免疫組化技術(shù)在婦科的臨床應(yīng)用

1、免疫組化技術(shù)在婦科的臨床應(yīng)用免疫組化的基本原理免疫組化是免疫組織化學(xué)技術(shù)的簡稱。 它是應(yīng)用抗原、 抗體特異性結(jié)合的原理， 使用已知的抗體在病理切片上與相應(yīng)的抗原結(jié)合， 然后把結(jié)合產(chǎn)物應(yīng)用組織化學(xué)的方法顯現(xiàn)出來， 使之可以在顯微鏡下觀察得以確認(rèn)。 通常使用的顯色劑為聯(lián)苯胺， 結(jié)合的抗體顯示為棕色顆粒，所以把免疫組化成為“棕色革命” 。組成人體細(xì)胞分為若干種， 如： 上皮細(xì)胞、 神經(jīng)細(xì)胞、 肌肉細(xì)胞、血細(xì)胞等， 每種細(xì)胞都有其特殊的結(jié)構(gòu)物質(zhì)， 每種細(xì)胞都有其特異功能，每種功能又有其物質(zhì)基礎(chǔ)。如：鱗狀上皮細(xì)胞通過角化物可以防止機(jī)體水份的蒸發(fā)和外界病原體的侵入， 肌肉可以通過肌動蛋白使自己收縮。 突觸

2、素可以傳導(dǎo)神經(jīng)興奮， 某些器官借以實現(xiàn)其功能的激素受體， 載有遺傳物質(zhì)的 DNA 全段基因等。 現(xiàn)在人們都可以把這些物質(zhì)純凈的分離出來， 并把它們作為抗原免疫大鼠和家兔， 使之產(chǎn)生相應(yīng)的抗體， 人們再把每種抗體分離純化， 就得到我們免疫組化應(yīng)用的抗體。我們把這些抗體作用于病理切片，然后再通過染色，如果切片上有這種抗體對應(yīng)的抗原， 就會在切片上出現(xiàn)棕色顆粒， 如果沒有棕色顆粒，就說明沒有這種抗體的抗原，在顯微鏡下就一目了然。免疫組化標(biāo)記在婦科腫瘤的應(yīng)用及其意義免疫組化以它的特異性和敏感性， 結(jié)合組織學(xué)上的定位性已成為多種腫瘤病理形態(tài)學(xué)診斷的新手段。 這里需要說明的是雖然目前具有診斷價值的腫瘤標(biāo)記

3、物有數(shù)百種之多， 但至今還沒有發(fā)現(xiàn)人體腫瘤的特異性抗原，也就是說還沒有任何一種抗體能100 地確診一種腫瘤。盡管如此， 人們正是得到了一些與腫瘤相關(guān)的抗原， 存在于腫瘤細(xì)胞的胞核、胞漿和胞膜上，它的存在或量變可以提高腫瘤的性質(zhì)，借以了解腫瘤的組織發(fā)生，細(xì)胞分化、細(xì)胞功能，以有助于腫瘤的診斷，鑒別診斷、分類，判斷預(yù)后和指導(dǎo)臨床治療。目前具有診斷價值的腫瘤標(biāo)記物雖已有數(shù)百種，但在臨床病理診斷常用的有 50 余種，其標(biāo)記物有以下類型：一、腫瘤相關(guān)抗原這種抗原只存在腫瘤組織中， 正常組織內(nèi)沒有或含量甚微。 或其為幾種類型腫瘤所共有，故又稱為腫瘤群體抗原，對判斷腫瘤的良、惡性和起源均有一定幫助CA125

