土壤中微生物的分離純化（電子版實驗報告）

1、 微生物實驗報告土壤中微生物的分離與純化指導(dǎo)教師：?；ㄖ芩耐淼谒慕M實驗成員: 杜玉琪 9 董天涵 8怡菲 8 逄穎5【摘要】利用分離純化微生物的基本操作技術(shù)對土壤中的微生物進(jìn)行分離和純化，通過觀察微生物的菌落形態(tài)特征判斷菌的類型并通過平板劃線進(jìn)行分離純化【關(guān)鍵詞】土壤 、微生物、菌落觀察、分離純化1.實驗?zāi)康模?）通過對幾種培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。 （2）掌握倒平板的方法、接種和無菌操作技術(shù)。 （3）初步觀察來自土壤中的幾類微生物的菌落形態(tài)特征，并能判斷菌的類型。 （4）學(xué)習(xí)平板菌落計數(shù)的基本原理和方法，并掌握其基本技能。2.實驗原理（1）培養(yǎng)基的配制與滅菌培養(yǎng)基是人工配

2、制的適合微生物生長繁殖或積累代產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒別、保存各種微生物或積累代產(chǎn)物。一般的培養(yǎng)基應(yīng)包含適合微生物生長的6大營養(yǎng)素即水分、碳源、氮源、能源、無機鹽和生長因子。不同微生物對pH要求不一樣，霉菌和酵母菌的培養(yǎng)基的pH一般是偏酸的，而細(xì)菌和放線菌培養(yǎng)基的pH一般為中性或微堿性。所以配制培養(yǎng)基時還要根據(jù)不同微生物的要求將培養(yǎng)基的pH調(diào)到合適的圍。已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌，如來不及滅菌，應(yīng)暫存冰箱，以防止其中微生物生長繁殖而消耗養(yǎng)分和改變培養(yǎng)基酸堿度所帶來不利影響。（2）微生物的培養(yǎng)及鑒定接種：將微生物的培養(yǎng)物或含有微生物的樣品移植到培養(yǎng)基上的操作技術(shù)稱之為接種。接種是微生

3、物實驗及科學(xué)研究中的一項最基本的操作技術(shù)。 接種的關(guān)鍵是要嚴(yán)格的進(jìn)行無菌操作。 鑒定：常見與常用的微生物中,根據(jù)它們的主要形態(tài)可分為細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌四大類。細(xì)菌菌落光滑，易于基質(zhì)脫離；放線菌菌落質(zhì)地致密，菌落較小，廣泛延伸；酵母菌菌落較細(xì)菌菌落大而厚；霉菌形成的菌落較稀松，多成絨毛狀，絮狀。（3）平板分離與活菌計數(shù)倒平板：按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、土樣編號和實驗日期等。劃線：在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，菌種在平板上劃線。通過劃線將樣品在平板上稀釋，培養(yǎng)后能形成單獨的菌落。平板計數(shù)法是將測菌液經(jīng)適當(dāng)稀釋，涂布在平板上，經(jīng)過培養(yǎng)后在平板上形成肉眼可見的菌

4、落。統(tǒng)計并記錄菌落數(shù)。（4） 細(xì)菌的分離與純化為了得到單一菌種，要對培養(yǎng)的菌分離和純化。用接種環(huán)挑起培養(yǎng)基里少量菌在無菌條件下接種到新的培養(yǎng)基上，劃線，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，從而得到新的單一菌落。3.實驗器材（1）器材：培養(yǎng)皿、載玻片、量筒、滴管、吸水紙、燒杯、三角瓶、酒精燈、玻璃棒、接種環(huán)、鑷子、恒溫培養(yǎng)箱、高溫滅菌鍋、 無菌操作臺 、 天平、濾紙、pH試紙等 。（2）試劑：配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的原料（牛肉膏、NaCl、瓊脂、蛋白胨）、配置高氏I號培養(yǎng)基的原料（可溶性淀粉，KNO3，K2HPO4，MgSO4· 7H2O，NaCl，F(xiàn)eSO4· 7H2O，瓊脂 ，pH=7.4-7

5、.6）配制查氏培養(yǎng)基的原料（硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸亞鐵、蔗糖、瓊脂、蒸餾水）配制無氮培養(yǎng)基的原料（葡萄糖，K2HPO4，MgSO4· 7H2O，NaCl，CaSO4· 2H2O， CaCO3，pH=7.0-7.2）（3）菌種：土壤稀釋液4.實驗步驟（1）高氏培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配方： 可溶性淀粉······················&

6、#183;·················20.0 g KNO3······························&#

7、183;·············1.0 g K2HPO4 ··································&

8、#183;·······0.5 g MgSO4 7H2O·······································0.5

9、 g NaCl ············································0.5 g FeSO4 7H2O··

10、·····································0.01 g 瓊脂···········

11、83;·································20 g 自來水···············&

12、#183;························1000 mL pH ·······················&#

13、183;··················7.47.6 淀粉瓊脂培養(yǎng)基（高氏一號），用于分離和培養(yǎng)放線菌，是一種合成培養(yǎng)基。操作流程：稱量溶解分裝包扎滅菌* 調(diào)PH一步省略不做操作步驟：a.稱量和溶解：按配方先稱取可溶性淀粉，放入小燒杯中，并用少量冷水將淀粉調(diào)成糊狀，再加入小于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，使可溶性淀粉完全熔化。然后再稱取其它各成分依次熔化。對微量成分FeSO4·7H2O可先配成高濃度的儲備

