病原細(xì)菌的分離與鑒定

1、病原細(xì)菌的分離與鑒定.txt24生活如海，寬容作舟，泛舟于海，方知海之寬闊；生活如山，寬容為徑，循徑登山，方知山之高大；生活如歌，寬容是曲，和曲而歌，方知歌之動(dòng)聽。病原細(xì)菌的分離與鑒定 發(fā)布日期：2009-05-09 掃瞄次數(shù)：827 字號(hào)： 大 中 小 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康南到y(tǒng)學(xué)習(xí)獸醫(yī)臨床病原細(xì)菌的分離與鑒定技術(shù)，促進(jìn)同學(xué)系統(tǒng)掌握各類病原細(xì)菌的基本特性與實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)，增強(qiáng)同學(xué)應(yīng)用所學(xué)知識(shí)解決生產(chǎn)實(shí)踐過程中的傳染病的診斷和防控問題的能力，為預(yù)防、掌握和消滅畜禽病原微生物，保障畜牧業(yè)生產(chǎn)的健康進(jìn)展服務(wù)。二、知識(shí)背景細(xì)菌分離是細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中的極其重要的環(huán)節(jié)。正確的分離有助于很快得到可疑的致病菌，對(duì)疫病的診斷

2、與防控至關(guān)重要。在細(xì)菌分離時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)：1病料采集（1）病料的種類主要決定于疫病的性質(zhì)，一般方法為：全身感染血液及內(nèi)臟；局部感染病患部位；特別病例特別處理。特別情況的正確處理與操作者的專業(yè)知識(shí)有很大關(guān)系。無論全身或局部感染，均應(yīng)采含菌最多或病變明顯的組織（2）病料的采集時(shí)間也應(yīng)特別注意：活體病料應(yīng)考慮病原在疾病進(jìn)展過程中部位的變化；患畜死后應(yīng)立即采集病料，越早越好。2無菌操作無菌操作是指在微生物商量過程中，既要避開各種外界的微生物進(jìn)入操作對(duì)象又要杜絕操作對(duì)象污染周圍環(huán)境的操作技術(shù)。無菌操作是對(duì)微生物學(xué)工作者最基本的要求，必須經(jīng)過嚴(yán)格訓(xùn)練才能形成無菌操作素養(yǎng)。不論何種情況下，頭腦中都應(yīng)該有這個(gè)

3、概念。無菌操作貫穿于整個(gè)分離過程，例如：病料的采集、器材的籌備、簡(jiǎn)略的操作。所用器械及物品均應(yīng)事先滅菌備用，金屬器具包裝后高壓滅菌或煮沸30min，玻璃器皿可高壓滅菌也可干熱滅菌，膠皮塞、培育基等則要高壓滅菌。3培育基培育基是指由人工方法協(xié)作而成的，用于微生物培育、分離、鑒別、商量和保存菌種用的混合營(yíng)養(yǎng)制品。（1）制作培育基的基本原則依據(jù)細(xì)菌的物質(zhì)代謝要求和營(yíng)養(yǎng)需要，必須含有細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需要的碳源、氮源、礦物質(zhì)以及生長(zhǎng)環(huán)境條件。（2）制作培育基的基本要求適宜的水分和各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；適宜的酸堿度與滲透壓；不含抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的物質(zhì)；應(yīng)均質(zhì)透明；應(yīng)徹底滅菌；對(duì)某些微生物必須供應(yīng)一些特別物質(zhì)。（3）培育

4、基的種類 基礎(chǔ)培育基：含有一般細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖需要的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；可作為一些特別培育基的基礎(chǔ)成分。 加富培育基：在基礎(chǔ)培育基中加入某些特別營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如血液/血清、酵母浸膏或生長(zhǎng)因子等）；用以培育對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求高的微生物。 選擇培育基：利用細(xì)菌對(duì)某種或某些化學(xué)物質(zhì)的敏感性不同；在培育基中加入這類物質(zhì)，利于所需分離的細(xì)菌生長(zhǎng)，而抑制不需要的細(xì)菌生長(zhǎng)，從而達(dá)到分離某種微生物的目的。 鑒別培育基：是一類含有某種特定化合物或試劑的培育基。某種細(xì)菌在這種培育基上培育后，產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，能與這種特定化合物或試劑發(fā)生某種明顯的特征性反應(yīng)；從而達(dá)到區(qū)分不同的微生物。 厭氧培育基：利用物理、化學(xué)或生物學(xué)方法，去除氧氣后