4、對卵巢上皮性腫瘤都有一定的表達(dá)，但主要對漿液性腫瘤陽性表達(dá)，卵巢粘液性腺癌CA125 不表達(dá)?？梢杂糜谶@兩種腫瘤的鑒別診斷。 CA125 對子宮內(nèi)膜樣腫瘤透明細(xì)胞癌， 未分化癌上皮成份也是陽性表達(dá)。CEA 癌胚抗原廣泛存在于各種上皮性腫瘤， 大多數(shù)卵巢漿液性腫瘤不表達(dá)， 而卵巢粘液性腫瘤表達(dá)，在子宮內(nèi)膜樣腺癌，透明細(xì)胞癌，勃勒納氏瘤CEA 都有不同程度的表達(dá)， 在胃腸道惡性腫瘤中 CEA 也為陽性表達(dá)，所以卵巢庫肯勃氏瘤CEA 也是陽性表達(dá)。AFP 甲胎蛋白是胚胎卵黃囊細(xì)胞， 胚胎肝細(xì)胞和胎兒腸道細(xì)胞合成的一種糖蛋白，主要用于肝癌的診斷，在卵巢內(nèi)胚竇瘤、胚胎性癌，惡性畸胎瘤都為陽性表達(dá)。二、細(xì)

5、胞結(jié)構(gòu)抗原這種抗原可存在于正常組織和腫瘤組織中， 為某些組織細(xì)胞群所特有，對判斷腫瘤起源有重要意義CK7:主要標(biāo)記腺上皮和移行上皮。卵巢、肺、乳腺上皮 CK7 陽性表達(dá)。而結(jié)腸，前列腺和胃腸道上皮CK7 陰性表達(dá)?？捎糜诼殉舶┡c胃腸道癌的鑒別診斷。CK20:主要標(biāo)記胃腸道上皮、 尿道上皮。 卵巢粘液性囊腺癌CK20 為陽性表達(dá)。子宮內(nèi)膜腺癌、宮頸鱗癌、乳腺癌、肺癌和卵巢非粘液性腫瘤 CK20 均不表達(dá)。desmin 結(jié)蛋白為中間絲蛋白之一，分布于正常平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和 肌上皮細(xì)胞及其腫瘤中。結(jié)蛋白在良性肌源性腫瘤是強(qiáng)陽性表達(dá)，而在平滑肌肉瘤中表達(dá)率僅為 50 ，另外在平滑肌瘤中

6、結(jié)蛋白與波形蛋白 Vimentin （是表達(dá)間葉組織來源的腫瘤，上皮來源腫瘤不含此蛋白，用于癌與肉瘤的鑒別，惡黑與癌的鑒別等）的表達(dá)呈反向關(guān)系， 分化越好結(jié)蛋白陽性反應(yīng)越強(qiáng)， 波形蛋白陽性反應(yīng)弱或陰性； 反之， 分化越差， 結(jié)蛋白反應(yīng)弱或陰性， 而波形蛋白反應(yīng)越強(qiáng)。另外含有肌源成份的癌肉瘤， 惡性中胚葉混合瘤， 畸胎瘤中也存在結(jié)蛋白S-100是一種可溶性酸性蛋白，主要存在于神經(jīng)組織、垂體、唾液腺等組織，是神經(jīng)性腫瘤的主要標(biāo)記。在惡黑及脂肪肉瘤為陽性表達(dá)SMA 肌動蛋白是一種標(biāo)記平滑肌瘤的蛋白， 主要用于診斷平滑肌瘤、 血管平滑肌瘤， 平滑肌肉瘤以及肌上皮細(xì)胞。 在乳腺腫瘤中以此抗體檢測導(dǎo)管上皮

7、肌上皮細(xì)胞陽性與否來判斷乳腺腫瘤的良、惡性。三、 可用于某些生殖細(xì)胞來源的腫瘤和妊娠有關(guān)的腫瘤的診斷， 常用的有：內(nèi)分泌激素及其受體抗原包括肽類激素和類固醇激素兩種，以肽類激素抗原應(yīng)用較多，常用有胰島素、高血糖素、胃泌素、生長抑素、降鈣素等。類固醇激素有雌激素、孕酮、睪酮等。但此類激素在組織切片中保留困難， 且在組織內(nèi)有多種結(jié)構(gòu)類似的激素前體， 不僅染色效果不好，且難以正確判斷。所以多檢測其激素受體。如： ER （雌激素受體）、PR （孕激素受體）四、腫瘤中病毒抗原HPV （人乳頭狀瘤病毒）特別是HPV16、18是宮頸癌主要致病病毒，亦可用于頭頸部癌、前列腺癌和食管癌的研究HIV （人類免疫缺

