藥物小分子與血清白蛋白的相互作用

1、畢 業(yè) 設 計（綜述）藥物小分子與血清白蛋白的相互作用 申請學位： 學士學位 院 系： 藥 學 院 專 業(yè)： 藥 學 姓 名： 梅 艷 飛 學 號： 122120213 指導老師： 閆 苗 苗 二一三年六月一日目 錄摘要IAbstract II前言11 蛋白質與小分子物質2 1.1 蛋白質的定義及概述2 1.2 蛋白質的結構與功能2 1.3 血清白蛋白3 血清白蛋白的結構3 血清白蛋白的生理功能4 1.4 小分子物質52 藥物小分子與血清白蛋白相互作用的研究方法7 2.1 紫外可見吸收光譜(UV-Vis)法7 2.2 熒光光譜法7 2.3 圓二色光譜(CD)法9 2.4 傅里葉轉換紅外光譜(F

2、T-IR)法9 2.5 其他研究方法103 藥物小分子與血清白蛋白相互作用研究的主要內容11 3.1 結合常數(shù)和結合位點數(shù)的確定11 3.2 結合位點的確定12 3.3 作用力類型12 3.4 藥物小分子對蛋白質二級結構的影響134 研究意義及展望14參考文獻15致謝18 藥物小分子與血清白蛋白的相互作用 梅艷飛摘要:蛋白質是一切生物體內最基本的生命物質，在生物體內發(fā)揮著各種與生命活動有關的重要作用。蛋白質是遺傳性狀的直接表達者。因此，對蛋白質的各種研究是當前生命科學、醫(yī)藥學、化學等領域的前沿和熱點。蛋白質是藥物的一種非常重要的運輸載體。藥物與蛋白質的相互作用不僅影響藥物在體內的分布，而且還影

3、響藥物在體內的代謝與排泄方式，研究藥物與蛋白質的結合為藥物分子結構與藥效之間的關系提供了有利的信息?；谘芯可锎蠓肿优c藥物小分子相互作用的重要意義，本文對前人就這方面的研究成果進行了系統(tǒng)的總結，以期從中找出未來研究的突破口，從而進一步豐富生物大分子與藥物小分子相互作用的研究。關鍵詞：藥物小分子；血清白蛋白；相互作用；研究方法；研究內容The Interaction of Medicine Small Molecule with Serum AlbuminMEI Yan-feiAbstract: Protein is the basic composition of all organism,

4、 it plays impo- rtant roles in all kinds of life activities. Protein is the expresser of these genetic materials. So, there have been all interesting research field of life sciences, pharmacodynitics and chemistry of it. Protein serves as a trans- port carrier for drugs, the binding of drugs with pr

5、otein has a great influ- ence not only upon the distribution of the drugs in the body but also upon their patterns of metabolism and excretion. The studies on this aspect may provide information of the structural features that determine the therapeutic effectiveness of drug. On the basis of the prev

6、ious research, the predecess- ors had a system to its total nodes, but the role of polyamines in mechanism of the current review rarely, the former polyamine research achievements in this field are summarized, with a view to find polyamine future research br- each, so as to enrich the polyamine rese

7、arch.Key Words: medicinal molecules; serum albumin(SA); interactions; resea- rch methods; research content前 言生命的奧秘一直是人類孜孜探索的重大問題，從分子水平測定、表征和闡明在生命過程中起作用的各類小分子與生物大分子的相互作用，以及探究這些作用于生物功能之間的關系，其根本目的是探索生命過程的奧秘。蛋白質（protein）是由氨基酸組成的一類生物大分子，它與核酸等其他生物大分子共同構成生命的物質基礎。生物體內蛋白質的種類繁多，單細胞的大腸桿菌就含有3000余種。人體含蛋白質種類多達10萬

8、余種，是細胞中含量最豐富的高分子化合物。各種蛋白質都有其特定的結構和功能，在生命活動中發(fā)揮著不可替代的作用。對蛋白質與有機小分子的相互作用機理的研究，有助于考察蛋白質的結構和功能與有機小分子的結構和性質之間存在的相關性1。與生命相關的許多外源性小分子、離子等物質都需要通過和蛋白質的相互作用從而起到生物活性功能。研究藥物小分子與生物大分子的相互作用，有助于人們對藥物與生物大分子相互作用方式及其在體內作用機理的認識和理解，有助于人們進行療效更好、毒性更低的新藥設計和篩選2。藥物的吸收、分布、代謝及排泄等體內過程，直接影響到藥物在其作用部位的濃度和有效濃度的持續(xù)時間，從而決定著藥物的作用藥理作用和毒

9、性作用的發(fā)生、發(fā)展和消除。研究多種藥物與血漿蛋白(主要是白蛋白)的結合，是藥物動力學及臨床藥理學的重要內容3。國外對小分子與蛋白質相互作用的研究較早，國內化學工作者在這方面的研究也已有數(shù)十年的歷史4,5。近年來，隨著現(xiàn)代實驗手段的提高，人們采用多種方法從不同角度對藥物小分子和蛋白質之間的作用進行了廣泛的研究。現(xiàn)在常用手段包括熒光光譜、紫外-可見吸收光譜、圓二色光譜、傅里葉變換紅外光譜、電化學方法、激光拉曼光譜、平衡透析法、液相色譜法、X-晶體衍射等，質譜、核磁共振、毛細管電泳激光散射等方法的應用也日益增多。由于蛋白質溶液所處的環(huán)境和其體內環(huán)境存在一定的差別，無論用何種方法對他們之間的相互作用進