5、的培育基；可用于厭氧性細(xì)菌的分離和培育。4細(xì)菌在培育基上的生長(zhǎng)情況（1）固體培育基單個(gè)細(xì)菌在培育基表面生長(zhǎng)、繁殖到肯定程度時(shí)形成的肉眼可見的子細(xì)胞群落稱為菌落，它是由數(shù)以萬計(jì)相同的細(xì)菌集合而成。眾多細(xì)菌在固體培育基表面密集生長(zhǎng)所形成的細(xì)胞群體稱為菌苔。 菌落的形態(tài)特征大小、外形（露滴狀、圓形、菜花樣、不規(guī)章等）、突起或扁平、凹陷、邊緣（光滑、波形、鋸齒狀、卷發(fā)狀等）、顏色（紅色、灰白色、黑色、綠色、無色、黃色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘度等。據(jù)細(xì)菌菌落表面特征不同，可將菌落分為3型：光滑型菌落（S型菌落）：菌落表面光滑、潮濕、邊緣整齊，新分離的細(xì)菌大多呈光滑

6、型菌落。粗糙型菌落（R型菌落）：菌落表面粗糙、干燥、呈皺紋或顆粒狀，邊緣大多不整齊。R型菌落多為S型細(xì)菌變異失去菌體表面多糖或蛋白質(zhì)形成。R型細(xì)菌抗原不完整，毒力和抗吞噬能力都比S型細(xì)菌弱。但也有少數(shù)細(xì)菌新分離的毒力株就是R型，如炭疽孢桿菌、結(jié)核分枝菌等。粘液型菌落（M型菌落）：菌落粘稠、有光澤、似水珠樣。多見于厚莢膜或豐富粘液層的細(xì)菌、結(jié)核桿菌等。 菌落溶血特征溶血：又稱草綠色溶血，菌落周圍培育基消失12mm的草綠色環(huán)，為高鐵血紅蛋白所致；溶血：又稱完全溶血，菌落周圍形成一個(gè)完全清晰透明的溶血環(huán)，是細(xì)菌產(chǎn)生的溶血素使紅細(xì)胞完全溶解所致；溶血：即不溶血，菌落周圍的培育基沒有變化，紅細(xì)胞沒有溶解

7、或缺損。 色素有些細(xì)菌產(chǎn)生水溶性色素，使菌落和周圍的培育基消失綠色、金黃色、白色、橙色、檸檬色等顏色，產(chǎn)生的色素有水溶性或脂溶性。 氣味某些細(xì)菌在培育基中生長(zhǎng)繁殖后可產(chǎn)生特別氣味，如銅綠假單胞菌（生姜?dú)馕叮?、變形桿菌（巧克力燒焦的臭味）、厭氧梭菌（腐敗的惡臭味）、白色假絲酵母菌（酵母味）和放線菌（泥土味）等。（2）液體培育基細(xì)菌在液體培育基中有3種生長(zhǎng)現(xiàn)象：大多數(shù)細(xì)菌在液體培育基生長(zhǎng)繁殖后呈均勻混濁；少數(shù)鏈狀排列的細(xì)菌如鏈球菌、炭疽芽胞桿菌等則呈沉淀生長(zhǎng)；枯草芽胞桿菌、結(jié)核分枝桿菌和銅綠假單胞菌等專性需氧菌一般呈表面生長(zhǎng)，常形成菌膜。（3）半固體培育基半固體培育基主要用于細(xì)菌動(dòng)力試驗(yàn)，有鞭毛的

8、細(xì)菌除了沿穿刺線生長(zhǎng)外，在穿刺線兩側(cè)也可見羽毛狀或云霧狀混濁生長(zhǎng)。無鞭毛的細(xì)菌只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長(zhǎng)，穿刺線兩邊的培育基仍然澄清透明，為動(dòng)力試驗(yàn)陰性。5分離細(xì)菌所要滿足的培育條件（1）適宜的培育基條件；（2）適宜的溫度條件；（3）適宜的氣體條件。三、細(xì)菌的分離方法細(xì)菌分離就是把病料中的病原菌或把目的菌從微生物的混合材料中分離培育出來，并獲得目的菌的單一生長(zhǎng)材料，從而進(jìn)行診斷及有關(guān)商量工作。1待檢材料的處理無菌采集的病料不經(jīng)處理可直接用于分離；污染較嚴(yán)峻的病料，接種前必須處理后方可進(jìn)行分離培育。（1）加熱處理法當(dāng)懷疑病原菌為芽胞菌時(shí)，可加入5-10倍滅菌生理鹽水研磨(液體病料除外)，75水

