生化實驗五大技術(shù)

1、生化實驗五大技術(shù)一.分光光度技術(shù)1 .定義：根據(jù)物質(zhì)對不同孩長的光線具有選擇性吸收，每種物質(zhì)都具有其特異的吸收光語。而建立起來的一種定t、定性分析的技術(shù)。2 .基本原理：(圖1-1光吸收示意)透光度T=It/lo吸光度 A=lg(lo/I1)朗伯-比爾(lambert-Beeri)定律:A=KLcK為吸光率，L為溶液厚度(em), c為溶液濃度(mol/L)摩爾吸光系數(shù)日1摩爾濃度的溶液在厚度為I.cm的吸光度。c=A/ £3 .定量分析：標準曲線(工作曲線)法(2)對比法元-KCLCx一 Ax*CsAx KCXL CX工=-X-= J,即 CXAs KCsL Cs計算法： e=A/

2、 8(4)差示分析法(適用于濃度過濃成過稀)(5)多組分湖合物測定4 .技術(shù)分類分子吸收法&原子吸收法:可見光（400-760 nm） &紫外光（200 40m） &紅外光（大于760 nm歷光光度法；5 . 應(yīng)用方向有機物成分分析&結(jié)構(gòu)分析紅外分光光度法測定人體內(nèi)的微量元囊原子吸收分光光度法二電脈技術(shù)1. 定義 : 帶電荷的供試品在情性支持介質(zhì)中，在電場的作用下，向其對應(yīng)的電極方向按各自的速度進行脈動。使組分分離成族窄的區(qū)帶，用透宜的檢洲方法記錄其電泳區(qū)帶圖請或計算其百分含量的方法。2. 基本原理: 球形質(zhì)點的遷移率與所帶電成正比，與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。v

3、=Q/6xr 43. 影響電泳遷移率的因素:電場強度電場強度大，帶電質(zhì)點的遷移率加速溶液的PH值：溶液的pH離pl越遠，質(zhì)點所帶凈電荷越多，電泳遷移幸越大溶液的離子強度: 電泳液中的高子濃度增加時會引起質(zhì)點遷移率的降低電滲 : 在電場作用下液體對于固體支持物的相對移動稱為電滲4. 技術(shù)分類:自由電泳（無支持體）區(qū)帶電泳（有支持體）: 法紙電泳 （常壓及高壓）， 博層電泳 （薄膜及薄板）. 凝波電泳（ 瓊脂，瓊脂糖、淀粉膠、柔丙爍配膠凝膠） 等5. 電泳分析常用方法及其特點:小分子物質(zhì)濾紙、纖維素、硅膠薄膜電泳復(fù)雜大分子物質(zhì)凝膠電泳醋酸纖維素薄膜電泳這種薄順對蛋白質(zhì)樣品吸陰性小，消除紙電沫中出現(xiàn)

4、的“拖尾”現(xiàn)象分離理應(yīng)快，電泳時間短樣品用最少:經(jīng)過冰最酸乙醉溶液或其它看明液處理后可使膜透明化有利丁對電泳圖潛的光吸收措測店和愛的長期保別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測（ 胰島素、 游菌酶、 胎兒甲種球 蛋白 ）玻脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠孔徑較大，對股蛋白質(zhì)不起分子篩作用瓊脂糖凝膠彈性差，不適含管狀電泳 用于等電液魚、免疫電話、血清脂蛋白等蛋白質(zhì)電脈，以及DNA、 RNA、 核苷酸的分析（3） 聚丙烯膚膠凝膠電泳可調(diào)節(jié)孔徑大小機械強度好，有彈性分辨率高，用途廣無電涉 用于不同分子量蛋白質(zhì)的電泳分離 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳該種電泳使蛋白分子相對遷移率 R的大小完全取決于分子量的高低，因此

5、可從已 知分子 a 的標準蛋白的對數(shù)和相對遷移所作的標準曲線中求出供試品的分子量 最常用定性分析蛋白質(zhì)的電脈方法，特別用于蛋白質(zhì)純度檢測&分子 量制定等電聚焦電泳技術(shù)利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點不同的蛋白質(zhì) 由于其分辨率可達0.01pH 單位，因此特別適合于分離分子相近而等電點不同的蛋白質(zhì)組分。適合研究蛋白質(zhì)的數(shù)觀不均性毛細管電泳高靈敏度高分游率高效快速樣品少成本低 符合對多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等生物大分子的分離條件三層析技術(shù)固定相: 固體物質(zhì)或者是固定于固體物質(zhì)上的成分;流動相: 可以流動的物質(zhì)，如水和各種溶媒1 . 原理 : 當待分離的混合物隊流動相通過固定相時。由于各組份的

