(chǎn)物的分子標(biāo)簽來(lái)診斷疾病階段（6，45）。相反的，分子裝置和結(jié)構(gòu)在活細(xì)胞上和活細(xì)胞內(nèi)分析和檢測(cè)分子信息這一應(yīng)用領(lǐng)域超越相應(yīng)的電力學(xué)方法。Box 1|細(xì)胞內(nèi)的人工核酸研究人員在研究ASO、siRNA、分子信標(biāo)以及相關(guān)技術(shù)的過(guò)程中發(fā)展了不同的技術(shù)、設(shè)計(jì)原則及限制因素，幫助我們認(rèn)識(shí)核酸納米結(jié)構(gòu)進(jìn)入細(xì)胞所需克服的困難。轉(zhuǎn)運(yùn)在試管中，各種組分的濃度可以精確控制，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。核酸裝置要在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮

10、功能，首先必須穿過(guò)細(xì)胞膜。不同的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)方法會(huì)導(dǎo)致截然不同的細(xì)胞攝取速率、攝取量、細(xì)胞器內(nèi)的分布甚至細(xì)胞狀態(tài)。例如通常用于轉(zhuǎn)染的脂類(lèi)試劑能夠有效的轉(zhuǎn)運(yùn)大量的探針進(jìn)入細(xì)胞，但是一大部分都被包裹在溶酶體內(nèi)，并不能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)（132，133）。相反，顯微注射可以將核酸直接遞送至細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，但僅限于相關(guān)的少數(shù)細(xì)胞。我們參考了Bao等（134）更深入地比較轉(zhuǎn)運(yùn)合成核酸至細(xì)胞的不同方法及Davis等關(guān)于納米顆粒藥物載運(yùn)的綜述（85）。穩(wěn)定性與化學(xué)修飾未作化學(xué)修飾的短鏈核酸在細(xì)胞內(nèi)的半衰期很短（135）。然而，大量針對(duì)核酸五碳糖、堿基和骨架的化學(xué)修飾已被證明能夠有效的增強(qiáng)其穩(wěn)定性。最常用的修飾有核苷內(nèi)連

11、接處的磷酸化修飾和核糖的2甲氧基修飾（136）。因?yàn)榛瘜W(xué)修飾能有效保護(hù)核酸抵抗核酸酶的降解，一些化學(xué)修飾（比如磷酸化鍵合（137）可能會(huì)影響細(xì)胞活性（138）。因此，在選擇核酸裝置修飾時(shí)，必須平衡裝置穩(wěn)定性與細(xì)胞活性。分子聚集與細(xì)胞區(qū)域化細(xì)胞內(nèi)密布著蛋白和其它生物大分子，會(huì)干擾多級(jí)多輸入邏輯回路和其它具有很多相互作用組分系統(tǒng)的運(yùn)行。隨著分子尺寸的變化，合成DNA在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的擴(kuò)散率為水溶液中1-20%（139）。在細(xì)胞環(huán)境和緩沖液中，單鏈互補(bǔ)核酸的雜交速度也不一樣（140）。另外，哺乳動(dòng)物細(xì)胞由多種不同的單元組合形成，這些單元間的分隔會(huì)阻礙回路中的不同組分在細(xì)胞內(nèi)相遇。免疫活性進(jìn)入細(xì)胞的外源核酸

12、會(huì)通過(guò)激活TLR受體引發(fā)自發(fā)免疫應(yīng)答。TLR3識(shí)別雙鏈RNA，TLR7和TLR8識(shí)別單鏈RNA，TLR9識(shí)別DNA中的非甲基化CpG。哺乳細(xì)胞基因組中的CpG是完全甲基化的，而細(xì)菌的沒(méi)有，TLR9的任務(wù)就是檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌源的非甲基化CpG（79）。蛋白激酶R結(jié)合的長(zhǎng)于30bp的雙鏈RNA會(huì)激活細(xì)胞免疫應(yīng)答，導(dǎo)致細(xì)胞死亡（141）。TLR9（142）或PKR（143）激活介導(dǎo)的免疫應(yīng)答被認(rèn)為是具有治療意義的，所以這兩種通路的免疫刺激可能是大家喜聞樂(lè)見(jiàn)的。然而，避免這些免疫刺激更為普遍。細(xì)胞裂解液和固定細(xì)胞內(nèi)的DNA納米技術(shù)細(xì)胞環(huán)境與無(wú)細(xì)胞環(huán)境截然不同（Box 1）：DNA酶和RNA酶等核酸結(jié)合

13、蛋白的存在可能會(huì)影響裝置的功能。另外，細(xì)胞內(nèi)高度結(jié)構(gòu)化，限制了外源核酸的自由擴(kuò)散。細(xì)胞裂解液、血清和固定細(xì)胞提供模擬活細(xì)胞某些性質(zhì)的反應(yīng)環(huán)境，同時(shí)有保證了DNA裝置的檢測(cè)和觀察處于一個(gè)相對(duì)可控的環(huán)境中。DNA納米結(jié)構(gòu)在細(xì)胞裂解液和血清中的穩(wěn)定性裂解液是細(xì)胞內(nèi)容物的均勻混合物。即使DNA納米結(jié)構(gòu)在裂解液中遇到的細(xì)胞組分與細(xì)胞內(nèi)的濃度與活性不同，核酸裝置可以很容易進(jìn)入這種模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的沒(méi)有細(xì)胞壁的環(huán)境中。Yan Hao, Meldrum和合作者發(fā)現(xiàn)DNA折紙細(xì)胞裂解液中孵育12小時(shí)后可以重新提取并表征（46），而長(zhǎng)單鏈和雙鏈孵育后無(wú)法重新獲得。由于折紙與裂解液混合液的詳細(xì)條件并沒(méi)有公布，很難判斷