10、行研究，得到的僅僅是一種大致近似的結果，各種方法之間的合理搭配運用，從多方面多角度來研究同一反應體系，也可以得到更多、更詳細、更準確的信息。1 蛋白質與小分子物質1.1 蛋白質的定義及概述蛋白質是荷蘭科學家格里特在1838年發(fā)現(xiàn)的。他觀察到有生命的東西離開了蛋白質就不能生存。蛋白質是生命的物質基礎，沒有蛋白質就沒有生命。因此，它是與生命及與各種形式的生命活動緊密聯(lián)系在一起的物質。機體中的每一個細胞和所有重要組成部分都有蛋白質參與，蛋白質占人體重量的16.3，即一個60kg重的成年人其體內約有蛋白質9.8kg。人體內蛋白質的種類很多，性質、功能各異，但都是由20多種氨基酸按不同比例排列組合而成的

11、，并在體內不斷進行著代謝與更新。1.2 蛋白質的結構與功能蛋白質是由一條或多條多肽鏈通過各種組合形成的生物大分子。蛋白質的基本結構在三維空間中以非常專一的方式組織結合在一起，構成特定的三維結構，形成功能性蛋白質。蛋白質結構分為一級、二級、三級和四級結構(圖1)。一級結構是指蛋白質分子中氨基酸的排列順序。二級結構是指多肽主鏈原子的局部空間排列，不涉及氨基酸殘基側鏈的構象，包括-螺旋、-折疊、-轉角和無規(guī)則卷曲等主要形式。蛋白質的三級結構系指每一條多肽鏈內所有原子的空間排布，包括主鏈、側鏈構象內容，是在主鏈構象二級結構的基礎上，由于側鏈R基團相互作用，進一步折疊盤曲而成的。蛋白質的四級結構是指各個

12、亞基之間的空間排布及相互接觸的關系，結構可以相同，也可以不同。1973年，Rossman提出了超二級結構(supersecondaty structure)和結構域(struau- re domain)， 兩種新的概念目前已被生物化學家及分子生物學家所公認。蛋白質的三級結構的基本單位是結構域。結構域是指二級結構和結構模體以特定的方式組織連接，在蛋白質分子中形成兩個或多個在空間上可以明顯區(qū)分的三級折疊實體。蛋白質的三級結構是結構域在三維空間結構中以專一的方式組合排列，或者二級結構、結構模體及其與之相關聯(lián)的各種多肽鏈在空間中的進一步協(xié)同盤曲、折疊，形成包括主鏈、側鏈在內的專一排布。較大的蛋白質都有

13、多個區(qū)域存在，它們能夠以非常不同的方式組合，從而以有限類型的區(qū)域結構組合成極為復雜多樣的蛋白質整體結構。正是在結構域的基礎上，才有可能對蛋白質進行結構分類。結構域同時也是功能單位，不同的結構域常常與蛋白質的不同功能相關聯(lián)6。根據(jù)分子的組成，可將蛋白質分為簡單蛋白質和結合蛋白質兩大類。簡單蛋白質的分子完全由氨基酸構成，如淀粉酶、核糖核酸酶、胰島素等。結合蛋白質除了含蛋白質成分外，還含有非蛋白質成分(即輔基)，如血紅蛋白、核蛋白等。 圖1 蛋白質的四級結構圖 圖2 HSA的X-射線單晶衍射圖 蛋白質在生物過程中起著重要的作用，可以簡略概括：(1)作為有機體新陳代謝的催化劑酶：這是最重要的生物學功能

14、，幾乎所有的酶都是蛋白質。生物體內的各種化學反應幾乎都是在相應的酶參與下進行的；(2)作為有機體的結構成分：在高等動物里，膠原纖維是主要的細胞外結構蛋白，參與結締組織和骨骼作為身體的支架；(3)貯藏氨基酸；(4)運輸功能；(5)協(xié)調動作的功能；(6)激素的功能；(7)防御機能。1.3 血清白蛋白血清白蛋白的結構血清白蛋白是簡單蛋白質中的一種，它是血漿中最為豐富的蛋白質，它的濃度達到了40mg/ml(0.6mM)，占了血漿中所有蛋白總量的60，提供了80的血液滲透壓7，它能與許多內源及外源性化合物結合，從而起到重要的存儲和轉運作用8。人血清白蛋白(HSA)是由585個氨基酸殘基組成的單肽鏈蛋白質