8、陷病毒）即艾滋病病毒，表達(dá)于淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、濾泡樹突狀細(xì)胞和 HIV 感染的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，主要用于艾滋病的研究.另外還有HSV （單純性皰疹病毒等）五、作為判斷預(yù)后的標(biāo)記抗體C-erbB-2是一種癌基因蛋白質(zhì)， 存在于細(xì)胞膜上， 該蛋白可加速細(xì)胞的運(yùn)動，參與細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)。在乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、 胃癌陽性表達(dá)提示預(yù)后差。 特別是乳腺癌陽性表達(dá)具有獨特的預(yù)后價值，陽性表達(dá)者復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率高，無瘤生存期及總生存期短。宮頸腺癌 C-erbB-2 陽性表達(dá)者盆腔淋巴轉(zhuǎn)移率和宮頸深肌層侵犯率高于陰性組。P53 （腫瘤抑制基因）P53 蛋白也是現(xiàn)代分子生物學(xué)中研究最多的蛋白

9、質(zhì)之一，P53 蛋白除具有細(xì)胞生長阻滯作用外， 同時還參與細(xì)胞DNA 的損傷與修復(fù)、細(xì)胞生長與分化、誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的過程，目前認(rèn)為 P53 是生命科學(xué)領(lǐng)域中最重要的蛋白質(zhì)分子。P53 是腫瘤抑制因子， 但由于失活、 突變使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，這在許多惡性腫瘤中可以見到 P53 基因的突變，特別是結(jié)腸癌、直腸癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、宮體癌、食道癌、胃癌、肝癌、乳腺癌及膀胱癌尤為常見。另外對骨肉瘤、軟組織肉瘤、淋巴瘤及白血病等惡性腫瘤細(xì)胞中也可見到。研究證明， P53 突變與腫瘤大小正相關(guān)，與分化程度、病人的總生存期和無瘤生存期呈負(fù)相關(guān)。 P53 突變腫瘤復(fù)發(fā)率和死亡率明顯高于陽性者。且P53 突變

10、與腫瘤血管侵襲呈明顯相關(guān)。在多種惡性腫瘤中突變性P53 蛋白表達(dá)水平升高， 用免疫組化可以檢測到，所以我們?nèi)砸?P53 陽性表達(dá)來預(yù)測患者的預(yù)后、術(shù)后易復(fù)發(fā)等指標(biāo)。P53 陽性表達(dá)與癌前病變的關(guān)系也極為密切， 在宮頸和食管非典型增生中均可檢測出 P53 蛋白。PCNA （增殖細(xì)胞核抗原）是一種僅在增殖細(xì)胞中合成或表達(dá)的核內(nèi)多肽。 PCNA 陽性表達(dá)與細(xì)胞增殖活性有關(guān)， 可做為細(xì)胞增殖狀態(tài)的一個重要指標(biāo)。 在惡性腫瘤中 PCNA 陽性表達(dá)提示有腫瘤浸潤、 轉(zhuǎn)移和臨床預(yù)后不佳。Ki-67是一種與細(xì)胞增殖有關(guān)的核抗原，位于胞核中。 Ki-67 增殖指數(shù)高低即陽性表達(dá)與許多腫瘤的分化程度、 浸潤、 轉(zhuǎn)