14、該反應(yīng)條件與生理環(huán)境的相似度。另外，DNA折紙實(shí)在高M(jìn)g2+濃度（10 Mm）的溶液中折疊的，向裂解液中加入大量的結(jié)構(gòu)會(huì)提高反應(yīng)液的Mg2+濃度，使得結(jié)構(gòu)看上去很穩(wěn)定，但是在細(xì)胞內(nèi)就很難預(yù)測(cè)了。即使這樣，這些效應(yīng)都是可以控制的，細(xì)胞裂解液仍然是探索納米裝置在生理環(huán)境表現(xiàn)的有效方法。將納米結(jié)構(gòu)送入細(xì)胞和動(dòng)物要求結(jié)構(gòu)在血清和含血清的培養(yǎng)基中能保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。血清跟裂解液一樣含有核酸酶，缺乏維持結(jié)構(gòu)所需的鎂等鹽離子。Conway等發(fā)現(xiàn)具有三棱柱結(jié)構(gòu)的三鏈小結(jié)構(gòu)血清內(nèi)穩(wěn)定性比無(wú)結(jié)構(gòu)混合鏈好（47）。電泳分析顯示無(wú)結(jié)構(gòu)鏈在10%胚牛血清中的半衰期小于1小時(shí)，而具有完整結(jié)構(gòu)的鏈半衰期接近兩小時(shí)。對(duì)鏈進(jìn)行化學(xué)

15、修飾后，結(jié)構(gòu)的半衰期甚至大于24小時(shí)。Perrault和同事全面分析了三維折紙?jiān)诤宓牟溉閯?dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)的穩(wěn)定性，證明折紙結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的強(qiáng)弱取決于：折紙的設(shè)計(jì)、Mg2+濃度及核酸酶的活性（48）。通過(guò)電泳和TEM表征，他們發(fā)現(xiàn)折紙與細(xì)胞培養(yǎng)基孵育一天后，3次試驗(yàn)中有兩次出現(xiàn)了部分折紙分解的現(xiàn)象，而向培養(yǎng)基中加入6mM Mg2+可以抑制分解。有趣的是具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA折紙納米管即使不在培養(yǎng)基中加鹽也能保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。向培養(yǎng)基中加入高于5%的胚牛血清，孵育24小時(shí)后3種結(jié)構(gòu)皆被DNA酶部分降解。當(dāng)加入能與核酸競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的肌動(dòng)蛋白后核酸酶對(duì)結(jié)構(gòu)的降解作用神奇地減弱了，并且這種修飾在細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境下也

16、有效。為了定量DNA酶對(duì)納米結(jié)構(gòu)降解的程度，Keum和Bermudez檢測(cè)了DNA四面體在DNAase 1存在下的半衰期，發(fā)現(xiàn)DNA四面體比雙鏈DNA穩(wěn)定3倍（49）。DNA折紙也同樣被證明在核酸酶的環(huán)境中比雙鏈DNA穩(wěn)定。Castro等將折紙與不同的核酸酶孵育24小時(shí)后，通過(guò)TEM和電泳評(píng)估折紙的降解程度（50）。在DNase 1和T7核酸內(nèi)切酶環(huán)境中檢測(cè)到了降解，然而在DNase 1中折紙的降解速度比DNA雙鏈慢了幾百倍。比較折紙與四面體的研究，證明DNA折紙比較小的四面體更穩(wěn)定，可能是應(yīng)為折紙中鏈之間的連接更緊密。上述的研究說(shuō)明DNA納米結(jié)構(gòu)比簡(jiǎn)單的單雙鏈核酸更能抵抗核酸酶的降解。而且一

17、些納米結(jié)構(gòu)在生理鹽濃度下能夠長(zhǎng)時(shí)間保持結(jié)構(gòu)的完整。以后的研究必需完全揭示結(jié)構(gòu)的功能與穩(wěn)定性的內(nèi)在關(guān)系。固定細(xì)胞內(nèi)的DNA納米技術(shù)通透化處理的細(xì)胞和組織在某些方面依然能夠模擬細(xì)胞環(huán)境：固定化細(xì)胞的很多結(jié)構(gòu)組織依然保存完好，特別是區(qū)域化分布的mRNA和蛋白。固定化細(xì)胞為免疫或熒光原位雜交觀測(cè)細(xì)胞內(nèi)的mRNA和蛋白分布提供了一個(gè)可控的環(huán)境?；贒NA納米結(jié)構(gòu)的新方法很實(shí)用并且提高免疫或熒光原位雜交的靈敏度和特異性。例如基于HCR的分子探針已經(jīng)在完整的脊椎動(dòng)物胚胎中對(duì)5種靶標(biāo)RNA實(shí)現(xiàn)了同時(shí)成像（51，52）。通過(guò)在靶標(biāo)mRNA雜交一系列適配鏈，Choi等可控地催化兩種帶有熒光標(biāo)記的發(fā)卡結(jié)構(gòu)發(fā)生聚合反

18、應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物與靶標(biāo)mRNA結(jié)合，實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)放大，就可以很容易地通過(guò)熒光顯微鏡實(shí)現(xiàn)成像（Fig. 2a）。Raj和同事將鏈置換與單分子FISH (smFISH)相結(jié)合，通過(guò)檢測(cè)個(gè)體內(nèi)的mRNA可以獲得單堿基突變信息（53）。進(jìn)行單分子熒光原位雜交時(shí)，大量單獨(dú)標(biāo)記的DNA短鏈透過(guò)固定的細(xì)胞膜與靶標(biāo)mRNA的不同區(qū)域結(jié)合（54）。對(duì)同一靶標(biāo)mRNA上的探針進(jìn)行共定位，可以得到普通熒光顯微鏡就能區(qū)分的不連續(xù)的熒光亮點(diǎn)。單堿基水平的區(qū)分是通過(guò)另外加入修飾熒光/淬滅劑的鏈置換探針實(shí)現(xiàn)的（53）。如果Toehold和靶標(biāo)區(qū)域出現(xiàn)單堿基突變就會(huì)明顯降低探針鏈通過(guò)Toehold介導(dǎo)鏈置換的速度，對(duì)單堿基突變探