15、，分子量約為66500。HAS肽鏈含有35個半胱氨酸殘基，僅34位有一個巰基，其余都為二硫鍵，二硫鍵中有8對組成交叉二硫鍵，只有接近N端的是一個單個二硫鍵，二硫鍵對維系蛋白質空間結構的穩(wěn)定性起著重要作用。HSA含有十八個酪氨酸殘基，在214位上含有一個色氨酸殘基。N端為天冬氨酸殘基，C端為亮氨酸殘基。1989年，Carterd小組發(fā)表了HSA的低分辨晶體結構9，并于1990年進行了一些修正10，而后，又于1992年發(fā)表了HSA的高分辨晶體結構11，從而最終揭開了這一生物大分子的真面目。正像以前的預測一樣，HSA分子包括三個結構上相似的功能域(domain ,)(圖2)，每個功能域又包含兩個相似

16、的螺旋結構的亞域(subdomain A和subdomain B)，六個亞域聚集在一起，形成了一個不對稱的心型分子。分子有約67的螺旋結構，其余則為轉角及伸展肽鏈。牛血清白蛋白(BSA)是由582個氨基酸殘基組成的單肽鏈蛋白質，其氨基酸序列與HSA非常類似8。BSA肽鏈也含有35個半胱氨酸殘基，僅34位有一個巰基，其余都為二硫鍵，二硫鍵中有8對組成交叉二硫鍵，只有接近N端的是一個單個二硫鍵。與HSA不同的是，BSA在134及212位各含有一個色氨酸殘基，因此兩者的熒光性質略有不同。另外，由于BSA與HSA的結構相似，二者的氨基酸序列高度相似，且不同氨基酸均為保守性替換，而BSA更價廉易得，故人

17、們常研究藥物-BSA的結合情況，作為對HSA結合情況的參考。血清白蛋白的生理功能血清白蛋白(SA)是血液緩沖系統(tǒng)的組分之一，具有營養(yǎng)作用，是維持血液滲透壓的主要組分和運輸內源性及外源性物質的重要載體8。 血液緩沖劑:與其它蛋白質一樣，SA也為兩性化合物。白蛋白等電點低于正常血液pH，是弱酸，一部分以酸的形式存在，另一部分與陽離子(主要是Na+)結合成弱酸鹽，這兩部分形成的緩沖離子對是構成血液總緩沖系統(tǒng)的一部分。 營養(yǎng)作用:在生命活動中，組成組織和器官的蛋白質不斷地進行新陳代謝，血漿蛋白質在體內分解產生的氨基酸可參與氨基酸代謝池，用于組織蛋白的合成；白蛋白對細胞營養(yǎng)具有較高的價值，滋養(yǎng)細胞的蛋白

18、質中約有1/3來自肝臟合成的白蛋白；此外，白蛋白還為細胞提供合成其它蛋白質的材料。 維持血漿膠體滲透壓和體液交換:正常人血漿滲透壓在37時，約為7.7個大氣壓。血漿中蛋白質濃度大于組織液，故具有較高的滲透壓，血漿與組織液滲透壓差稱為血漿的有效滲透壓，正常為15mmHg，它有從組織間隙吸收水分進入血循環(huán)的作用。在正常人體微循環(huán)中，血漿與組織液間不斷頻繁的交換液體及溶于水的營養(yǎng)物質和代謝產物，在新陳代謝中起重要作用。 運輸功能:SA是血漿蛋白質中具有廣泛結合能力的蛋白質。能結合內源性和外源性物質，能結合大、中、小分子的化合物，也能同難溶于水和溶于水的物質結合，具有重要的生理意義和臨床意義。白蛋白能

19、與許多化合物結合，可能與它的“構象適應性”有關。在生理條件下，白蛋白的結合部位易變，幾乎能以相同能量產生不同的構象。因為它螺旋內的維系力較弱，當與某化合物結合時，螺旋分開，肽鏈內殘基側鏈方位改變，導致基團的分布相應變化，新的結合位點隨之產生，發(fā)生構象變化和協(xié)同作用。白蛋白分子表面結構疏松，具有柔性，對其在血漿中作運輸和解毒劑極為有利。1.4 小分子物質在小分子與SA相互作用的研究中，國內外文獻報導涉及的小分子可做如下簡要分類：(1)按照來源區(qū)分，可分為內源性物質和外源性物質兩大類；(2)按照化學類別區(qū)分，可分為中性分子、離子；(3)按照功能區(qū)分，可分為食品營養(yǎng)成分及添加劑、藥物及制劑輔料、蛋白

20、質的變性劑以及測試探針試劑等。 內源性物質:內源物質是泛指生物體代謝的產物，其在生物體內(尤其是在血液循環(huán)系統(tǒng)中)的分布、貯存、轉運以及進一步的消化等過程都涉及到與SA相互作用。二十世紀四十年代前，人們認為SA只是參與維持血漿滲透壓，后來發(fā)現(xiàn)脂肪酸(fatty acid，F(xiàn)A)能夠與SA結合，從而認識到血液中脂肪酸氧化是一個全新的代謝活性源。FA-SA復合物的晶體結構研究表明，F(xiàn)A結合在由SA分子中極性支鏈覆蓋著的疏水空腔內。此外，氨基酸、膽紅素、尿素等各類內源物質與SA的相互作用也有廣泛報導。 外源性物質:外源性有機毒物與蛋白質相互作用的研究越來越多。有機毒性物質進入人體后，一部分和SA結合