11、移及預(yù)后密切相關(guān)，因此被廣泛做為各種惡性腫瘤必檢項目之一。ER、 PR是乳腺癌、子宮內(nèi)膜腺癌、宮頸癌、卵巢癌等必檢項目之一。ER、 PR 陽性與否與病人術(shù)后化療方案的選擇和內(nèi)分泌治療以至于腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后都密切相關(guān)。ER、 PR 陽性者，內(nèi)分泌、化療治療效果好，復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率少，緩解期長，生存率高。六、腫瘤多耐藥基因在臨床腫瘤治療中，經(jīng)常有這樣的情況：同一種腫瘤，使用同一個治療方案，或同一個病人，化療之初和化療后期，其效果迥異。這種情況決定性原因是腫瘤細(xì)胞內(nèi)是否存在或產(chǎn)生了多耐藥性。 多耐藥性基因編碼蛋白可以把化療藥從細(xì)胞內(nèi)泵到細(xì)胞外， 從而避免了化療藥對細(xì)胞的破壞。研究表明， 癌細(xì)胞有六

12、種耐藥途徑， 通俗點說： 化療藥物要制服、殺滅癌細(xì)胞，而癌細(xì)胞有強(qiáng)大對抗辦法，使化療藥物奈何不了它，這樣，癌細(xì)胞仍可肆無忌彈地增生，最后達(dá)到危及健康與生命的目的。所以每一位化療病人在治療前都應(yīng)該檢查腫瘤的耐藥性，如果陽性，可以使用逆轉(zhuǎn)劑，提高腫瘤細(xì)胞對化療物的敏感性Pg 糖蛋白它是多耐藥基因產(chǎn)物，作用“藥泵”功能，引起癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥。容易產(chǎn)生耐藥抗藥藥物主要有長春新堿、長春花堿、阿霉素、柔紅霉素、 表阿霉素、 米托蒽醌、 紫杉醇、 VP16 等。 陽性表達(dá) （+ ）以上有意義， 對腫瘤病人選擇化療方案和愈后判斷具有重要的臨床意義。MRP3多耐藥相關(guān)蛋白，主要用于非 Pg 糖蛋白腫瘤細(xì)胞系的腫瘤

13、耐藥性的研究。容易產(chǎn)生耐藥的抗藥藥物主要有阿霉素、柔紅霉素、表阿霉素、長春新堿、長春花堿、 VP16 。常見婦科腫瘤免疫組化檢測應(yīng)用舉例日常工作中根據(jù)每位病人，不同腫瘤類型從診斷、鑒別診斷、探討組織來源、 內(nèi)分泌治療及化療前腫瘤多耐藥基因及病人的愈后等多方面選擇一組免疫組化抗體以達(dá)到輔助診斷的目的。子宮內(nèi)膜腺癌ER、PR、Ki-67、P53（漿液性乳頭狀腺癌過表達(dá)）、PCNA、PTEN、 MRP3 、 Pg 糖蛋白PTEN 是一種腫瘤抑制基因，在維持細(xì)胞增殖、分化和調(diào)亡平衡起著重要作用， 該基因在許多腫瘤表現(xiàn)突變和丟失。 子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生一部分是與持續(xù)與過多雌激素有關(guān)， 病人有不排卵、 不孕

14、及子宮內(nèi)膜增生過長的病史。 PTEN 常為陽性表達(dá)，提示預(yù)后較好。有些內(nèi)膜癌患者無雌激素增高，有正常排卵，卵巢功能正常。很多絕經(jīng)多年的老年婦女，癌周內(nèi)膜多顯萎縮，說明無雌激素影響，這種內(nèi)膜腺癌發(fā)生機(jī)制尚不清楚， PTEN 的陰性表達(dá)提示腫瘤惡性程度高，預(yù)后差。子宮平滑肌肉瘤SMA 、 P53、 結(jié)蛋白、 波形蛋白、 PCNA、 CD10、 Ki-67 、MRP3 、 Pg 糖蛋白。子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤ER、PR、CD10 、波形蛋白、desmin 、SMA 、P53、Ki-67 、 MRP3 、Pg 糖蛋白宮頸浸潤性鱗癌廣譜 CK、 P16、 HPV16 、 P53、 Ki-67 、 MRP3 P