19、針進(jìn)行共定位就可以分析是否出現(xiàn)突變（Figure 2b）。固定細(xì)胞內(nèi)的鏈置換也已經(jīng)用于研究DNA標(biāo)記的蛋白研究（55）。這種雜交和鏈置換的能力使得多種蛋白成像不再受限于顯微鏡能提供的波長(zhǎng)（通常四種），轉(zhuǎn)而之受限于能夠?qū)崿F(xiàn)雜交和鏈置換的序列數(shù)量。DNA-PAINT同樣利用了DNA雜交的可逆性質(zhì)。短的、熒光標(biāo)記的DNA成像序列可以瞬間與互補(bǔ)的錨定鏈結(jié)合，從而附著至靶標(biāo)上（56）。這種自發(fā)的結(jié)合與解離使得熒光像開(kāi)關(guān)一樣在打開(kāi)與關(guān)閉之間切換，這使得靶標(biāo)位點(diǎn)在全內(nèi)反射顯微鏡上的成像分辨率達(dá)到10nm。綜上所述，DNA-PAINT可逆的性質(zhì)使其不受限于熒光分子的數(shù)量，而且標(biāo)記于序列上的熒光染料可以反復(fù)使用

20、。DNA-PAINT在固定細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)通過(guò)DNA錨定鏈結(jié)合的抗體來(lái)靶向細(xì)胞內(nèi)的蛋白實(shí)現(xiàn)了三維成像（57）。Figure 2| 固定細(xì)胞內(nèi)的mRNA原位成像。A, HCR FISH（52）。左：起始鏈雜交至靶標(biāo)mRNA，然后引發(fā)兩種熒光標(biāo)記的發(fā)卡結(jié)構(gòu)H1，H2之間發(fā)生聚合反應(yīng)，使得mRNA上結(jié)合多個(gè)熒光分子，可以通過(guò)熒光顯微鏡成像。右：斑馬魚(yú)Z軸上不同位置的共聚焦顯微鏡成像。HCR探針用于檢測(cè)四種不同的mRNA (紅: Tg (flk1:egfp); 藍(lán): tpm3; 綠: elevl3; 黃: ntla). B, 通過(guò)鏈置換探針檢測(cè)單堿基突變（53）。左：反應(yīng)機(jī)制，突變型和野生型探針與靶標(biāo)mRN

21、A競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。由于結(jié)合能力取決于Toehold序列，每一種探針都趨向于結(jié)合同源mRNA。通過(guò)多mRNA靶向探針與單核酸突變檢測(cè)探針共定位進(jìn)一步證明信號(hào)確實(shí)位于mRNA上。右：導(dǎo)向探針（image 1）、野生型探針（image 2）和突變探針（image 3）對(duì)BRAF mRNA進(jìn)行熒光成像。Image 4顯示了mRNA被區(qū)分為野生型或突變型。與細(xì)胞表面的標(biāo)簽相互作用哺乳動(dòng)物細(xì)胞是由大量的區(qū)域和結(jié)構(gòu)組成，不同的結(jié)構(gòu)和區(qū)域負(fù)責(zé)不同的生化反應(yīng)。細(xì)胞表面最容易接近的結(jié)構(gòu)，脂質(zhì)雙分子層結(jié)合了許多表面蛋白，不同類(lèi)型的細(xì)胞表面蛋白也不一樣。最近的幾篇文獻(xiàn)證明DNA納米系統(tǒng)通過(guò)設(shè)計(jì)可以與細(xì)胞表面的標(biāo)簽相互作用

22、；像抗體、適配體一樣（58），DNA治療劑最成熟的例子是靶向血液中的細(xì)胞表面標(biāo)簽和細(xì)胞，而不需要將納米結(jié)構(gòu)攝取至特定的細(xì)胞或組織中。Stojanovic和同事通過(guò)將DNA鏈置換探針共價(jià)修飾蛋白抗體的方法使探針結(jié)合特定的細(xì)胞表面蛋白（59）。細(xì)胞結(jié)合一種或者兩種探針取決于細(xì)胞表面具有哪種蛋白。探針結(jié)合至蛋白后，加入引發(fā)鏈，激發(fā)包括探針在內(nèi)的一系列的鏈置換反應(yīng)，結(jié)果取決于細(xì)胞表面探針的種類(lèi)和數(shù)量，從而區(qū)分細(xì)胞種類(lèi)（Fig. 3a）。雖然在細(xì)胞表面標(biāo)記兩種熒光標(biāo)記的抗體也能獲得類(lèi)似的結(jié)果，但是這項(xiàng)工作提供了更容易實(shí)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)分選的方法，使同時(shí)分析多種分子標(biāo)簽和將信息匯總為更容易翻譯的動(dòng)態(tài)信號(hào)更有可能

