轉化（Transformation）是將外源DNA分子引入受體細胞,使

1、n轉化轉化(Transformation)(Transformation)是將外源是將外源DNADNA分子引入受體細胞分子引入受體細胞, ,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段使之獲得新的遺傳性狀的一種手段, ,它是微生物遺傳、分它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。 n受體細胞經(jīng)過一些特殊方法受體細胞經(jīng)過一些特殊方法( (如電擊法如電擊法,CaCl2 ,RbCl(KCl,CaCl2 ,RbCl(KCl) )等化學試劑法等化學試劑法) )的處理后的處理后, ,細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變的改變, ,成為能允

2、許外源成為能允許外源DNADNA分子進入的分子進入的感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞(Competent cells)(Competent cells)。將經(jīng)過轉化后的細胞在篩選培養(yǎng)基。將經(jīng)過轉化后的細胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉化子中培養(yǎng)，即可篩選出轉化子(Transformant(Transformant, ,即帶有異源即帶有異源DNADNA分子的受體細胞分子的受體細胞) )。一、實驗原理一、實驗原理n所謂感受態(tài)，所謂感受態(tài)， 就是細菌吸收轉化因子的生理狀態(tài)。就是細菌吸收轉化因子的生理狀態(tài)。n關于感受態(tài)的本質與存在，說法很多，關于感受態(tài)的本質與存在，說法很多， 目前主要有兩目前主要有兩種假說：種

3、假說： 局部原生質體化假說感受態(tài)細胞的局部原生質體化假說感受態(tài)細胞的表面形成一種能接受的酶位點，表面形成一種能接受的酶位點， 使分子使分子能進入細胞。能進入細胞。1 1、感受態(tài)細胞的制備、感受態(tài)細胞的制備CaCl2CaCl2法是以法是以MendelMendel和和HigaHiga（19701970）的發(fā)現(xiàn)為基礎，）的發(fā)現(xiàn)為基礎，其基本原理是：細胞處于其基本原理是：細胞處于 0 0 4 4 ， CaCl2 CaCl2 低滲溶液低滲溶液中，大腸桿菌細胞膨脹成球狀。轉化混合物中的中，大腸桿菌細胞膨脹成球狀。轉化混合物中的 DNA DNA 形成抗形成抗 DNA DNA 酶的羥基酶的羥基 - - 鈣磷酸

4、復合物粘附于細鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經(jīng)胞表面，經(jīng) 42 90 42 90 秒熱激處理，促進細胞吸收秒熱激處理，促進細胞吸收 DNA DNA 混合物。將細菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫混合物。將細菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時間，促使在轉化過程中獲得的新的表型，如氨一段時間，促使在轉化過程中獲得的新的表型，如氨芐青霉素耐藥（芐青霉素耐藥（ Amp r Amp r ）得到表達，然后將此細菌培）得到表達，然后將此細菌培養(yǎng)物涂在含養(yǎng)物涂在含 Amp Amp 的選擇性培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)過夜，的選擇性培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)過夜，即可獲得細菌菌落。即可獲得細菌菌落。（一）（一）CaClCaCl2 2 轉

5、化法轉化法核心：目標細胞在核心：目標細胞在 CaClCaCl2 2H H2 2O O 溶液中浸泡一段時間，溶液中浸泡一段時間， 轉化效率轉化效率 10107 7-10-109 9 cell/ cell/gDgD 。 NE.coli NE.coli: DH5: DH5, TG1, XL-1Blue, JM105, TG1, XL-1Blue, JM105 （1 1）冰上）冰上 30min 30min （2 2）熱激）熱激 42 90“42 90“ （3 3）恢復）恢復 1 12min2min （4 4）復蘇）復蘇 37 45-60 min37 45-60 min（二）原生質體轉化法（二）原生質體

6、轉化法（protoplastprotoplast）適用于適用于 G G+ + 細菌，特別是芽胞桿菌、酶母。細菌，特別是芽胞桿菌、酶母。過程：過程： （1 1）等滲環(huán)境下，脫細胞壁（）等滲環(huán)境下，脫細胞壁（LysozymeLysozyme） （2 2）細胞壁再生）細胞壁再生（三）電轉化法（三）電轉化法（electroporationelectroporation）緩沖液：緩沖液：10% 10% 甘油或蔗糖，含（或不含）甘油或蔗糖，含（或不含） MgMg2+ 2+ 離子。離子。轉化條件：轉化條件：2.5 KV/0.2cm 252.5 KV/0.2cm 25F 200-400F 200-400。n分