9、浴30min(或80 15-20min)，可殺死細(xì)菌繁殖體(包括雜菌及病原菌)；然后將處理過的病料接種到適當(dāng)?shù)呐嘤稀＃?）接種易感動(dòng)物把病料接種易感動(dòng)物，待其發(fā)病死亡后，取其血液或組織器官，接種到培育基上。利用此方法不但可以從污染的材料中分離出病原菌，而且還可以確定病原菌的毒力。（3）化學(xué)藥品處理有些化學(xué)藥品對(duì)某些細(xì)菌有極強(qiáng)的抑制力，而對(duì)另一些細(xì)菌則沒有抑制作用或很小。因此可將適宜的化學(xué)藥品加入培育基中。如龍膽紫則可抑制很多G菌的繁殖，有利于G菌的分離培育；2平板劃線分離培育法（1）培育基平板的籌備取一般瓊脂培育基或含有特別成分的瓊脂培育基，融化并讓其冷卻至50左右，傾入滅菌平皿中，每個(gè)平

10、皿約15mL，使其分布均勻，冷卻凝固后即為固體平板培育基。（2）各種物品的籌備取出待檢病料，置于工作臺(tái)上；接種前籌備好酒精燈、接種環(huán)、火柴、酒精棉球、試管架等。如有超凈工作臺(tái)，應(yīng)先打開通風(fēng)機(jī)，過濾除塵，如有紫外線燈應(yīng)同時(shí)打開，10-15min后可開頭工作。不論在桌面上還是在超凈工作臺(tái)上接種，都要事先作好籌備工作，把所用的物品器械擺好。 （3）平板劃線以左手持平板，中指、無名指和小指托著平板底,拇指和食指打開上蓋，使蓋與底成30o角，以便劃線。右手握接種環(huán)，先滅菌鉑絲部分，待絲燒紅后，再于火焰上滅菌金屬棒部分。把接種環(huán)上的病料涂在培育基一側(cè)，一般作5-8次劃線。將環(huán)上的多余細(xì)菌材料燒掉后，從第1

11、次劃線引出第2次劃線；再?gòu)牡?次劃線引出第3次劃線，如此反復(fù)3-4次劃線后，即可把整個(gè)平板表面劃滿，注意每一次劃線只能與上一次劃線重疊，這樣就可在最后的1-2次劃線上消失多量的單個(gè)菌落，以便進(jìn)行純培育。（4）培育物的觀察病料在接種培育基后，經(jīng)過一段時(shí)間，應(yīng)取出來檢查其生長(zhǎng)狀況。首先用肉眼檢查有無細(xì)菌生長(zhǎng)；若有，則需進(jìn)一步檢查菌落是否純一。當(dāng)從臨床病料中分離細(xì)菌時(shí)：多數(shù)情況下，沿劃線生長(zhǎng)較多的菌落，是待檢病原菌的可能性較大；少數(shù)零散分布或不在劃線上生長(zhǎng)的菌落，多為雜菌。為慎重起見，可選擇若干個(gè)可疑菌落分別進(jìn)行鑒定。3厭氧菌的分離培育法通常使用物理去氧、化學(xué)去氧和生物去氧，實(shí)驗(yàn)室常用：厭氧培育箱、

12、厭氧肉湯4細(xì)菌的純培育與移植接種 分離培育的目的就是要獲得純培育。細(xì)菌的純培育就是只含一種細(xì)菌的培育物，最抱負(fù)的純培育是一個(gè)細(xì)菌的后代。細(xì)菌的移植接種就是把某種細(xì)菌材料移種到一個(gè)新的培育基上，使它在其上生長(zhǎng)。四、細(xì)菌的培育技術(shù)依據(jù)目的和要求的差異，可實(shí)行不同的培育方法1、表面培育又稱固體表面培育。將細(xì)菌液均勻地接種于固體培育基表面,平放靜置培育，然后收集菌苔。2、深層培育將細(xì)菌液接種于液體培育基進(jìn)行培育。包括液體靜置深層培育和生物反應(yīng)器（發(fā)酵罐）深層培育。3、透析培育依據(jù)小分子能透過半透膜集中，而將不同分子量的物質(zhì)分離原理設(shè)計(jì)的一種細(xì)菌培育裝置進(jìn)行細(xì)菌培育。五、細(xì)菌的生化試驗(yàn)細(xì)菌由于其種類不同

13、，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸取與排出，分解與合成的能力不同，這與細(xì)菌本身所固有的和環(huán)境誘導(dǎo)的酶有親密關(guān)系，細(xì)菌在自然界是一種巨大的生化動(dòng)力，在它們的代謝過程中往往同時(shí)產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，有些對(duì)人類有利，有些會(huì)引起動(dòng)植物和人類疾病，細(xì)菌的這些合成和分解代謝產(chǎn)物具有種的特異性，我們可借此來進(jìn)行細(xì)菌種的鑒定。1、氧化型與發(fā)酵型（O/F）的測(cè)定（1）原理不同細(xì)菌對(duì)不同的糖分解能力及代謝產(chǎn)物不同，這種能力因是否有氧氣的存在而異，有氧條件下稱為氧化，無氧條件下稱為發(fā)酵。這在區(qū)分微球菌與葡萄球菌、腸桿菌科成員中尤其有意義。（2）培育基成分：蛋白胨2g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀0.3g，瓊脂4g，葡萄糖10g，0.2%溴麝香