23、實(shí)現(xiàn)。Douglas等組裝了DNA納米機(jī)器人，載帶可捕獲特定種類(lèi)細(xì)胞的分子（60）。這種捕獲是通過(guò)適配體與原本不能捕獲細(xì)胞的Origami鏈雜交將細(xì)胞與Origami連接在一起的。適配體是選擇性結(jié)合特定蛋白或完整細(xì)胞的DNA或RNA（61，62），能夠通過(guò)鏈雜交將納米機(jī)器人與特定細(xì)胞結(jié)合，避免了將DNA與抗體結(jié)合。適配體也屬于捕獲機(jī)制的一部分，其與靶標(biāo)蛋白結(jié)合后會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，從而使Origami可以捕獲。由兩種不同的適配體設(shè)計(jì)組合成的邏輯與門(mén)被用來(lái)將不同的熒光和藥物分子靶向至細(xì)胞（Fig. 3b）。有趣的是，一種相似的納米機(jī)器人被證明可以在蟑螂血流中發(fā)揮作用，并與其它納米機(jī)器人共同實(shí)現(xiàn)邏輯運(yùn)

24、算（63）。Tan課題組也利用適配體構(gòu)建的邏輯門(mén)區(qū)分混合的多種細(xì)胞（64）。該課題組最近證明模塊化設(shè)計(jì)的邏輯門(mén)可以有更多的信號(hào)輸入，能結(jié)合更多的雜交鏈，可以降低脫靶效應(yīng)（65）。DNA納米裝置不僅可以標(biāo)記細(xì)胞表面的標(biāo)簽，Origami的可尋址性可以在納米尺度上精確控制適配體鏈的組裝密度（66）。Shaw等DNA系統(tǒng)的可尋址性還可以為DNA進(jìn)入細(xì)胞制造特殊身份。Francis和同事發(fā)展了一種將合成DNA固定至活細(xì)胞表面的方法，從而可以不受特意性分子數(shù)量限制的標(biāo)記細(xì)胞（67）。合成糖處理細(xì)胞后變形并和細(xì)胞膜融為一體，可以作為“化學(xué)手臂”，然后磷酸化修飾的單鏈DNA通過(guò)Staudinger連接法連接

25、至“化學(xué)手臂”（68）。Gartner和Bertozzi證明這種方法可以用于將細(xì)胞組織形成三維細(xì)胞聚集結(jié)構(gòu)（69）。作為結(jié)構(gòu)指導(dǎo)膜功能的例子，作者將中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞組織成“微膜”結(jié)構(gòu)，為造血原細(xì)胞（FL5.12）的生長(zhǎng)提供生長(zhǎng)因子IL-3。造血原細(xì)胞只有接合至分泌IL-3的細(xì)胞才能生長(zhǎng)。Gartner課題組進(jìn)一步將這一策略用于不同細(xì)胞間不同的Ras信號(hào)對(duì)這種微膜結(jié)構(gòu)變化的影響（70）。除了可以模仿細(xì)胞間的連接基元外，DNA還可以被用于模仿其它蛋白的功能。通過(guò)修飾親水基團(tuán)，DNA結(jié)構(gòu)可以插入脂膜（71，72）。Burns等證明納米孔通道插入脂膜后具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性（73），可能是由于離子、營(yíng)養(yǎng)物及其

26、它跨膜分子的自由移動(dòng)導(dǎo)致。Figure 3| 細(xì)胞表面計(jì)算A，通過(guò)細(xì)胞表面標(biāo)簽的原位評(píng)估進(jìn)行細(xì)胞種類(lèi)區(qū)分（59）。細(xì)胞先包裹DNA修飾的抗體（DNA回路、抗體以矩形和橢圓表示，DNA鏈用各種顏色的鏈表示），一個(gè)或兩個(gè)邏輯門(mén)結(jié)合至細(xì)胞后，通過(guò)表面標(biāo)簽勾勒細(xì)胞輪廓。隨后加入的起始鏈（紅色）引發(fā)一系列鏈置換反應(yīng)（完全互補(bǔ)的序列用同樣的顏色標(biāo)志）。可溶解的報(bào)告復(fù)合物只能結(jié)合表面同時(shí)結(jié)合了兩種邏輯門(mén)的細(xì)胞。 B. 對(duì)特定細(xì)胞種類(lèi)進(jìn)行治療的分子機(jī)器人。概要圖介紹了管狀納米機(jī)器人響應(yīng)細(xì)胞表面表達(dá)的特定抗原（鑰匙）的機(jī)制（60）。納米機(jī)器人最初由兩條適配體鎖鏈固定為一個(gè)封閉的結(jié)構(gòu)，只有當(dāng)它遇到膜表面呈現(xiàn)兩種對(duì)

27、應(yīng)抗體的細(xì)胞時(shí)才能打開(kāi)，從而釋放藥物。底部：納米機(jī)器人關(guān)閉和打開(kāi)狀態(tài)下的TEM圖片（比例尺：20nm）。DNA納米結(jié)構(gòu)作為藥物載運(yùn)裝置討論至此不僅證明在細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)基（以及昆蟲(chóng)內(nèi)）中納米裝置和結(jié)構(gòu)的可能性，而且展示了納米系統(tǒng)與細(xì)胞表面蛋白相互作用的例子?，F(xiàn)在，我們回顧一下將納米裝置轉(zhuǎn)運(yùn)至哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的困難，并討論它們作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)裝置的工作。DNA納米結(jié)構(gòu)的細(xì)胞攝取毛成德等通過(guò)構(gòu)建了葉酸修飾的DNA納米管，靶向很多癌細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)的葉酸受體，成功證明DNA大結(jié)構(gòu)可以進(jìn)入細(xì)胞。他們進(jìn)一步在納米管上修飾熒光標(biāo)簽確認(rèn)納米管或者碎片是同過(guò)于受體結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞的（7）。Walsh等證明脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑存在