14、液，按比例換算后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO4·7H2O，配成0.01g/mL，再在1000mL培養(yǎng)基中加入1mL的0.01g/mL的貯備液即可。待所有藥品完全溶解后補充水分都所需的總體積。將稱好的瓊脂放入上述已溶的藥品中，加熱使瓊脂熔化，期間不斷攪拌，最后補足加熱過程中損失的水分。 注意：瓊脂熔化過程中應(yīng)控制火力，一面培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器，同時，需不斷攪 拌，以防瓊脂糊底燒焦。 b.分裝：將配好的液體培養(yǎng)基均勻裝入8支試管，每支試管的液體量以傾斜試管液 體恰好成對角線鋪滿試管為標(biāo)準(zhǔn)。剩余培養(yǎng)基液體分裝入兩個三角燒瓶。c.加塞包扎：培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或

15、三角燒瓶口塞上棉塞，以阻止外界微 生物進(jìn)入培養(yǎng)基造成污染。并用牛皮紙包住試管口和三角燒瓶口，皮筋固定。 并在試管和三角燒瓶全身包上報紙。用記號筆標(biāo)好培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。 d.滅菌：將上述培養(yǎng)基以0.1MPa，121，20min高壓蒸汽滅菌。（2）微生物的培養(yǎng)倒平板: 將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏I號培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基、無氮培養(yǎng)基加熱融化，在無菌操作臺上將其倒在16個培養(yǎng)皿中。其中牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)倒9個平板、高氏I號培養(yǎng)基倒3個平板、查氏培養(yǎng)基倒3個平板、無氮培養(yǎng)基倒1個平板。* 倒平板的方法：倒平板主要有兩種方法：皿架法和手持法我們采用手持法倒平板，具體操作如下：右手持三角瓶至于火焰旁邊

16、，用左手將瓶塞輕輕拔出，保持瓶口對準(zhǔn)火焰，左手持培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰旁打開一條縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿是培養(yǎng)基鋪平培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上冷凝。制備土壤稀釋液:稱取1g花園土，無菌操作倒入99mL無菌生理鹽水中,在震蕩器中振蕩20分鐘, 使微生物細(xì)胞分散，靜置2030s，即成10-2稀釋液；再用 lmL移液器，吸取10-2稀釋液lmL，移入裝有9mL無菌水的試管中，振蕩，讓菌液混合均勻，即成10-3稀釋液；再換一支無菌吸頭吸取10-3稀釋液lmL，移入裝有9mL無菌水的試管中，振蕩，即成10-4稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋，制成 10-2、10-3、10-4、10-

17、5、10-6等一系列稀釋菌液（如下圖）涂布：將培養(yǎng)基平板編號，然后用移液槍吸取10-4、10-5、10-6等一系列稀釋菌液各02mL對號接種在不同稀釋度編號的瓊脂平板上（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基每個編 號設(shè)三個重復(fù)，查氏、高氏各一個）。再用無菌涂布棒將菌液在平板上涂布均勻 （如下圖），每個稀釋度用一個滅菌涂布棒；更換稀釋度時需將涂布棒灼燒滅菌。無氮培養(yǎng)基接種用點液法。*涂布方法：將菌液先沿一條直線輕輕地來回推動，使之分散均勻，然后改變方向90沿另一直線來回推動，平板邊緣處可改變方向用涂布棒再涂布幾次，室溫下靜置510min。培養(yǎng):將涂布好的平板平放于桌上1020min，使菌液滲透入培養(yǎng)基，然后將平板

18、 倒轉(zhuǎn)。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)皿置于37培養(yǎng)箱中、高氏I號、查氏、無氮培養(yǎng)皿置于28培養(yǎng)箱，兩天后觀察。記錄并觀察各菌落的生長情況。（3）平板劃線分離微生物連續(xù)劃線分離：在近火焰處啊，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑使用接種環(huán)，從待純化的菌落或待分離的斜面菌種中挑取少量菌樣，在相應(yīng)培養(yǎng)基平板劃線分離（如圖），劃 線的方法多樣，目的是獲得單個菌落。5、實驗結(jié)果記錄(1)各培養(yǎng)基上菌的生長情況牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基細(xì)菌 查氏培養(yǎng)基霉菌高氏培養(yǎng)基放線菌 無氮培養(yǎng)基無氮菌劃線分離后細(xì)菌落圖(2)不同菌落形態(tài)特征的描述菌落特征記錄表菌落名稱細(xì)菌放線菌霉菌固氮菌菌落特征大小大小大中形態(tài)圓形圓形不規(guī)則不規(guī)則干濕濕潤干燥干燥粘稠高度扁平扁平隆起隆起透明度半透明不透明不透明半透明顏色黃色淡粉色綠色乳白色邊緣不整齊整齊不整齊不整齊（3）平板菌落計數(shù)結(jié)果10-4平均10-5平均10-6平均牛肉膏30264（有污染)20151216193（有