14、草酚藍(lán)（BTB）12mL，蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨、瓊脂、鹽類和水混合，加熱融解，調(diào)pH為7.2，然后加葡萄糖和指示劑，混合加熱10min，分裝試管，加塞包裝，115高壓蒸汽滅菌20min，取出訪成瓊脂柱。（3）試驗(yàn)方法 用18-24h斜面培育物接種于兩管O/F培育基，穿刺接種，距管底有肯定距離。 加lmL滅菌的液狀石蠟油到一個(gè)O/F試驗(yàn)管作發(fā)酵試驗(yàn) 37下孵育48h或更長(zhǎng)點(diǎn)時(shí)間（4）結(jié)果判定 只在沒有掩蓋石蠟油的一管發(fā)酵糖產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣者屬氧化型（或呼吸型） 兩管均發(fā)酵糖產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣者為發(fā)酵型2 、糖類分解（發(fā)酵）試驗(yàn)（）原理細(xì)菌分解糖的能力是受遺傳基因掌握的，是細(xì)菌含有直接分解糖

15、的酶或誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶作用的結(jié)果，是細(xì)菌種的特征的表現(xiàn)，可幫助細(xì)菌的鑒定，含糖培育基中含有指示劑，若某細(xì)菌分解糖則產(chǎn)酸（發(fā)酵）或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（氧化），會(huì)使培育基的指示劑轉(zhuǎn)變顏色，可推斷細(xì)菌是否分解某種糖或醇或其他碳水化合物。（）培育基需氧菌常用鄧亨氏（Dunham）蛋白胨水溶液加0.5%-0.7%的瓊脂1.6%溴甲酚紫酒精溶液+特定糖或醇（見附錄）（有市售各種微量發(fā)酵管也可用）。厭氧菌用含胨、鹽、硫羥代乙醇酸鈉、瓊脂的高層半固體培育基半指示劑同上。（3）試驗(yàn)方法 瓊脂斜面培育物用接種針挑取少量菌穿刺接種于糖發(fā)酵管深部（勿穿到管底！）。 若所要接種的細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)要求高，則需要先將糖發(fā)酵管加熱融化后，再加幾滴

16、除菌的馬血清（牛血清也可），搖勻待凝固后再行接種（如巴氏桿菌、布魯氏菌等）。 將接種管標(biāo)記清晰放人37孵育，24-48h觀察結(jié)果，有的菌對(duì)某一糖的發(fā)酵屬遲緩作用，則需要培育一個(gè)月之久。（4）結(jié)果判定無變化 培育基不變色產(chǎn) 酸 培育基變黃產(chǎn)酸產(chǎn)氣 培育基變黃并有氣泡3、淀粉水解試驗(yàn)（1）原理有的細(xì)菌具有淀粉酶，能水解培育基中的淀粉成麥芽糖。淀粉水解后遇碘液不再呈藍(lán)紫色反應(yīng)。（2）培育基與試劑 3%可溶性淀粉瓊脂平板（見附錄）和革蘭氏碘溶液（見附錄一）（3）試驗(yàn)方法 將細(xì)菌劃線接種于3%可溶性淀粉瓊脂平板上，在37培育24h。 取出平板，在菌落處滴加碘液少許，觀察。 培育基呈深藍(lán)色，說明淀粉未被水

17、解，即淀粉酶陰性。能水解淀粉的細(xì)菌其菌落周圍有透明的環(huán)（即淀粉酶陽(yáng)性）。4、吲哚（靛基質(zhì)）試驗(yàn)（1）原理有些細(xì)菌（如大腸埃希氏菌）能分解蛋白質(zhì)中的色氨酸生成吲哚，后者與對(duì)位二甲基氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而呈紅色。（2）培育基：鄧亨氏蛋白胨水溶液（見附錄）。（3）試 劑：歐立希氏（Ehrlichs）試劑 Kovacs試劑對(duì)位二氨基苯甲醛 1g 對(duì)位二氨基苯甲醛 5g無水乙醇 95ml 戊醇（或異戊醇） 75ml濃鹽酸 20ml 濃鹽酸 25ml先用乙醇溶解試劑后加鹽酸，避光保存。（4）試驗(yàn)方法 試管試驗(yàn)法：以接種環(huán)將待檢菌新奇斜面培育物接種于鄧亨氏蛋白胨水溶液中，置37培育24-48h （可