28、與否人類(lèi)胚腎細(xì)胞對(duì)DNA四面體的攝取效率幾乎一樣，并通過(guò)FRET證明被細(xì)胞攝取很長(zhǎng)時(shí)間后DNA四面體依然保持結(jié)構(gòu)完整（74）。Schuller等證明比DNA四面體大的DNA折紙結(jié)構(gòu)在無(wú)轉(zhuǎn)染試劑輔助下也能進(jìn)入細(xì)胞（75）。標(biāo)記于折紙上的熒光在內(nèi)化過(guò)程中可以示蹤折紙的攝取過(guò)程，但是無(wú)法證明折紙?jiān)诩?xì)胞內(nèi)是否完整。應(yīng)為DNA自身攜帶負(fù)電荷，然而令人驚奇的是在沒(méi)有轉(zhuǎn)染試劑的情況下細(xì)胞依然能攝取DNA納米結(jié)構(gòu)。梁樂(lè)等最近研究了DNA四面體細(xì)胞攝取機(jī)制，發(fā)現(xiàn)DNA四面體進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞是受體（特別是小窩蛋白）介導(dǎo)的內(nèi)吞。進(jìn)入細(xì)胞后DNA四面體沿著微管運(yùn)動(dòng)，最終在溶酶體內(nèi)聚集。為了證明DNA納米結(jié)構(gòu)能夠靶向細(xì)

29、胞內(nèi)的不同位置，梁樂(lè)等在DNA四面體上修飾核定位序列，并在細(xì)胞核內(nèi)成功檢測(cè)到它們（76）。雖然DNA納米結(jié)構(gòu)可以有效的進(jìn)入細(xì)胞，額外的修飾可以增強(qiáng)攝取效率或穩(wěn)定性。比如Mikkila等證明人類(lèi)胚腎細(xì)胞攝取病毒衣殼蛋白包裹方塊DNA折紙的效率是lipofectamine2000轉(zhuǎn)染的10倍（77）。Perrault和Shih構(gòu)建了包裹在雙層脂內(nèi)的DNA八面體。八面體通過(guò)與修飾了脂質(zhì)分子的DNA鏈雜交在表面形成脂鞘（78）。被包裹的八面體不僅免疫活性降低，而且在小鼠內(nèi)循環(huán)內(nèi)比位包裹脂質(zhì)的八面體表現(xiàn)出更好的生物利用度（Fig. 1b）。藥物轉(zhuǎn)運(yùn)CpG寡居脫氧核苷酸（ODNs）是可以刺激TLR9受體引

30、發(fā)強(qiáng)烈自身免疫的非甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤序列（79）。CpG ODNs是很好的治療藥物，因?yàn)榭梢酝耆ㄟ^(guò)雜交的方式將CpG直接連接至DNA納米結(jié)構(gòu)。Takakura和合作者構(gòu)建基于CpG的Y型DNA刺激免疫應(yīng)答（80，81）。他們發(fā)現(xiàn)與常見(jiàn)的單鏈或雙鏈DNA相比，Y型DNA更容易被巨噬細(xì)胞攝取，因此可以增強(qiáng)免疫刺激。之后的研究證明修飾多個(gè)CpG ODN的多臂結(jié)構(gòu)（82）、DNA四面體（83）、DNA折紙（75）可以被有效攝取并刺激免疫應(yīng)答。Chang和合作者以鏈霉親和素和CpG修飾DNA四面體構(gòu)建了合成疫苗（84）。鏈霉親和素模擬抗原，而CpG作為免疫佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答。這種結(jié)構(gòu)首先在小鼠類(lèi)

31、巨噬細(xì)胞細(xì)胞系內(nèi)驗(yàn)證，然后注射至小鼠體內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。注射了該種合成疫苗的小鼠比注射聯(lián)合親霉素與CpG混合物的小鼠表達(dá)更多的抗聯(lián)合親霉素IgG抗體。DOX是一種廣泛應(yīng)用于癌癥治療的細(xì)胞毒素類(lèi)藥物，DNA納米結(jié)構(gòu)也已被設(shè)計(jì)成DOX轉(zhuǎn)運(yùn)載體。之前已經(jīng)有工作證明納米顆粒包裹DOX可以降低副作用，同時(shí)有效增強(qiáng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間（85）。另外，DOX可以嵌入DNA，天生適合于DNA顆粒一起轉(zhuǎn)運(yùn)，這一思路首先出現(xiàn)于DNA適配體領(lǐng)域（58）。Chang等首次利用DNA納米結(jié)構(gòu)（特別是20面體線框）轉(zhuǎn)運(yùn)DOX至癌細(xì)胞（86）。Jiang等基于這一思路設(shè)計(jì)了三角和管狀DNA折紙轉(zhuǎn)運(yùn)DOX至胸腺癌細(xì)胞，折紙的大尺寸大大增加

32、了DOX的載帶量，而且該復(fù)合結(jié)構(gòu)不僅對(duì)常規(guī)的癌細(xì)胞有毒性，對(duì)DOX抗藥癌細(xì)胞也作用（87）。Kim等同樣發(fā)現(xiàn)DNA四面體載帶的DOX也能作用于其他的抗DOX細(xì)胞系（88）。Hogberg及合作者發(fā)現(xiàn)通過(guò)改變DNA納米管折紙的結(jié)構(gòu)扭轉(zhuǎn)角度可以調(diào)控DOX的載帶、轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放（89）。Zhu等利用類(lèi)似HCR的機(jī)制制備DNA聚合物來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)DOX（90）。這種聚合物可以通過(guò)適配體識(shí)別癌細(xì)胞，抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。Zhang等通過(guò)尾靜脈注射載帶DOX的三角折紙至腫瘤小鼠發(fā)現(xiàn)相比相同計(jì)量的游離DOX，基于折紙的DOX轉(zhuǎn)運(yùn)能更快的降低腫瘤的重量（91）。已經(jīng)有相關(guān)工作研究siRNA和ASO轉(zhuǎn)運(yùn)。Keum等在DN