21、，然后被轉運到其它組織部位釋放出來，產生危害作用。環(huán)境化學污染物與SA相互作用的研究對揭示環(huán)境化學污染物在體內蓄積、代謝及危害機理有重要意義。如農藥及殺蟲劑、毒劑與HSA的相互作用都已有報導。 金屬離子:無機離子廣泛存在于生物體內并積極參與著各種生命活動，尤其是各類內源和外源金屬離子廣泛參與甚至是調控著生命活動過程。各類無機離子與蛋白質的相互作用研究已經成為當今化學新興分支生物無機化學的主要內容12。根據(jù)目前文獻，與蛋白生物大分子作用的已研究的金屬離子可歸納為三類：一是作為營養(yǎng)物質的人體必須的微量元素，如鋅、銅、鐵；二是對生物體有毒副作用的重金屬離子如鎘、汞、鉛、鋁等；三是稀土金屬離子如銣、鑭

22、離子。研究重金屬離子(汞、鎘、鉻離子等)與蛋白的作用為揭示其危害機理及在生物體內的吸收、分布、蓄積和排泄過程等提供了重要信息。 染料:種類繁多、功能特異的光度顯色劑(染料)作為外源性物質與蛋白質分子相結合，形成染料蛋白質復合物，這些復合物又往往能夠在特定光波區(qū)域有特異性吸收或發(fā)射，可對蛋白質、DNA等生物大分子進行快速定量測定。但是到目前為止，蛋白質與普通染料分子間是否以化學計量定量結合、結合方式如何，形成復合物的種類是否單一等問題仍未解決，這些懸而未決的問題一方面制約了蛋白質分子快速定量方法的建立，同時也為該方向的深入研究提供了廣泛的空間。因此，關于染料小分子與蛋白質的相互作用研究也是目前所

23、關注的熱點之一。 表面活性劑:表面活性劑在食品、化工、制藥、化妝品和洗滌劑等領域廣泛應用。蛋白質與表面活性劑之間相互作用會顯著影響產品的質量，既可能在界面上發(fā)生競爭吸附，也可能由于締合作用導致蛋白質結構的變化13。如果表面活性劑進入人體，會刺激人體體重增加，提高肝臟合成膽固醇的速度。因此體外研究表面活性劑與蛋白質的相互作用對表面活性劑的環(huán)境效應具有十分重要的意義。目前，表面活性劑與蛋白質相互作用的研究主要集中在兩方面：一是探討相互作用的影響因素及結合等溫線的特性14；二是探討蛋白質結構的變化與相互作用的機理，以及這些變化對蛋白質功能的影響13。大多數(shù)研究是針對離子型表面活性劑，但最近考慮到非離

24、子型表面活性劑與蛋白質混合體系的性質對食品、醫(yī)藥和生物體系具有重要影響，人們對非離子表面活性劑與蛋白質相互作用的研究開始重視。 藥物:藥物自給藥部位進入體內后，通過各種生物膜從血液轉移到各組織器官。從現(xiàn)有的認識水平來看，藥物進入血液系統(tǒng)后不同程度地與SA結合，形成藥物-SA復合物。未結合的藥物才能通過毛細血管壁向組織擴散產生藥效，最終被肝臟代謝或被腎小管濾過排出體外。藥物-SA復合物可以看作是藥物在生物體內的暫時貯存形式，可有效避免藥物被迅速代謝而消除，從而維持血漿中血藥總濃度和有效濃度的持續(xù)。藥效的發(fā)揮直接與藥物的游離濃度相關，而生物體對藥物毒副作用的耐受也與游離藥物濃度直接相關，藥物-SA

25、結合也被看作是SA對生物體自我保護功能15的重要體現(xiàn)。所以，藥物-SA結合直接影響著藥物在生物體內的分布、貯存、轉運、藥效、藥物代謝以及毒副作用等方面的性質8。目前文獻報導涉及的藥物主要有抗癌藥物、抗菌素類藥物、鎮(zhèn)痛藥物、精神治療藥物、心血管類藥物等。一些藥物制劑的輔料、食品成分及添加劑與血清白蛋白相互作用研究也有報導。近年來關于傳統(tǒng)中藥有效成分甚至中藥總提取物與血清白蛋白相互作用已經引起國內外學界和業(yè)界的普遍關注。2 藥物小分子與血清白蛋白相互作用的研究方法近年來，人們采用多種現(xiàn)代實驗手段從不同角度對血清白蛋白與藥物小分子之間的作用進行了廣泛研究。目前常用的方法有：紫外可見吸收光譜法16,1

26、7、熒光光譜法18,19、圓二色光譜法20、傅里葉轉換紅外光譜法21、毛細管電泳法22、平衡透析法23、核磁共振波譜法24、微量熱法25-27、電化學法28等。2.1 紫外可見吸收光譜(UV-Vis)法蛋白質之所以能產生紫外可見光譜，其主要原因是組成蛋白質常見的20種-氨基酸中有幾種芳香族氨基酸殘基的側鏈基團和肽鍵對光的吸收，其中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸三個氨基酸殘基由于其生色團的不同有不同的吸收光譜，色氨酸和酪氨酸殘基中共軛雙鍵在280nm波長處有一個吸收峰，苯丙氨酸在257nm波長附近有一個特征吸收峰。一般來說，氨基酸殘基的微環(huán)境由蛋白質分子的構象決定，構象改變，微環(huán)境改變，生色團的紫外吸