7、子轉化分以下幾步分子轉化分以下幾步: : 吸附吸附雙鏈分子吸附于受體菌表面；雙鏈分子吸附于受體菌表面； 轉入轉入雙鏈分子解鏈。一條鏈進入雙鏈分子解鏈。一條鏈進入受體菌，另一條降解；受體菌，另一條降解； 自穩(wěn)自穩(wěn)外源質粒分子在細胞內(nèi)復制外源質粒分子在細胞內(nèi)復制成雙鏈；成雙鏈； 表達表達一供體基因隨同復制子同時復制，分裂，一供體基因隨同復制子同時復制，分裂， 轉錄翻譯。轉錄翻譯。2.2.轉化轉化n這和受體菌：質粒的選擇相關，這和受體菌：質粒的選擇相關， 原則上要注意：原則上要注意：n受體菌必須是限制與修飾系統(tǒng)缺陷的菌株；受體菌必須是限制與修飾系統(tǒng)缺陷的菌株；n 根據(jù)質?；蛐秃褪荏w菌基因型互補原則

8、而定。根據(jù)質?；蛐秃褪荏w菌基因型互補原則而定。n重組子的篩選方法常用的有兩種方法：重組子的篩選方法常用的有兩種方法： 抗生素篩選法抗生素篩選法 互補法互補法3.3.重組子的篩選重組子的篩選n 菌株為某種抗生缺陷型，菌株為某種抗生缺陷型， 而質粒上帶有該抗性基而質粒上帶有該抗性基因（如氨芐青霉素，因（如氨芐青霉素， 卡拉霉素等）這樣只有轉化子卡拉霉素等）這樣只有轉化子才能在含該抗生素的培養(yǎng)基上長出。才能在含該抗生素的培養(yǎng)基上長出。n本實驗利用抗生篩選轉化子。本實驗利用抗生篩選轉化子。抗生素篩選法抗生素篩選法n現(xiàn)在使用的許多載體（如系列）有含有一個大現(xiàn)在使用的許多載體（如系列）有含有一個大腸桿菌

9、的短區(qū)段，其中含有腸桿菌的短區(qū)段，其中含有半乳糖苷酸基半乳糖苷酸基因（因（lacZlacZ）的調控序列和頭個氨基酸偏碼區(qū)。）的調控序列和頭個氨基酸偏碼區(qū)。這個偏碼區(qū)中插入一個多克隆位點。這個偏碼區(qū)中插入一個多克隆位點。n 受體菌則含編碼受體菌則含編碼半乳糖苷酶端的序列。當半乳糖苷酶端的序列。當外源基因插入時，二者溶為一體后，有外源基因插入時，二者溶為一體后，有半乳糖苷半乳糖苷酶表達，酶表達， 在生色底物溴氯吲哚在生色底物溴氯吲哚半乳糖苷（半乳糖苷（x-galx-gal）培養(yǎng)基中形成蘭色菌落。）培養(yǎng)基中形成蘭色菌落。n而當有外源基因插入到多克隆原點，從而造成插入失而當有外源基因插入到多克隆原點，

10、從而造成插入失活，而使活，而使lacZlacZ基因不表達而形成白色菌斑?；虿槐磉_而形成白色菌斑。 通過顏色通過顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。不同而區(qū)分重組子和非重組子。、互補法、互補法菌種菌種 ：E. coli DH5aE. coli DH5a（空）、（空）、 E. coli K12E. coli K12（空）（空）設備設備 ：eppendorfeppendorf管、微量取液器管、微量取液器(20l,200l,1000l)(20l,200l,1000l)， 臺式高速離心機，臺式高速離心機， 渦旋振蕩渦旋振蕩器器試劑試劑：LBLB液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基 、 0.1mol/L CaCl0.1mo

11、l/L CaCl2 2 、 AmpAmp二、材料、設備及試劑二、材料、設備及試劑 一、感受態(tài)細胞的制備一、感受態(tài)細胞的制備 （一）、受體菌的培養(yǎng)（一）、受體菌的培養(yǎng) （二）、感受態(tài)細胞的制備（二）、感受態(tài)細胞的制備 ( CaCl2 ( CaCl2 法法) ) 1 1、將、將1.5ml1.5ml（每人）培養(yǎng)液轉入離心管中（每人）培養(yǎng)液轉入離心管中, , 于于44下下3000g3000g離心離心1010分鐘。分鐘。2 2、棄去上清、棄去上清, ,用預冷的用預冷的0.1mol/L0.1mol/L的的CaClCaCl2 2 溶液溶液1ml1ml輕輕懸浮細胞輕輕懸浮細胞, ,冰上放置冰上放置15-301

12、5-30分鐘后分鐘后,4,4下下3000g3000g離心離心1010分鐘。分鐘。 3 3、棄去上清、棄去上清, ,加入加入200200l預冷的預冷的0.1mol/L0.1mol/L的的CaClCaCl2 2 溶液溶液, ,輕輕懸浮輕輕懸浮細胞細胞, ,冰上放置幾分鐘冰上放置幾分鐘, ,即成感受態(tài)細胞懸液。即成感受態(tài)細胞懸液。4 4、 感受態(tài)細胞分裝成感受態(tài)細胞分裝成200l200l的小份的小份, ,貯存于貯存于-70-70可保存半年。可保存半年。 二、二、 轉化轉化 1 1、取、取200l200l感受態(tài)細胞懸液置冰上。感受態(tài)細胞懸液置冰上。2 2、加入、加入1-10ulDNA,1-10ulDN