33、A四面體的一條邊鏈上插入一段具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反義序列證明ASO可以通過(guò)RNase H介導(dǎo)的序列特異性靶標(biāo)mRNA降解降低蛋白表達(dá)量（92）。Lee等將siRNA和癌癥靶向序列雜交至DNA四面體，證明DNA四面體可以轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA至小鼠腫瘤（93）。他們證明在細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中，DNA四面體上siRNA數(shù)量及相對(duì)位置會(huì)影響攝取與基因沉默效率。耦合了siRNA和靶向序列的DNA四面體在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出高度的組織靶向性，大多聚集于腎臟和腫瘤，其它區(qū)域幾乎沒(méi)有。有一點(diǎn)需要說(shuō)明的是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外表征的四面體結(jié)合了不同數(shù)量的接合鏈。另外，文中并未提供DNA四面體在體內(nèi)穩(wěn)定性的相關(guān)數(shù)據(jù)，所以很難判定結(jié)構(gòu)在此種環(huán)境中

34、的結(jié)構(gòu)是否完整。最后，Weziman及合作者通過(guò)RCA制備長(zhǎng)單鏈構(gòu)建了周期性納米帶狀折紙。納米帶進(jìn)入細(xì)胞是通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的途徑。siRNA共價(jià)結(jié)合至納米帶后基因沉默效率高于兩者簡(jiǎn)單的混合（94）。這部分討論的工作證明了：DNA納米結(jié)構(gòu)可以作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)顆粒。DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)運(yùn)與其它納米顆?；蚓酆衔镛D(zhuǎn)運(yùn)方法的區(qū)別主要是DNA納米結(jié)構(gòu)的可設(shè)計(jì)行，以及可實(shí)現(xiàn)形狀和尺寸的高度均一性。Figure 4|哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的納米機(jī)器和邏輯門(mén)a,b, pH敏感的DNA納米裝置同時(shí)檢測(cè)弗林蛋白酶（Fu）和蛋白轉(zhuǎn)移酶（Tf）通路（97）。左：轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的DNA納米機(jī)器Tf-ITf受限于轉(zhuǎn)鐵蛋白通路。納米機(jī)器首先進(jìn)入分

35、類(lèi)內(nèi)體（SE），然后進(jìn)入循環(huán)內(nèi)體（RE），最后回到細(xì)胞膜。DNA納米機(jī)器Fu-IFu靶向弗林蛋白酶通路：首先進(jìn)入分類(lèi)內(nèi)體，然后進(jìn)入晚期內(nèi)體（LE），最后集中于反面高爾基體（TGN）。納米機(jī)器的熒光對(duì)不同內(nèi)體環(huán)境之間不同的pH敏感。右：DNA納米機(jī)器的pH敏感元件IFu（綠線，上部）和ITf（粉紅色線，底部）在低pH環(huán)境下呈現(xiàn)i構(gòu)型，熒光分子間發(fā)生FRET。 b，基于酶性DNA的與門(mén)在活細(xì)胞內(nèi)工作（113）。左：包含miR-21和miR-125b序列的合成輸入與邏輯與門(mén)一起顯微注射進(jìn)入細(xì)胞。右：反應(yīng)機(jī)制。輸入B首先結(jié)合至發(fā)卡（綠色部分），然后與輸入A作用將與門(mén)的兩個(gè)部件結(jié)合在一起。然后酶性DNA

36、剪切基質(zhì)，將熒光分子（紅點(diǎn)）從淬滅劑（黑點(diǎn)）附近釋放，發(fā)出熒光?；罴?xì)胞內(nèi)的DNA動(dòng)力學(xué)納米裝置這部分我們回顧在細(xì)胞內(nèi)工作、對(duì)特殊環(huán)境因素產(chǎn)生應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)核酸裝置，包括對(duì)pH等環(huán)境變化敏感的裝置。最近還有工作檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)特定信息的攜帶者RNA。最后，我們討論了核酸裝置的輸出對(duì)基因表達(dá)水平的調(diào)控，回顧了邏輯回路檢測(cè)和分析多分子標(biāo)簽的早期工作。細(xì)胞環(huán)境傳感酶性DNA和適配體等功能核酸已被作為生物傳感器，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)分子水平的檢測(cè)。在這里我們重點(diǎn)介紹兩個(gè)將功能核酸傳感器與DNA納米馬達(dá)或結(jié)構(gòu)相結(jié)合的工作。Pei等構(gòu)建了一系列具有一條或兩條邊鏈可重構(gòu)的DNA四面體，這些邊鏈會(huì)隨著溶液內(nèi)的質(zhì)子、ATP和

37、水銀等特定分子的信號(hào)變化而發(fā)生形變（95）。他們采用FRET報(bào)告策略實(shí)現(xiàn)了可形變的DNA四面體隨著細(xì)胞內(nèi)ATP濃度的變化而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變化。這證明將DNA納米結(jié)構(gòu)與細(xì)胞傳感器結(jié)合的可行性，這對(duì)潛在的智能藥物的載帶具有重要意義。Modi等通過(guò)相似的方法，利用DNA探針對(duì)活細(xì)胞內(nèi)體途徑各階段的pH進(jìn)行成像檢測(cè)（96）。他們借鑒Yuke的DNA鑷子設(shè)計(jì)，并以對(duì)pH敏感的i四聯(lián)體作為開(kāi)關(guān)來(lái)打開(kāi)和關(guān)閉DNA鑷子（Fig. 4a）。傳感器被飛蟲(chóng)血細(xì)胞內(nèi)吞后經(jīng)歷早期內(nèi)體（pH 6）和晚期內(nèi)體（pH 5.5），最終成為溶酶體（pH 5）。隨著內(nèi)體的酸性增強(qiáng)四聯(lián)體的熒光發(fā)生變化，從而間接的檢測(cè)pH。將傳感器與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋

38、白結(jié)合可以對(duì)特定受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)行成像。后續(xù)的研究中，該課題組證明pH敏感納米機(jī)器可以在同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)追蹤多個(gè)通路（97）。細(xì)胞RNA檢測(cè)細(xì)胞的種類(lèi)和健康狀況往往可以通過(guò)RNA水平反映出來(lái)，但是檢測(cè)處于細(xì)胞質(zhì)的mRNA和miRNA要求納米材料能夠進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。另外，很多RNA是低拷貝的，必須進(jìn)行信號(hào)放大。同時(shí)，RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和RNA結(jié)合蛋白也會(huì)降低某些探針序列與靶標(biāo)RNA的結(jié)合能力?；罴?xì)胞成像領(lǐng)域的很多相關(guān)問(wèn)題已經(jīng)被解決，同時(shí)發(fā)展了大量的可以在活細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)特定mRNA的核酸探針。用于增強(qiáng)活細(xì)胞成像探針的化學(xué)和結(jié)構(gòu)修飾方法也可以用于增強(qiáng)DNA納米裝置在細(xì)胞內(nèi)的表現(xiàn)。莖上同時(shí)標(biāo)記熒光分子和淬

39、滅劑的莖環(huán)式分子信標(biāo)可能是目前用于活細(xì)胞mRNA成像研究最多的探針（98）。當(dāng)探針處于游離狀態(tài)時(shí)，熒光處于淬滅狀態(tài)；而當(dāng)探針與靶標(biāo)mRNA雜交后，熒光轉(zhuǎn)換為發(fā)光狀態(tài)。在該設(shè)計(jì)為基礎(chǔ)可增強(qiáng)探針表現(xiàn)：加入更長(zhǎng)額RNA靶向序列或轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）序列會(huì)促進(jìn)探針從細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而促進(jìn)其與mRNA的相互作用（99-101）（Fig. 5a）?；瘜W(xué)修飾，特別是RNA 2甲氧基修飾被用與阻值細(xì)胞內(nèi)核酸酶的降解，增強(qiáng)探針的穩(wěn)定性（102）。類(lèi)似于上面描述的FISH技術(shù)，多探針共定位可以降低本底熒光的干擾（101）。通過(guò)鏈和親霉素將幾條寡聚核苷酸鏈連接在一起的MTRIP等多價(jià)探針也可以增強(qiáng)信號(hào)（103

40、）（Fig. 5b）.Mirkin與合作者設(shè)計(jì)的納耀斑結(jié)構(gòu)首次在活細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)了與RNA的鏈置換反應(yīng)（Fig. 5c）。納耀斑結(jié)構(gòu)以納米金為核心，外圍功能化修飾靶向mRNA或miRNA的DNA寡聚核苷酸鏈。較短的熒光標(biāo)記的鏈與納耀斑結(jié)構(gòu)上的DNA鏈雜交，由于熒光分子靠近納米金，所以處于被淬滅的狀態(tài)（104）。與靶標(biāo)結(jié)合后，短鏈被置換導(dǎo)致熒光信號(hào)增強(qiáng)。有一種修飾納耀斑結(jié)構(gòu)的技術(shù)是利用LNA修飾的短鏈來(lái)增強(qiáng)與靶標(biāo)RNA的結(jié)合能力，雖然同是會(huì)導(dǎo)致靶標(biāo)的降解（105，106）。Halo等進(jìn)一步證明納耀斑結(jié)構(gòu)與流失細(xì)胞技術(shù)結(jié)合可在全血環(huán)境中分選循環(huán)的獲得癌細(xì)胞（107）。調(diào)節(jié)細(xì)胞RNAASO、酶性核酸和s

41、iRNA等非編碼核酸基因調(diào)節(jié)技術(shù)的出現(xiàn)不僅使得在細(xì)胞內(nèi)設(shè)計(jì)DNA納米系統(tǒng)成為可能，也可以與DNA納米裝置結(jié)合調(diào)控細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。Afonin等證明可以自組裝成功能siRNA的兩種DNA:RNA復(fù)合物單獨(dú)存在細(xì)胞內(nèi)時(shí)是不能實(shí)現(xiàn)RNA干擾的（108）。反應(yīng)是從兩個(gè)復(fù)合物中處于單鏈狀態(tài)的延伸鏈間的雜交開(kāi)始，可能是通過(guò)四通鏈置換的方式進(jìn)行的（109）。在體外培養(yǎng)的細(xì)胞和異種移植的腫瘤鼠模型中檢測(cè)到了siRNA活性。如果這種調(diào)控的反饋可以檢測(cè)特定的分子信標(biāo)將會(huì)更加有趣。Benenson和同事首次在這一方向進(jìn)行研究，他們?cè)O(shè)計(jì)了能與細(xì)胞裂解液組分相互作用的核酸鏈置換回路（110）：當(dāng)需檢測(cè)的RNA加入裂解液后引