6、理化性質(zhì)有在差異，與兩相發(fā)生相互作用（ 吸附、溶解。結(jié)合等） 的能力不同。在兩相中的分配（ 含量對比） 不同，面口隨流動相向鎮(zhèn)移動。各組份不斷地在兩相中進行再分配與固定相相互作用力越弱的組份，隨流動相移動時受到的阻滯作用小，向前移動的速度快。2 .技術(shù)分類按層析原理分類,名稱分離原理吸附層析法組份在吸附劑表面吸附，固定相是固體吸附劑，各能力不同分配層析法各組份在流動相和靜止液相（固相）中的分配系數(shù)不同離了交換層析法固定相是離子父換劑，各組份匕離于父換劑結(jié)合力不同凝膠層析法固定相是多孔凝膠，各組份的分子大小/、同，因此在凝膠上受 阻滯得程度/、同親和層析法固定相只能種待分離組份結(jié)合，以此和其無親

7、和力的其他組份分離按操作形式不同分類名稱操作形式柱層析法固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿著一個方向前移而達到分離薄層層析法將適當粘度的固定相均勻涂鋪在薄板上，點樣后用流動相展開， 使各組份分離紙層析法用濾紙作液體的載體，點樣后用流動相展開，使各組份分離薄膜層析法將適當?shù)母叻肿佑袡C吸附劑制成薄膜，以類似紙層析方法進行物 質(zhì)分離3 .層析法的特點與應(yīng)用根據(jù)層析峰的位置及峰高或峰面積，可以定性及定量 ：析法與光學、電學或電化學儀器連用，可檢測出層析后各組份的濃度或質(zhì)量, 同時繪出層析圖：層析儀與電子計算機聯(lián)用，可使操作及數(shù)據(jù)處理自動化，大大縮短分析時間 分講幸高、靈敏度高、選擇性好、速度快適用于雜質(zhì)多、含量

8、少的復(fù)雜樣品分析，尤其適用于生物樣品的分高分析3. 應(yīng)用方向柱層析、薄膜層析（ 以硅膠氧化鋁為吸附劑） 分離 極性或極性不強的有機物離子交換層析. 分子量相對較小的球狀蛋白的分離純化紙層析 售氨基酸、糖類、聯(lián)炎?？股氐姆蛛x排阻層析 分離純化、分析生物人分子尤其是蛋白質(zhì)親和層析法 適用于蛋白成的分離純化氣象層析氨基酸、脂肪酸、單糖、雙期、固醉類物質(zhì)的分離，名隊。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測定四、離心技術(shù)1. 定義 : 利用旋轉(zhuǎn)運動的離心力，以及物質(zhì)的沉障系數(shù)成浮力密度的差別進行分離，依縮和規(guī)純的一項操作，2. 基本原理: 利用轉(zhuǎn)子高速施轉(zhuǎn)時所產(chǎn)生的強大高心力，加快顆粒的沉降速度，把樣品中不同沉降系數(shù)或浮力密

9、度差的物質(zhì)分離開，1 離心力 : 2 強粒的大小形狀和密度: 3 沉降介質(zhì)的密度和粘度，3. 心形式 :離心過濾:在有孔轉(zhuǎn)鼓的離心機中通過過濾介質(zhì)分離懸浮液的過程為離心過濾離心沉降（ 或澄精）:利用固液兩相比重的差異在離心機無孔轉(zhuǎn)鼓或管子中進行懸浮液沉降分離者為高心沉降（ 如用于凈制含少量固體的液體時也稱離心清）離心分離:利用不同溶質(zhì)顆粒在液體各部分分布的差異，分離不同比重液體的過程為離心分離 離心過濾。離心沉降同屬固一液分離，離心分離則民液- 液分離4. 應(yīng)用方向普通離心機 物質(zhì)的分離&提取高速高心機 對樣 品中的懸浮物質(zhì)進行高純度的分離. 濃縮、精制、提取，多用于血液、細胞、蛋白質(zhì)、病毒、激素等的分離制備超速高心機 既可以 分離細胞的亞細胞器，也可以分離生物大分子五 . 酶學技術(shù)1. 牌活性 : 即酶促反應(yīng)速度，指在規(guī)定條件下單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量 ( 注 : 在實際測定酶促反應(yīng)速度時，以測定單位時間內(nèi)產(chǎn)物的生成量為奶2. 影響酶活性的因素: 酶濃度、底物濃度、溫度、P 陽 H、 抑制劑、激話劑、時u問3. Km 值的應(yīng)用鑒定酶的種炎反映酶與底物的親合力(Km伯越大，酶與底物親合力越小)選擇酶的最適底 物計算不同底物濃度時酶促反應(yīng)速度和當于最大反應(yīng)速度的比率固設(shè)計適宜的底物濃度4.Vmax值的應(yīng)用用