27、收光譜隨之發(fā)生改變29。當血清白蛋白的生色團所處的微環(huán)境發(fā)生變化時，其紫外-可見吸收光譜也隨之發(fā)生變化：吸收峰紅移或藍移，吸光度及譜帶亦有變化。變化前后的光譜之差稱為差光，利用紫外差光譜可以獲得蛋白質的結構信息。一些小分子配體與蛋白質結合后其分子結構會發(fā)生一定的變化，相應的會出現(xiàn)一定大小的差光，UV-Vis光譜一般與熒光發(fā)射光譜互相補充，研究者通常結合熒光光譜法與紫外光譜法來研究蛋白質與藥物是否相互作用，也進一步用紫外差譜法來判斷配體對蛋白質內源熒光的猝滅是屬于靜態(tài)還是動態(tài)猝滅，這是由于動態(tài)猝滅影響到熒光體的激發(fā)態(tài)，而并不改變熒光物質的吸收光譜；靜態(tài)猝滅中靜態(tài)復合物的生成往往導致熒光物質吸收光

28、譜的改變。據(jù)此可研究蛋白質與小分子配體間的結合強弱和結合機理。2.2 熒光光譜法有些分子吸收一定波長的入射光，經過10-910-8秒，能發(fā)射較長波長的光，這種光就是熒光。能產生熒光的物質叫做熒光物質。熒光物質分子在吸收不同波長的入射光后，能發(fā)射不同波長的熒光，從而產生熒光光譜。蛋白質分子中因含有色氨酸殘基、酪氨酸殘基及苯丙氨酸殘基而具有內源性熒光，它們的熒光峰分別位于348 nm、303 nm和282 nm，不過蛋白質的熒光主要來自色氨酸殘基，其貢獻了大約95的蛋白質熒光。在激發(fā)波長為280 nm下可以近似的認為蛋白質的熒光全部來自色氨酸殘基和酪氨酸殘基，且絕大部分來自色氨酸殘基30。熒光光譜

29、法是目前研究小分子與生物大分子相互作用最常用的方法之一。在熒光光譜法中，又可以分為熒光猝滅法、熒光增強法、同步熒光法、三維熒光法、熒光偏振法等。熒光猝滅是指任何可以使得熒光物質熒光強度下降的作用，可分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，能降低熒光物質熒光強度的物質就稱為猝滅劑，因此猝滅劑是相對的。熒光增強主要是給體與受體之間發(fā)生了偶極偶極能量轉移，給體熒光被猝滅，受體熒光被敏化。一般來講，研究小分子與蛋白質相互作用，主要運用的是熒光猝滅法。根據(jù)蛋白質與小分子作用的熒光光譜，可以判斷出反應所屬的猝滅類型，對靜態(tài)猝滅來說，還可以計算出蛋白質與小分子的結合常數(shù)、結合位點數(shù)，以及小分子與蛋白質結合的能量轉移效率、結

30、合距離等。許多藥物都具有熒光，在加入蛋白質后藥物熒光會發(fā)生變化，還有一些藥物加入到蛋白質溶液中后會使蛋白質熒光增強或有新熒光峰出現(xiàn)，因此可以利用熒光增強來研究蛋白質分子與藥物的相互作用，這種方法的優(yōu)點是光譜干擾較小，可以避免熒光淬滅中自吸收效應以及內濾效應的干擾，所得光譜不需校正。同步熒光技術是同時掃描激發(fā)和發(fā)射兩個單色器波長，具有選擇性好、靈敏度高、干擾少等特點，故常被用來考察小分子對蛋白質構象的影響。當=60nm時所作出的同步熒光光譜只顯示色氨酸殘基的光譜特性，=15nm時所作出的同步熒光光譜僅顯示酪氨酸殘基的光譜特性31。色氨酸的最大熒光發(fā)射峰位對環(huán)境很敏感，所處環(huán)境的疏水性降低，其最大

31、發(fā)射波長紅移，所處環(huán)境的疏水性增強，其最大發(fā)射波長藍移。若色氨酸的最大發(fā)射波長改變，則說明蛋白質的構象發(fā)生了變化。三維熒光光譜是近20年來發(fā)展起來的熒光分析新技術32。它是以激發(fā)波長、發(fā)射波長和熒光強度為坐標的三維空間圖譜，同時可用強度等高線描述被測組分的分布和濃度，不僅可以提高測量靈敏度和對分子結構的選擇性，而且能夠更加全面地展現(xiàn)樣品的熒光信息，有利于綜合考查樣品的組分分布及構型變化特征。熒光偏振法是用偏振光激發(fā)熒光樣品，使得樣品發(fā)射偏振熒光。在溶劑粘度可以忽略的情況下，當激發(fā)光位于熒光分子主吸收帶且沒有發(fā)生分子間能量損失時，其偏振度與熒光分子的轉動速度有關，轉動速度越快，熒光偏振就越小，轉