18、延長(zhǎng)4-5d）。于培育液中加入戊醇或二甲苯2-3mL，搖勻，靜置片刻后，沿試管壁加入歐立希氏或Kovacs試劑2mL。在戊醇或二甲苯下面的液體變?yōu)榧t色者為陽(yáng)性反應(yīng)。 斑點(diǎn)試驗(yàn)法：將一片濾紙放在培育皿的蓋子上或一張載玻片上；滴加1-1.5ml試劑液于濾紙上使其變濕；取18-24h血瓊脂平板培育物涂布于浸濕的濾紙上；在1-3min內(nèi)棕色的試劑由紫紅變?yōu)榧t色者為陽(yáng)性。 加熱試驗(yàn)法：將一小指頭大的脫脂棉，滴上兩滴歐立希氏試劑，再在同一處加滴上兩滴高硫酸鉀（K2S2O8）飽和水溶液，置于含培育液的被檢試管中，離液面約半寸；將被檢試管放入燒杯或搪瓷缸水浴煮沸為止；脫脂棉上消失紅色者為陽(yáng)性。5、甲基紅（M.

19、R）試驗(yàn)維倍（V-P）二氏試驗(yàn)。（1）原理甲基紅是一種pH指示劑，pH的變色范圍為pH4.4（紅色）pH6.2（黃色），當(dāng)細(xì)菌分解培育基中葡萄糖產(chǎn)酸，且產(chǎn)酸量大致使培育基在加入甲基紅指示劑后顯紅色為陽(yáng)性。V-P試驗(yàn)則是某些細(xì)菌能使葡萄糖發(fā)酵而產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸再變?yōu)橐阴＜谆状迹姨谆状加肿兂?,3,丁二烯醇，2,3,丁二烯醇在有堿存在時(shí)氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用產(chǎn)生粉紅色化合物。通常M.R和V-P試驗(yàn)是親密相關(guān)的，如果一個(gè)微生物M.R是陽(yáng)性，則V-P是陰性；或者相反。這個(gè)試驗(yàn)對(duì)區(qū)分大腸埃希氏菌與腸桿菌是特別有用的。（2）培育基 葡萄糖蛋白胨水溶液（見附錄）。（3）試劑 M

20、.R試劑甲基紅 0.02g95%酒精 60mL蒸餾水 40mL V.P試劑甲液：萘酚酒精溶液（萘酚5g無水乙醇100mL）乙液：KOH溶液（KOH 40g，水100mL）將甲液和乙液分裝棕色瓶中，于4-10保存?；蛄蛩徙~ 1g濃氨水 40mI10%KOH 950mL蒸餾水 10mL待溶解后分裝棕色瓶中備用。（4）試驗(yàn)方法? M.R試驗(yàn)：接種細(xì)菌于培育基中，在37培育24-48h后。于培育物中加入幾滴試劑，變紅色者為陽(yáng)性反應(yīng)，桔紅到黃色則為陰性。? V-P試驗(yàn):取出培育24hV.P試驗(yàn)用葡萄糖蛋白胨溶液lmL。將6%小萘酚酒精溶液0.5mL加入，隨后加16%KOH 0.5mL，輕搖，然后讓其靜置

21、10-15min。在15min內(nèi)消失紅色者則為陽(yáng)性，1h后可消失假陽(yáng)性。6、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)（1）原理在這個(gè)培育基中檸檬酸鈉為唯一的碳源，磷酸銨是唯一的氮源，若細(xì)菌利用這些鹽作為碳素和氮素來源而生長(zhǎng)，利用檸檬酸鈉則生成碳酸鹽以及銨鹽被利用所產(chǎn)生的NH3+轉(zhuǎn)變?yōu)镹H4OH，使培育基變堿，pH上升，指示劑溴麝香草酚藍(lán)就顯出深藍(lán)色。（2）培育基西蒙氏（Simmons）檸檬酸鈉瓊脂斜面培育基（見附錄）。（3）試驗(yàn)方法將被檢菌純培育物或單個(gè)菌落劃線于檸檬酸鈉瓊脂斜面并在37培育24-48h。腸桿菌、枸椽酸桿菌和一些沙門氏菌種產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)，可見菌體生長(zhǎng)好或培育基顯為深藍(lán)色。7、石蕊牛乳試驗(yàn)（1）原理石蕊是