13、A,輕輕搖勻輕輕搖勻, ,冰上放置冰上放置3030分鐘后。分鐘后。 3 3、4242水浴中熱擊水浴中熱擊2min2min，熱擊后迅速置于冰上冷卻，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-53-5分鐘。分鐘。 4 4、向管中加入、向管中加入1ml LB1ml LB液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基, ,混勻后混勻后3737振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)45min-145min-1小時小時。 5 5、將上述菌液搖勻后取、將上述菌液搖勻后取200l 200l 涂布于含涂布于含AmpAmp的篩選平板上的篩選平板上, ,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37,37培養(yǎng)培養(yǎng)16-2416-24小時。小時。 對照

14、：對照： 另取未轉化感受態(tài)細胞分別涂布另取未轉化感受態(tài)細胞分別涂布篩選平板（篩選平板（AmpAmp終濃度終濃度50ug/ml50ug/ml）和和空白平板空白平板實驗結果：實驗結果：下次實驗觀察并分析篩選結果下次實驗觀察并分析篩選結果 為了提高轉化效率為了提高轉化效率, , 實驗中要考慮以下幾個重要因實驗中要考慮以下幾個重要因素：素： 1. 1. 細胞生長狀態(tài)和密度細胞生長狀態(tài)和密度: : 不要用經(jīng)過多次轉接不要用經(jīng)過多次轉接或儲于或儲于的培養(yǎng)菌，最好從的培養(yǎng)菌，最好從7070或或-20-20甘甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態(tài)細胞的油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。細胞生長密

15、度以剛進入對數(shù)生長期時為好，菌液。細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600 OD600 來控制。來控制。DH5DH5菌菌株的株的OD600 OD600 為為0.50.5時時, ,細胞密度在細胞密度在5 510107 7 個個/ml/ml左左右右( (不同的菌株情況有所不同不同的菌株情況有所不同), ),這時比較合適。密這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉化效率。度過高或不足均會影響轉化效率。 2. 2. 質粒的質量和濃度質粒的質量和濃度: : 用于轉化的質粒用于轉化的質粒DNADNA應主要是應主要是超螺旋態(tài)超螺旋態(tài)DNA(cccDNADNA(ccc

16、DNA) )。轉化效率與外源。轉化效率與外源DNADNA的濃度的濃度在一定范圍內(nèi)成正比在一定范圍內(nèi)成正比, ,但當加入的外源但當加入的外源DNADNA的量過多或的量過多或體積過大時體積過大時, ,轉化效率就會降低。轉化效率就會降低。1ng1ng的的cccDNAcccDNA即可使即可使50l 50l 的感受態(tài)細胞達到飽和。一般情況下的感受態(tài)細胞達到飽和。一般情況下,DNA,DNA溶液溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5 5。 3. 3. 試劑的質量試劑的質量: : 所用的試劑所用的試劑, ,如如CaCl2 CaCl2 等均需是等均需是最高純度的最高純度的(GR.(G

17、R.或或AR.),AR.),并用超純水配制并用超純水配制, ,最好最好分裝保存于干燥的冷暗處。分裝保存于干燥的冷暗處。 4. 4. 防止雜菌和雜防止雜菌和雜DNADNA的污染：整個操作過程的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行均應在無菌條件下進行, , 所用器皿所用器皿, , 如離心管如離心管, , tiptip頭等最好是新的頭等最好是新的, ,并經(jīng)高壓滅菌處理并經(jīng)高壓滅菌處理, ,所有的所有的試劑都要滅菌試劑都要滅菌, ,且注意防止被其它試劑、且注意防止被其它試劑、DNADNA酶或雜酶或雜DNADNA所污染所污染, , 否則均會影響轉化效率或否則均會影響轉化效率或雜雜DNADNA的轉入的轉

18、入, , 為以后的篩選、鑒定帶來不必為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。要的麻煩。 1. 1.感受態(tài)細胞低效感受態(tài)細胞低效2.2.抗生素使用錯誤抗生素使用錯誤3.3.轉化后立即涂板忘轉化后立即涂板忘記溫浴記溫浴1. 1.使用高效率的感受態(tài)細胞使用高效率的感受態(tài)細胞（10106 6以上）以上）2.2.復查質粒抗性，使用正確復查質粒抗性，使用正確的抗生素的抗生素3.3.轉化后溫浴轉化后溫浴45min45min左右，左右，讓抗性基因得以表達。讓抗性基因得以表達。q問題一：問題一：轉化后無克隆產(chǎn)生轉化后無克隆產(chǎn)生 原原因因對對策策1. 1.未加未加IPTG/X-GalIPTG/X-Gal或或其失效其失效2.2.抗生素失活，敏感抗生素失活，敏感菌亦能生長菌亦能生長3.3.用于制備感受態(tài)的用于制備感受