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文檔簡介
1、河南大學醫(yī)學院實驗課教案首頁實驗名稱丙種球蛋白與核黃素凝膠層析分離授課對象04級藥學2班、05級護理1班教學目標學時分配大體內(nèi)容與時間安排:(6學時)1. 掌握丙種球蛋白與核黃素凝膠層析分離的原理 講授時間60分鐘2. 學生動手操作 講授時間60分鐘學生操作時間240分鐘授課重點1. 層析的基本原理。2. 操作中應注意的事項。授課方法課前準備講授為主,結合提問、總結,指導糾正,結合學生實驗中出現(xiàn)的問題及時指導。教材生物化學實驗指導 劉玉慶 主編 人民衛(wèi)生出版社教研室審查意見主任簽字授課教師姓名及職稱: 日期:河南大學醫(yī)學院實驗課教案實驗名稱丙種球蛋白與核黃素凝膠層析分離實驗目的1.學習和掌握分
2、子篩凝膠層析法的工作原理和基本操作技術。2學會使用SephadexG50分離核黃素與丙種球蛋白。實驗原理在一定的溫度下,同一化學物質(zhì)在不相混溶的兩種介匝間分布達平街時該物質(zhì)在這兩種介質(zhì)中的濃度比是一常數(shù)稱分配系數(shù)。不同化學物質(zhì)的分配系數(shù)不同。層析法即利用混合物中各組分的分配系數(shù)不同而崖其分離的方法。其兩種介質(zhì),一為固定不動,稱固定相,另一為可相對流動,稱流動相。 層析法已廣泛應用在生物化學領域中,無論是少量分析還是大量制備,都能體現(xiàn)出它的高效性,簡便性等特點。在實臉室中的常用層析法有:凝膠過濾,紙層析薄層層析,離子交換層析,親和層析,高效液相層析等。 以下介紹幾種常用的層析法凝膠過濾 凝膠過濾
3、的別名很多,如凝皎擴散層析,分子篩層析,排阻層析等。這種技術具有操作簡便,回收率高(近100),條件緩和等特點,但它的分離操作速度較慢。該法常用于蛋白質(zhì),多糖,核酸的分離純化。 凝膠過濾的分離過程是在裝有多孔物質(zhì)填料的柱中進行的。柱的總體積為VA,它包括填料的骨架體積VGM。,填料的孔體積Vi(內(nèi)水體積)及填料顆粒間的體積VO(外水體積)。分布在填料的孔中的溶劑是固定相,分布的填料顆粒間的溶劑是流動相。填料顆粒含有許多不同大小的孔如果待分離的物質(zhì)分子大小合適,則可以不同程度地向孔中擴散,大分子物質(zhì)只能占有較少的大孔,小分子則能占有大孔及另外一些小孔。所以當不同分子量物質(zhì)的混合物流經(jīng)凝膠柱時,較
4、小的分子在柱中停留的時間比大分于停留的時間長,于是混合物中各組分即按分于大小分開,最先流出的是最大的分子。示意圖如下所示, 用于生物材料分離的凝膠主要有交聯(lián)葡聚糖凝膠(商品名為Sephadex),聚丙烯酰胺凝膠(商品名為BioGel),瓊脂糖凝膠(商品名Sepharose)等。如常用的交聯(lián)葡聚糖是將葡聚糖(Dextran)懸浮于有機溶劑,加入交聯(lián)劑表氯醇交聯(lián)聚合而成多糖鏈的三維結構,這種聚合物為白色珠狀微粒,是多孔性網(wǎng)狀結構,凝膠的孔徑大小與交聯(lián)劑的量有關,交聯(lián)劑多則交聯(lián)度大,網(wǎng)狀結構緊密,孔徑小,反之交聯(lián)劑少則孔徑大。 將含有三種不同分子量物質(zhì)的混合樣品用某種規(guī)格的凝膠柱進行分離。首先將樣品