22、一種指示劑，當(dāng)pH升至8.3時(shí)堿性顯藍(lán)色，pH降至4.5時(shí)酸性顯紅色；pH接近中性，未接種的培育基為紫藍(lán)色故稱紫乳。石蕊也是一種氧化還原指示劑，可以還原為白色，所以，石蕊牛乳（紫乳）是用來測(cè)定被檢細(xì)菌幾種代謝性質(zhì)的一種鑒別培育基。（2）培育基加石蕊酒精飽和溶液于新奇脫脂乳中，分裝小管，經(jīng)流通蒸汽滅菌而成。（3）試劑石蕊酒精溶液的制備：8g石蕊在30mL的40%乙醇中研磨，吸出上清液，加乙醇研磨，連續(xù)兩次。加40%乙醇總量100mL，并煮沸1min。取用上清液，必要時(shí)可加幾滴1mol/L鹽酸使呈紫色。現(xiàn)多用溴甲酚紫代替石蕊，即于100mL脫脂乳中加1.2mL 1.6%溴甲酚紫酒精溶液。（4）試驗(yàn)

23、方法與解釋將被檢菌接種于紫乳，置37溫箱培育，觀察結(jié)果。若細(xì)菌分解乳糖產(chǎn)酸，指示劑變色（石蕊為紅色，溴甲酚紫為黃色）。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，使牛乳酸凝，氣體使凝塊中有裂隙，如產(chǎn)氣莢膜梭菌呈“暴烈發(fā)酵”。若為紫色，表示乳糖雖未分解；若為藍(lán)色表示乳糖雖未發(fā)酵，但細(xì)菌分解培基中所消失的氮源物質(zhì)而產(chǎn)堿所致。若指示劑還原則為無色，常消失在酸凝塊形成之后。8、硫化氫試驗(yàn)（1）原理凡細(xì)菌能分解含硫氨基酸，產(chǎn)生H2S者，其所產(chǎn)生的H2S會(huì)使培育基中的醋酸鉛（或含醋酸鉛的潮濕濾紙條）或FeCl3形成黑色的硫化鉛或硫化鐵。（2）培育基 醋酸鉛瓊脂（見附錄）。 三糖鐵瓊脂斜面（見附錄）。 營(yíng)養(yǎng)肉湯，肝浸湯瓊脂斜面或血清葡萄糖

24、瓊脂斜面。（3）試驗(yàn)方法與解釋 用接種針蘸取純培育物，沿試管壁作穿刺，37孵育24-48h或更長(zhǎng)時(shí)間，培育基變黑者為陽(yáng)性。 或?qū)⒓兣嘤锝臃N于肉湯，肝浸湯瓊脂斜面或血清葡萄糖瓊脂斜面，在試管壁和棉花塞間夾一6.50.6cm大小的試紙條（浸有飽和醋酸鉛溶液），培育于37，觀察，紙條變黑者為陽(yáng)性。9、硝酸鹽還原試驗(yàn)（1）原理有些細(xì)菌能從硝酸鹽提出氧而將其還原為亞硝酸鹽（偶而還會(huì)形成NH3+ N2、NO、NO2和NH4OH的其它產(chǎn)物），若向培育物中加入對(duì)氨基苯磺酸和-萘胺，會(huì)形成紅色的重氮染料對(duì)磺胺苯-偶氮-萘胺，這對(duì)鑒定細(xì)菌是有用的試驗(yàn)（鋅也可還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，而且對(duì)區(qū)分假陰性反應(yīng)和真陰性反應(yīng)

25、是有用的）。（2）培育基 適用于需氧菌的硝酸鉀蛋白胨水。 適用于厭氧菌的硝酸鹽培育基。（3）試劑甲液：甲基-萘胺0.6g 5mo1/L冰醋酸100mL稍加熱溶解，用脫脂棉過濾，放棕色瓶中，4-10保存。乙液：對(duì)氨基苯磺酸0.8g 5mol/L冰醋酸100mL先用5mo1/L冰醋酸30mL溶解對(duì)氨基苯磺酸，再加冰醋酸至100mL。放入帶玻璃塞的玻璃瓶中4-10保存。（4）試驗(yàn)方法與解釋用純菌培育物接種到硝酸鹽培育基中，在37培育18-24h，再加試劑甲和乙各3-5滴，在30s內(nèi)消失紅色即為陽(yáng)性。若無顏色消失，加少量鋅渣，隨后消失紅色則是真正的陰性試驗(yàn)。10、尿素酶試驗(yàn)（1）原理細(xì)菌分解尿素產(chǎn)生兩

26、分子氨，使培育基pH上升，指示劑酚紅顯示出紅色，即證明細(xì)菌有尿素酶。（2）培育基 Christensens尿素瓊脂培育基，內(nèi)含尿素，蛋白陳和酚紅指示劑（見附錄）。（3）試驗(yàn)方法用接種環(huán)將待檢菌培育物接種于尿素瓊脂斜面，不要穿刺到底，下部留作對(duì)比。置37培育，于1-6h檢查（有些菌分解尿素很快），有時(shí)需培育24h到6d（有些菌則緩慢作用于尿素）。陽(yáng)性反應(yīng)，則瓊脂斜面由粉紅到紫紅色。11、接觸酶試驗(yàn)（1）原理本試驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)菌有無接觸酶的存在，過氧化氫的形成看作是糖需氧分解的氧化終未產(chǎn)物，由于H2O2的存在對(duì)細(xì)菌是有毒性的，細(xì)菌產(chǎn)生酶將其分解，這些酶為接觸酶（過氧化氫酶）和過氧化物酶。（2）試劑 3