32、動速度越慢，熒光偏振就越大。蛋白質分子的內源熒光團的壽命通常比較短，可利用外源熒光團來檢測熒光偏振。當外源熒光體分子與蛋白質結合時，其轉動受阻，導致小分子轉動速度變慢，熒光偏振會隨之變大。如果利用蛋白質的熒光來檢測偏振，蛋白質與小分子作用后，蛋白質的偏振度降低，說明蛋白質與小分子發(fā)生了結合作用。2.3 圓二色光譜(CD)法一束平面偏振光進入某些物質并通過該物質傳播時，若出射光的偏振面相對于入射光的偏振面旋轉了一定的角度，則稱這種物質為光學活性物質或“手性”物質。光活性物質的這種使平面偏振光偏振面產生旋轉的性質稱為光學活性。光活性物質除使入射并通過其傳播的平面偏振光的偏振面旋轉一定角度(稱之為旋

33、光)，還可能存在光吸收各向異性，即它對左旋圓偏振光和右旋圓偏振光吸收率不同，從而使平面偏振光變?yōu)闄E圓偏振光。光學物質將平面偏振光改變成橢圓偏振光的效應稱為“圓二色性”，并可用吸收系數(shù)差=L-R表示。如果在一定波長范圍內記錄下左旋和右旋偏振光的的連續(xù)變化并對波長作圖，就可以得到該物質的圓二色譜(circular dichroism，CD)。蛋白質具有多個手性中心分子。在蛋白質或多肽中，主要的光活性是肽鏈骨架中的肽鍵，芳香氨酸殘基及二硫鍵。蛋白質的CD光譜一般分為兩個波長范闈，即178-250nm為遠紫外區(qū)CD光譜，250-320 nm為近紫外區(qū)CD光譜。遠紫外區(qū)CD光譜反映肽鍵的圓二色性，即生物

34、大分子主鏈的構象信息，包括-螺旋：在205-235nm范圍內有雙負峰，峰項分別位于約208和222nm處，稱為雙槽曲線；-折疊：在216nm處有一負峰；無規(guī)則卷曲：200nm附近的負峰是其特征曲線33。近紫外圓二色譜作為一種靈敏的光譜探針，可反映蛋白質中二硫鍵、芳香氨基酸殘基微環(huán)境的變化。如二硫鍵在250-260nm有一個峰；色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸這三種殘基的三個側鏈的吸收峰在230-310nm之間。研究白蛋白主要用遠紫外圓二色光譜譜圖的變化。在蛋白質與配體相互作用時，通過CD光譜的變化，就可探知血清白蛋白的二級結構的構象變化。2.4 傅里葉轉換紅外光譜(FT-IR)法FT-IR法是指在紅外

35、波段(10000-10cm-1)的吸收光譜，它作為研究藥物與蛋白質相互作用的一種新方法，其突出的優(yōu)點是適用于不同狀態(tài)、不同濃度及不同環(huán)境中蛋白質和多肽的測定。FT-IR法的形成是以分子的振動為基礎，這些振動(包括化學鍵的伸縮、扭曲、旋轉等)能定位到分子中特殊的鍵和基團。與生物化學有關的鍵和基團主要包括C=O、-COOH、COO-、O-H、S-H等，許多振動模型并不是由單一鍵和基團的振動形成，而是由許多鄰近鍵的疊加而形成。FT-IR可以用于研究多肽和蛋白質分子的二級結構，能在不同條件下提供二級結構有價值的信息，因此在藥物-蛋白質的結合研究中應用較多。Xie等34利用FT-IR法對總三七皂甙(TP

36、NS)與HSA的相互作用進行了研究，認為TPNS-蛋白復合物造成了多肽鏈的氫鍵網絡的重排，最終導致了-螺旋結構的減少。Xie等35還利用FT-IR技術對黃烷酮化合物與HSA的相互作用進行了研究。2.5 其他研究方法在小分子物質與蛋白質相互作用的研究方法中，還有其他一些常用的方法，如毛細管電泳法(CE)、平衡透析法(ED)、核磁共振(NMR)、電化學法等。毛細管電泳(CE)是一類以毛細管為分離通道，以電場為驅動力驅動離子或荷電粒子，按其淌度或分配系數(shù)不同進行分離的一種新型液相分離分析技術。CE的不同形式包括親和毛細管電泳，毛細管親和凝膠電泳或利用蛋白質固定相的毛細管電色譜。它具有分離能力強、分離

37、速度快、應用范圍廣、消耗試劑量小等優(yōu)點。但由于需要解決生物大分子與管壁的吸附問題，限制了該方法的應用。平衡透析法(ED)是研究小分子與生物大分子結合平衡的經典方法，其工作原理是依靠半透膜將與生物大分子結合的小分子與游離的小分子分離。小分子與生物大分子形成的復合物被保留在透析袋內，而游離的小分子可以在半透膜內外自由穿過，直到半透膜內外的小分子濃度達到平衡。通過檢測小分子化合物的手段可以獲得小分子與生物大分子的結合強度。在諸多實驗方法中，ED法雖然操作復雜且費時，但因它可以直接得到游離小分子的濃度，從而被認為是較準確的方法。核磁共振(NMR)已經成為研究小分子和生物大分子相互作用的一種非常重要的手