5、小心自柱頂端加入,洗脫,以分步收集器收集洗脫液,測定每管物質(zhì)濃度,然后以洗脫體積為橫坐標,各物質(zhì)濃度為縱坐標即得如下的洗脫曲線:由圖可見最先流出的物質(zhì)是,A,它的分子量最大,大于該種凝膠的排阻限(A物質(zhì)分子的直徑大于凝膠的孔徑),完全不能進入顆粒內(nèi)部,只能從顆粒間隙流過,稱“全排阻”。其流經(jīng)體積最小,與外水體積VO相等。最后流出的物質(zhì)是C,它的分子量最小,小于該種凝膠的滲入限,其分子可以自由進出凝膠顆粒,這叫“全滲入”。流經(jīng)體積是外水體積VO與內(nèi)水體積Vi的和。而物質(zhì)B的分子量介于排阻限與滲入限之間,其分子能夠部分地進入凝膠顆粒之中,不能全部地不受限制的通過,這叫做“部分排阻”或“部分滲入”。
6、它的流經(jīng)體積Ve是全部外水體積加上內(nèi)水體積的一部分,即 Ve=VO+KdVi式中Kd稱作“排阻系數(shù)”或“分配系數(shù)”。它反映了物質(zhì)分子進入凝膠顆粒的程度。Kd=(Ve-VO)Vi當Kd=1時,Ve=VO+Vi為全滲入。當Kd=0時,Ve=VO為全排阻。當0Kdt,則說明該物質(zhì)分子與凝膠有吸附作用。這三種物質(zhì)的分離過程可見示意圖如下: Vi也可通過計算求出:Vi=aWra=凝膠千重Wi=每克干凝膠吸水毫升數(shù)Vt=Vo+Vi+VgVg=凝膠骨架體積Vt=可通過測定層析柱內(nèi)徑及高度計算得出:Vt=14D2h下表為交聯(lián)葡聚糖凝膠的種類和規(guī)格:基本操作儀器介紹基本操作:裝柱、樣品處理、上樣、洗脫、分部收集
7、測定設備:層析柱(玻璃柱),鐵架臺實驗步驟1取直徑081.2cm,長度為25cm的層析柱,在上口箍橡皮筋,出口處裝上乳膠管,柱內(nèi)加注蒸餾水23ml,排出乳膠管內(nèi)的氣泡,抬高乳膠管防止柱內(nèi)的蒸餾水排空。自頂部緩緩加入經(jīng)膨脹的葡聚糖G-50懸液。待底部凝膠沉積23cm時將乳膠管放低,仍繼續(xù)加入上述懸液至凝膠層積至18cm高度即可。操作過程中,應防止氣泡與分層現(xiàn)象的發(fā)生。讓凝膠自然下沉,使表層平整。待凝膠柱層穩(wěn)定后,以洗脫液(蒸餾水)洗柱5分鐘,調(diào)節(jié)流速至4滴每分鐘。 2. 待蒸餾水流至柱面平時,(注意,不可使柱面干掉),馬上沿層析柱內(nèi)壁小心加4滴樣品于柱床面,注意盡量不使床面攪動,馬上加入12倍于樣晶體積的蒸餾水,反復兩次后,可加大量蒸餾水連續(xù)洗脫,這樣可以使樣品稀釋最小。 3樣品一旦加入后馬上用量筒或刻度離心管收集流出液,柱床上不斷加蒸餾水,待紅色(血紅蛋白)流出一半時記錄毫升數(shù),此為血紅蛋白Ve也為Vo。繼續(xù)收集流出液,待黃色(核黃素)流出一半時記錄體積,此為核黃素Ve。 4測出柱床體積(Vt),外水體積(Vo)內(nèi)水體積(Vi),及核黃素的洗脫體積(Ve)。并計算出Hb及魚精蛋的分配系數(shù)(Kd)。 5用蒸餾水反復加在柱床上面,洗柱10分鐘然后將柱內(nèi)凝膠回收入凝膠瓶內(nèi)。注意事項1在收集過程中,要保持流出液的流速穩(wěn)定,洗脫速度控制在4滴/min。2加樣時,保持
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