42、發(fā)鏈置換反應(yīng)，生成有功能的siRNA。Pierce與合作者證明在無(wú)細(xì)胞生化分析中形成可被Dicer酶切的RNA的更普遍的規(guī)律（111）。Yokobayashi與合作者構(gòu)建了遺傳編碼的RNA莖環(huán)系統(tǒng)作為RNA干擾通路的基底，通過(guò)合成的外源轉(zhuǎn)運(yùn)輸入的寡聚核苷酸鏈激活（112）。分子計(jì)算實(shí)現(xiàn)多輸入和多重分子回路是動(dòng)態(tài)DNA納米技術(shù)的一個(gè)重大的成就。相比基于合成基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的技術(shù)，DNA納米技術(shù)在實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)“生物計(jì)算”有什么優(yōu)勢(shì)？第一，DNA回路的組分的反應(yīng)機(jī)制簡(jiǎn)單，可在分子水平上進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，因此可以對(duì)反應(yīng)通路進(jìn)行高度的控制。第二，通過(guò)簡(jiǎn)單的序列改變就可以設(shè)計(jì)新的或正交的組分，很易實(shí)現(xiàn)模塊化的擴(kuò)大系

43、統(tǒng)規(guī)模。第三，與遺傳編碼蛋白組裝的系統(tǒng)相比，很多DNA裝置具有相對(duì)的小DNA足印。Shapiro課題組將酶性DNA邏輯與門(mén)和miRNA延伸的輸入一起顯微注射至胸腺癌細(xì)胞MCF-7中（113）（Fig. 4b）。為了防止核酸酶降解邏輯門(mén)，在3末端修飾額外的反向胸腺嘧啶。邏輯門(mén)的運(yùn)算通過(guò)熒光顯微鏡測(cè)定，熒光僅在兩種輸入同時(shí)存在的情況下才能增強(qiáng)，這與邏輯與門(mén)的模式一致。DNA鏈置換邏輯門(mén)最近也已經(jīng)被用于檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)的mRNA聚合物?；隗w外已經(jīng)證明的設(shè)計(jì)（27），Hemphill和Deiters利用DNA組件的邏輯與門(mén)在肝癌細(xì)胞Huh7中檢測(cè)內(nèi)源mRNA miR-122和miR-21（114）。邏輯

44、門(mén)是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染方式進(jìn)入細(xì)胞的，其僅在同時(shí)表達(dá)兩種輸入miRNA的細(xì)胞中才能激活。這部分所回顧的結(jié)果證明動(dòng)態(tài)DNA裝置的設(shè)計(jì)在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)信息、通過(guò)嵌入分子控制回路來(lái)分析信息以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的變化等方面有快速的進(jìn)步。Figure 5|活細(xì)胞內(nèi)mRNA成像a, 比率計(jì)生物分子信標(biāo)（101）。頂部：與靶標(biāo)mRNA的結(jié)合使得熒光分子（紅點(diǎn)）從淬滅劑（黑點(diǎn)）上釋放，從而發(fā)射高水平熒光。多個(gè)RBMB可以結(jié)合至異源mRNA 3UTR的串聯(lián)重復(fù)靶標(biāo)，可以呈現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)的單拷貝mRNA。參照染料是掌控分子信標(biāo)的轉(zhuǎn)運(yùn)在不同細(xì)胞間的差異。底部：RBMB和FISH探針對(duì)HT1080細(xì)胞內(nèi)相同mRNA的熒光成像。圖1：

45、FISH探針；圖2：RBMB報(bào)告染料；圖3：包含細(xì)胞核染色（藍(lán)色）的合并圖像。b, 多標(biāo)記四價(jià)RNA成像探針（MTRIPs）（103）。頂部：MTRIPs由多條熒光標(biāo)記的短鏈與鏈合青霉素（紫色）連接組成。通過(guò)設(shè)計(jì)可以使多個(gè)MTRIPs雜交至一條mRNA上，這樣就可以在活細(xì)胞內(nèi)對(duì)單條mRNA成像。底部：A549細(xì)胞內(nèi)的-actin mRNA共聚焦成像。圖1：MTRIPs；圖2：競(jìng)爭(zhēng)探針；圖3：包含細(xì)胞核染色（藍(lán)色）的合并圖像。c, 納耀斑結(jié)構(gòu)（104-107）。左：納耀斑結(jié)構(gòu)包含較長(zhǎng)的“捕獲鏈”和熒光標(biāo)記的“燃耗鏈”，熒光處于被納米金淬滅的狀態(tài)。當(dāng)靶標(biāo)mRNA與“捕獲鏈”結(jié)合，“燃耗鏈”被置換，

46、使得熒光增強(qiáng)。右：Hela細(xì)胞的熒光共聚焦成像，左側(cè)為對(duì)照納耀斑處理的細(xì)胞，右側(cè)為Survivin（靶標(biāo)mRNA）納耀斑處理的細(xì)胞。遺傳編碼的結(jié)構(gòu)和裝置從基因治療到代謝管理，都需要應(yīng)用植入來(lái)長(zhǎng)期控制基因表達(dá)?；罴?xì)胞內(nèi)通過(guò)遺傳編碼或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA和調(diào)控元素比瞬時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)的合成DNA系統(tǒng)更適合。要通過(guò)改進(jìn)將目前的DNA納米技術(shù)適于轉(zhuǎn)錄需要大量的實(shí)驗(yàn)方法調(diào)整和分子設(shè)計(jì)。雖然這看上去是很大的挑戰(zhàn)，但其實(shí)已經(jīng)有了較大的突破。轉(zhuǎn)錄RNA的出現(xiàn)使得納米技術(shù)與合成生物學(xué)的界限越來(lái)越模糊，我們?cè)谶@里強(qiáng)調(diào)幾個(gè)轉(zhuǎn)錄RNA相關(guān)的有趣工作?；跓o(wú)細(xì)胞RNA納米技術(shù)的二維和三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)五花八門(mén)，RNA能夠制備的結(jié)構(gòu)尺寸也在快速的變大（115-120）。比如Afonin等6條或者10條40bp左右的短鏈通過(guò)共轉(zhuǎn)錄和恒溫自組裝構(gòu)建RNA納米管（120）。最近，Geary，Rothemun