38、段。在外磁場中，磁矩不為零的原子核吸收一定波長（0.6300m）的無線電波后而發(fā)生核自旋能級的躍遷現(xiàn)象稱為核磁共振。在配體與受體發(fā)生作用時，許多NMR參數(shù)將發(fā)生變化，這就是NMR能用于藥物與生物大分子相互作用研究的主要原因。NMR可用多種方法測定，如化學位移變化、線寬變化、轉移NOE及脈沖梯度場實驗等。這些方法可以分為檢測生物大分子信號和檢測配體信號。Sulkowaska等36研究了阿糖胞苷、阿斯匹林與牛血清白蛋白的相互作用，研究表明在阿斯匹林存在下可使阿糖胞苷與牛血清白蛋白的親和力減弱。電化學方法比較適用于一些吸收光譜比較弱，或由于其電子躍遷譜帶發(fā)生重疊而無法用紫外可見吸收光譜等方法來研究的

39、分子，尤其是對于一些主要通過靜電結合模式與DNA作用的分子。李紅等37采用循環(huán)伏安法、微分脈沖伏安法、交流阻抗數(shù)據(jù)擬合技術研究了Co(phen)33+配合物與DNA相互作用，確定作用方式為部分插入。趙潔等38用微分脈沖伏安法、UV-電化學法研究了紫杉醇對柔紅霉素與DAN作用的影響。3 藥物小分子與血清白蛋白相互作用研究的主要內容蛋白質與小分子物質作用后生成超分子復合物，體系中蛋白質或者小分子物質的濃度、光譜、電化學等性質發(fā)生改變，通過適當?shù)姆治龇椒?，測定作用前后不同參數(shù)的變化值，可以獲得結合常數(shù)、結合位點數(shù)、結合位點、作用力類型以及小分子對蛋白質二級結構的影響等信息。3.1 結合常數(shù)和結合位點

40、數(shù)的確定確定小分子與生物大分子之間相互作用的結合常數(shù)與結合位點數(shù)，常用的有以下幾種方法：1. Scatchdrd方程Scatchdrd等39將小分子配體與大分子結合看作是小分子配體與大分子特定部位的結合，在此基礎上推導了溶液平衡處理的經典理論公式即Scatchdrd方程，其具體形式為： r/cf = nK-rK (1)式中，r為每個蛋白質分子鍵合的藥物分子的個數(shù)，cf游離藥物的濃度，n為結合位數(shù)，K為結合常數(shù)。以r/cf對r作圖，可得到n、K的值。若反應存在多種結合部位，上式變?yōu)椋?r =ni Ki cf /(1+Ki cf) (2)通過非線性擬合，可計算n、K，n、K分別表示結合位數(shù)和第i的

41、結合常數(shù)。Seatehard作圖法是研究生物大分子與有機小分子結合反應的經典方法。此法在應用時須知道反應體系中游離態(tài)藥物的濃度，這一點用熒光法測定時常不易做到，而且Seatehard作圖法所得結果往往不理想，因此，在研究藥物分子與蛋白質的結合反應中，Seatchard作圖法應用不多。2. Stern-Volmer方程39當猝滅劑分子與血清白蛋白結合時，血清白蛋白的內源性熒光會因猝滅分子濃度的增加發(fā)生有規(guī)律的猝滅，對于動態(tài)猝滅，可根據(jù)Stern-Volmer方程來加以計算出猝滅常數(shù)： F0F = l+Kq 0 Cq = l + Ksv Cq (3)式中F0是不加猝滅劑時血清白蛋白的熒光強度，F(xiàn)為

42、當加入的猝滅劑濃度為Cq時血清白蛋白的熒光強度，Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù)，0為猝滅劑不存在時熒光分子的平均壽命，Cq為猝滅劑濃度，Ksv為猝滅常數(shù)。對于靜態(tài)猝滅，當血清白蛋白與小分子發(fā)生l：l的結合時，可以推導出公式： F0 /( F0- F ) = 1/Q f K+1/ f (4)式中F0為不存在猝滅劑時的熒光強度，F(xiàn)0-F為加入猝滅劑后熒光強度的變化，K為結合常數(shù)，Q為猝滅劑濃度，f為熒光體的熒光被猝滅的分數(shù)。以F0 / ( F0-F )對Q-1作圖，得直線的斜率為(f K )-1，截距為1/ f ，因此可以求得結合常數(shù)K。3. Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程40 1/(F0

43、- F) = 1/F0 + 1/ K F0Q (5)式中，F(xiàn)和F0分別為存在和不存在猝滅劑時的熒光強度，K為結合常數(shù)，Q代表猝滅劑濃度。該式只能計算出結合常數(shù)而無法得到結合位點數(shù)，而且該方程僅適用于只有一個結合位點的體系。對于多結合位點的情況，張勇41等提出了一個求取結合位點數(shù)的線性回歸公式： lg(F0- F) / F = lgK + nlgQ (6)3.2 結合位點的確定目前確定結合部位的方法有：(1)將蛋白質分割為片段。蛋白質可以被某些特殊試劑分割為不同的片斷，根據(jù)各藥物與片斷作用情況來確定藥物的結合部位。但是蛋白質分割為小片段后，它的構象將發(fā)生變化，藥物與蛋白質的作用也會改變，使其應用