27、%H2O2（新配）。（3）試驗(yàn)方法與解釋可用接種環(huán)將一菌落放于載玻片的中央，加一滴3%H2O2于菌落上，立即觀察有無氣泡消失，也可在菌落和H2O2混合物之上放一張蓋玻片，可幫助檢出輕度反應(yīng)，還可降低細(xì)菌的氣溶膠顆粒的形成。也可直接將3%H2O2加到培育瓊脂斜面或平板上直接觀察有無氣泡消失（血瓊脂平板除外）。12、氧化酶試驗(yàn)（1）原理測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞色素氧化酶的產(chǎn)生。陽(yáng)性反應(yīng)限于哪些能夠在氧氣存在下生長(zhǎng)的同時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素氧化酶的細(xì)菌。（2）試劑1%四甲基對(duì)苯二胺（Tetra-methy-p-phenylene diamine dihydrochloride），新奇配制，裝棕色瓶貯存4，一個(gè)月。

28、（3）試驗(yàn)方法加2-3滴試劑于濾紙上，用一攪拌簽挑取一個(gè)菌落到紙上涂布）觀察菌落的反應(yīng)。陽(yáng)性反應(yīng)在5-10s內(nèi)由粉紅到黑色，15min后可消失假陽(yáng)性反應(yīng)。也可將試液滴在細(xì)菌的菌落上，菌落呈玫瑰紅色然后到深紫色者為陽(yáng)性。也可在菌落上加試液后傾去，再緩緩滴加用95%酒精配制的1%的（-萘酚溶液，當(dāng)菌落變成深藍(lán)色者為細(xì)胞色素氧化酶陽(yáng)性。（4）注意事項(xiàng) 作時(shí)只能使用攪拌簽（或鉑金環(huán)），由于鐵絲會(huì)消失假陽(yáng)性反應(yīng)。 不要使用含葡萄糖培育基上生長(zhǎng)的菌落，由于它的發(fā)酵作用會(huì)抑制氧化酶的活性，可能給予假陰性結(jié)果。13、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)（1）原理若細(xì)菌具有苯丙氨酸脫氨酶，能將培育基中的苯丙氨酸脫氨變成苯丙酮酸，

29、酮酸能使三氯化鐵指示劑變?yōu)榫G色。變形桿菌和普羅菲登斯菌以及莫拉氏菌有苯丙氨酸脫氨酶的活力。（2）培育基與試劑 培育基：DL-苯丙氨酸2g，氯化鈉5g，（L苯丙氨酸1g），瓊脂12g，酵母浸膏3g，磷酸氫二鈉1g，蒸餾水1000mL，分裝于小試管內(nèi)，121高壓蒸汽滅菌10min，作成斜面。 試 劑：10% FeCl3水溶液（3）試驗(yàn)方法將被檢菌18-24h培育物取出，向試管內(nèi)注入0.2mL（或4-5滴）10%FeCl3，溶液于生長(zhǎng)面上，變綠色者為陽(yáng)性。14、氨基酸脫羧酶試驗(yàn)（1）原理這是腸桿菌科細(xì)菌的鑒別試驗(yàn)，用以區(qū)分沙門氏菌（通常為陽(yáng)性）和枸椽酸桿菌（通常為陰性），若果細(xì)菌能從賴氨酸或鳥氨酸脫

30、去羧基（-COOH），導(dǎo)致培育基pH變堿，指示劑溴麝香草酚藍(lán)就顯示出藍(lán)色，試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。若細(xì)菌不脫羧，培育基不變則為黃色。（2）培育基基礎(chǔ)培育基：蛋白胨5g 酵母浸膏 3g葡萄糖1g 蒸 餾 水1000mL0.2%溴麝香草酚藍(lán)溶液 12mL? 調(diào)整pH至6.8，在每100mL基礎(chǔ)培育基內(nèi)，加入需要測(cè)定的氨基酸0.5g，所加的氨基酸應(yīng)先溶解于1.5%NaOH溶液內(nèi)。L-賴氨酸0.5g1.5%NaOH溶液0.5mLL-烏氨酸0.5g1.5%NaOH溶液0.5mL? 加入氨基酸后，再調(diào)整pH至6.8，分裝于滅菌小試管內(nèi)，每管1mL，121高壓蒸汽滅菌10min。（3）試驗(yàn)方法1）從瓊脂斜面挑取培育