15、g 糖蛋白。P16 是一種重要的抑癌基因，當(dāng) P16 基因突變和丟失時細(xì)胞增殖失控使細(xì)胞無限制增殖而發(fā)生腫瘤。 在宮頸上皮內(nèi)瘤變及癌的發(fā)生是以 P16 陽性表達(dá)為特征，這與宮頸上皮內(nèi)瘤變與宮頸癌是由 HPV感染所造成細(xì)胞不死性有關(guān)。宮頸鱗形細(xì)胞原位癌及早期浸潤除以上幾項外再加IV 型膠原蛋白、 層粘蛋白卵巢漿液性腺癌CA125 、 EMA 、 CEA、 P53、 Ki67、 MRP3 、 Pg 糖蛋白卵巢粘液性腺癌CK7、 CK20、 CEA、 EMA、 CA125 、 S-100 、 P53、 Ki-67 、 MRP3 、Pg 糖蛋白卵巢卵泡膜細(xì)胞瘤Vimentin(+)( 但無法與纖維瘤區(qū)

16、別 ) 因瘤細(xì)胞漿內(nèi)含類脂質(zhì)，用脂肪染色可證實乳腺浸潤性癌ER、 PR、 SMA、 P63、 E-ca、 P53、 Ki-67 、 C-erbB-2 、 MRP3 、Pg-糖蛋白惡黑S-100 ， HMB-45 ， NSE免疫組化染色是通過一系列環(huán)節(jié)及過程。 包括組織的固定， 脫水，包埋，切片，各種抗體合理的稀釋度，孵育時間及溫度，各種有關(guān)溶液的濃度和 PH 值等等，使抗體抗原更好保存并有效地結(jié)合，再通過顯色液顯現(xiàn)出來， 最后用蘇木素襯染， 每一步驟和環(huán)節(jié)都必須認(rèn)真處理，一步差錯全部失敗。常用的方法有S-P 法、 PAP 法， ABC 法。 目前常用的是S-P 法，即鏈酶菌抗生物素蛋白 - 過

17、氧化物法。此法可產(chǎn)生低背景，高放大效果，更加簡便敏感和特異。在完成免疫酶標(biāo)記全過程后， 對于如何判斷標(biāo)記的結(jié)果作出正確的診斷是非常重要的首先需要對本病例的石蠟切片， HE 染色的切片有一個診斷意見，再次須掌握切片的主要病變區(qū)和細(xì)胞形態(tài)的特點， 因為它是免疫組化標(biāo)記的“靶細(xì)胞” ，應(yīng)根據(jù)“靶細(xì)胞”標(biāo)記結(jié)果判斷其性質(zhì)。在染色過程中，某些組織和細(xì)胞，如：紅細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和退化變性壞死組織也可以出現(xiàn)非特異反應(yīng)，影響對標(biāo)記結(jié)果的判斷。在鏡下必須會識別，防止誤認(rèn)為陽性細(xì)胞?？乖贵w結(jié)合后顯色， 陽性時呈棕色顆粒狀。 細(xì)胞陽性著色可以在細(xì)胞漿、 細(xì)胞膜和細(xì)胞核。 上皮性， 肌源性， 神經(jīng)內(nèi)分泌， 黑色素，內(nèi)皮細(xì)胞和外周神經(jīng)細(xì)胞皆為細(xì)胞漿表達(dá)。 即在細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒。 淋巴細(xì)胞陽性表達(dá)是在細(xì)胞膜上， 圍繞細(xì)胞膜出現(xiàn)棕色線狀結(jié)構(gòu)。ER， PR 陽性表達(dá)是棕色顆粒在細(xì)胞核內(nèi)。免疫組