44、受到局限。(2)用具有特定己知結合部位的探針與藥物發(fā)生置換作用。某些熒光探針對蛋白質不同區(qū)域有特異性的結合，根據(jù)藥物加入后對熒光探針的影響可以確定藥物的結合部位。(3)對蛋白質上的氨基酸殘基進行修飾。將某種氨基酸殘基進行修飾后，再與藥物進行作用，比較修飾前后的變化就可以判斷出這種氨基酸在藥物與蛋白相互作用中起多大作用，藥物是否結合在這種氨基酸的周圍等信息。3.3 作用力類型小分子和蛋白質等生物大分子常常借助于疏水作用力、靜電引力、氫鍵、立體排斥力和范德華力等42結合形成超分子復合物。利用van，t Hoff方程可以計算反應的焓變H和熵變S，進而得到不同溫度下反應的自由能G。根據(jù)作用前后的熱力學

45、常數(shù)，可以判斷藥物與蛋白質之間的主要作用力類型。 lgK=-H/2.303RT +S/2.303 (7) G= H-TS (8)在溫度變化不大時，反應的焓變H可以看作是一個常數(shù)。以lgK對1/T作圖，由直線的斜率和截距即可得到反應的焓變H和熵變S，然后再根據(jù)(8)式即可求得反應的自由能G。根據(jù)熱力學常數(shù)與作用力的關系，當反應的焓變H>0，熵變S<0時，分子之間的相互作用力來自于靜電作用和疏水作用力；反應的焓變H<0，熵變S<0時，分子的作用力可能來自于范德華力、氫鍵或質子化等作用力；H=0，S>0，可能為疏水作用力；H <0，S >0，可能為靜電引力。

46、但是血清白蛋白結構很復雜，它和小分子之間通常并不是某一種作用力的單獨作用，而是多種作用力的協(xié)同作用。3.4 藥物小分子對蛋白質二級結構的影響當血清白蛋白與小分子作用后，其空間構象尤其是蛋白質的二級結構很可能會發(fā)生改變，從而改變蛋白質的某些特定活性功能43。定性定量地測定蛋白質空間構象的變化是研究小分子與蛋白質相互作用的重要內容。研究血清白蛋白結構的變化，一般可用紫外光譜法、同步熒光法、圓二色譜法、紅外光譜法或核磁共振來加以考察。紫外和熒光光譜只能定性的描述；圓二色譜可以定量測定但只能應用在很窄濃度范圍內的澄清的溶液中：紅外光譜對樣品的要求雖然不高，但水汽的干擾以及譜圖的處理方法誤差也很難避免：

47、核磁共振需要復雜的計算及費用高昂等缺點。利用同步熒光光譜可以了解藥物分子對蛋白質構象的影響，由=60nm和=15nm所作出的同步熒光光譜分別顯示的是色氨酸殘基和酪氨酸殘基的光譜特性。因氨基酸殘基的最大吸收波長與其所處環(huán)境的極性有關，因此由發(fā)射波長的改變可以判斷蛋白質構象的變化。發(fā)射波長紅移表明氨基酸所處環(huán)境的極性增強，藍移則疏水性增強。4 研究意義及展望藥物分子與蛋白質相互作用的研究是介于化學、生命科學與醫(yī)藥學之間的邊緣性課題，也是化學、生命科學和醫(yī)藥學等學科研究領域中最為活躍的前沿和熱點之一。蛋白質是生物體內具有重要生理功能的大分子，是藥物發(fā)揮藥效的重要載體和靶分子。血清白蛋白是血漿中的一種

48、含量豐富的蛋白質，是藥物的傳輸載體，它具有內源熒光，能與許多內源性和外源性化合物相結合，起到存儲和轉運作用，長期以來一直被作為一種蛋白模型用于研究小分子與蛋白的相互作用及蛋白的空間構象。血清白蛋白與藥物分子的結合作用是藥物動力學、藥物藥效學及藥物毒理學中的重要內容。當藥物分子進入生物體后，通過血漿的貯存和運輸，到達受體部位，進而發(fā)生藥理作用。因此，研究具有藥理活性的小分子與蛋白質的相互作用及作用機制，對于理解藥物發(fā)揮藥效的作用機制，揭示藥物藥效的實質內涵及新藥設計與開發(fā)等具有重要意義。隨著分子生物學和生物物理學的不斷發(fā)展，研究小分子與大分子的方法也不斷推陳出新，這些技術和方法相互結合或聯(lián)用，可

49、以揚長避短，為深入了解配體與受體的相互作用機理，靶蛋白的生理功能以及新藥研發(fā)提供了理論基礎，為發(fā)現(xiàn)更多的與疾病有關的藥物靶點和小分子先導化合物提供了新的研究方法和策略。參考文獻：1 Hsiang YH,Hertzberg R,Hecht S. Campotothecin induces protein.1inke DNA breaks via mam- malian DNA topoisomerase IJ.Chen.,1985,260(27):873-878.2 趙立平.基因與生命的本質M,太原:山西科學技術出版社,2000:34-36.3 HA.Scheidta,A.Pampelb,L.N

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