31、物少許，接種于試驗(yàn)用培育基內(nèi)，上面加一層滅菌液狀石蠟。2）將試管放在37培育4d，每天觀察結(jié)果。3）陽(yáng)性者培育液先變黃后變?yōu)樗{(lán)色，陰性者為黃色。15、-半乳糖苷酶（ONPG）試驗(yàn)（Ortho-nitrophenyl-Dgalactopyranoside Test）（1）原理細(xì)菌分解乳糖依靠?jī)煞N酶的作用，一種是-半乳糖苷酶透性酶（-galactosidase permease），它位于細(xì)胞膜上，可運(yùn)送乳糖分子滲人細(xì)胞。另一種為-半乳糖苷酶（-galactosidase），亦稱乳糖酶（Lactase），位于細(xì)胞內(nèi)，能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。具有上述兩種酶的細(xì)菌，能在24-48h發(fā)酵乳糖，而缺乏

32、這兩種酶的細(xì)菌，不能分解乳糖。乳糖遲緩發(fā)酵菌只有-D-半乳糖苷酶（胞內(nèi)酶），而缺乏-半乳糖苷酶透性酶，因而乳糖進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞很慢，而經(jīng)培育基中1%乳糖較長(zhǎng)時(shí)間的誘導(dǎo)，產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的透性酶后，始能較快分解乳糖，故呈遲緩發(fā)酵現(xiàn)象。ONPG可迅速進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，被半乳糖苷酶水解，釋出黃色的鄰位硝基苯酚（Ortho-nitrphenyl，ONP），故由培育基液變黃可迅速測(cè)知-半乳糖苷酶的存在，從而確知該菌為乳糖遲緩發(fā)酵菌。（2）培育基ONPG培育基成分：鄰硝基酚半乳糖苷0.6g，0.01mol/L pH7.5磷酸緩沖液1000mL，pH7.5的滅菌1%蛋白胨水300mL。制法：先將前兩種成分混合溶解，濾過

33、除菌，在無菌條件下與1%蛋白胨水混合，分裝試管，每管2-3mL，無菌檢驗(yàn)后備用。購(gòu)不到ONPG時(shí)，可用5%的乳糖，并降低蛋白胨含量為0.2%-0.5%，可使大部分遲緩發(fā)酵乳糖的菌在1d內(nèi)發(fā)酵。（3）試驗(yàn)方法取一環(huán)細(xì)菌純培育物接種在ONPG培育基上置37培育1-3h或24h，如有半乳糖苷酶，會(huì)在3h內(nèi)產(chǎn)生黃色的鄰硝基酚；如無此酶，則在24h內(nèi)不變色。16、明膠液化試驗(yàn)（1）原理明膠是一種動(dòng)物蛋白質(zhì)，某些細(xì)菌具有明膠液化酶，明膠經(jīng)分解后，可呈現(xiàn)不同的特征，有利于細(xì)菌的鑒定。（2）培育基明膠培育基（見附錄）。（3）試驗(yàn)方法與注意事項(xiàng) 分別穿刺接種被檢菌18-24h培育物于明膠培育基，置22下孵育，觀

34、察明膠液化狀況。明膠低于20凝成固體，高于24則自行呈液化狀態(tài)，因此孵育溫度最好在22，但有些細(xì)菌在此溫度下不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)極為緩慢，則可先放在37培育，再移置于4冰箱經(jīng)30min后取出觀察，具有明膠液化酶者，雖經(jīng)低溫處理，明膠仍呈液態(tài)而不凝固。明膠耐熱性差，若在100以上長(zhǎng)時(shí)間滅菌，能破壞其凝固性，此點(diǎn)在制備培育基時(shí)應(yīng)注意。17、膽汁溶解試驗(yàn)（1）原理肺炎鏈球菌產(chǎn)生自溶酶，它能使正在生長(zhǎng)的菌體溶解，使老齡菌落中心下陷，膽鹽通過降低培育基與菌體細(xì)胞膜之間的表面能力而加速這一過程。本試驗(yàn)常用以鑒別肺炎鏈球菌和甲型溶血性鏈球菌。（2）試劑 2%去氧膽酸鈉溶液（3）試驗(yàn)方法與解釋于被檢菌血瓊脂平板上找到單個(gè)分散的菌落，在其上加一滴試液。再置37培育箱中30min后取出觀察菌落，可見菌落消失，或尚有部分保留。培育菌在肉湯中生長(zhǎng)，而且固體培育平板上菌落周圍一個(gè)黑洞（孔）者是D群鏈球菌的指示。六、細(xì)菌的毒力檢測(cè)1毒力的概念同種病原微生物不同菌株或毒株的不同程度的致