細胞常見污染情況分析

1、細胞培養(yǎng)常見污染的判別及應對措施2011-01-0210:19:04|分類：奔魚|標簽：污染無菌細胞培養(yǎng)基滅菌|字號大中小訂閱一、避免細胞培養(yǎng)污染的措施：污染是細胞培養(yǎng)中一個大敵，一旦污染，前功盡棄！決定要進行細胞培養(yǎng)，首先一定要有強烈的無菌意識！操作中要遵守嚴格的操作規(guī)程，不要怕麻煩，越細心越好！注意以下幾點，大部份的污染是可以避免的：1,每次開始實驗前，先用紫外照無菌臺和實驗室20分，用酒精擦手，臺面和不消毒的器械（如移液槍等）；實驗中，如允許，盡量多過火，開起或蓋蓋都靠近火焰或在無菌臺深處；使用無菌臺后，再用酒精擦臺面，紫外照20分！2,滴管不要接觸瓶口，吸取廢液及加入新鮮培養(yǎng)基時都要注

2、意不要滴在瓶口上等等。3 .凡是接觸瓶口后都要用酒精燈燒燒。4 .提取組織時，往往頭會距離組織很近，所以帶口罩很重要！還要換無菌衣（紫外照過的白大褂）5 .注意配制完全培養(yǎng)基時不要發(fā)生污染，在使用前一定要做無菌培養(yǎng)，因為一般應用污染后的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞后，很快就會發(fā)生特別嚴重的污染。6 .操作時一定按照實驗室的要求，切忌粗心大意。7 .使用完的東西盡快移出無菌臺！另外無菌臺上的器械，試劑擺放，也盡量遵循一定的順序！依污染可能程度依次向外擺。二、常見的細胞培養(yǎng)污染：下面是幾種細胞培養(yǎng)過程中常見的污染：1 .支原體污染：傳說中的黑焦蟲，長得暴快。24小時就滿視野都是了。污染源大多數(shù)情況下是培養(yǎng)用血清

3、。圖1支原體污染的光鏡檢測（圓圈所示，X10倍）圖2支原體污染的光鏡檢測（X20倍）圖3支原體污染的熒光檢測圖4支原體污染的電鏡檢測（X30K,煎蛋狀和其他形狀）圖5支原體污染的電鏡檢測2 .念珠菌污染：似乎無處不在，而且頑固得很。長得暴快（12h就能在細胞上面密布）。培養(yǎng)液澄清。低倍顯微鏡下像黑色的沙子鋪在細胞上，高倍鏡下呈樹枝狀或葡萄狀。圖6念珠菌污染的光鏡檢測（低倍鏡）圖7念珠菌污染的光鏡檢測（高倍鏡）圖8念珠菌污染的光鏡檢測（高倍鏡）圖9念珠菌污染的檢測（革蘭氏染色陽性）這么大面積的污染，你可以看看是不是操作上出了問題，要不然就是培養(yǎng)基的問題。既然已經(jīng)污染了，就全部更換你的器皿。培養(yǎng)箱

4、的水沒有必要用無菌水，但最起碼要是蒸儲水。3 .霉菌污染比較常見的一種污染，常常來源于污染的空氣、水和器械。圖10霉菌污染的光鏡檢測（低倍）圖11霉菌污染的光鏡檢測（典型的霉菌污染，肉眼看到白色的團塊或白點，鏡下呈絲狀400倍）DZA圖12霉菌污染的光鏡檢測（樹枝狀，高倍）圖13霉菌污染的倒置顯微鏡檢測（樹枝狀）4 .桿菌污染:培養(yǎng)基中加入抗生素可以減少此種污染，但也不是絕對的圖14桿菌污染的光鏡檢測（瑞氏染色，高倍）圖15桿菌污染的光鏡檢測（瑞氏染色，低倍）細胞中的顆粒到底是怎么回事？我的細胞總有顆粒，開始是細胞中有，后來細胞之間也好像有許多顆粒。好像是細胞碎片一樣。是什么東西?。渴侵гw污

5、染嗎？這可是我剛買回來的細胞?。∥覀儗嶒炇乙灿羞@種情況，是不是黑的小碎片，有人說是細胞代謝產(chǎn)物，后來拿到高倍鏡下看還會動，就懷疑是污染了，也想問問大家到底是什么是黑色的小碎片。我沒注意到它會動，只是覺得不像是活的微生物。我覺得是由于某種污染或外界因素導致的細胞狀態(tài)變差，裂解出的東西。但是，是什么東西不清楚。的確很常見在以前帖子見到說是黑焦蟲”。長時間培養(yǎng)的很容易出現(xiàn)，我根據(jù)自己的經(jīng)驗估計是一種污染，因為隨著黑點增多，本來生長旺盛的細胞逐漸停滯甚至死亡。而且我后來原代培養(yǎng)的幾批細胞并沒有發(fā)現(xiàn)，我懷疑有好多細胞系本身就是污染的。不過增加換液次數(shù)的情況下，好象一般不太嬌氣的細胞生長不是很受影響。以前

6、聽很有經(jīng)驗的老師說黑焦蟲是國產(chǎn)血清的問題，可以有條件換進口血清試試，或者離心一下也可能能解決問題。那么所謂的黑焦蟲”到底是什么東西??？有誰知道？我培養(yǎng)的細胞也出現(xiàn)過此中問題，放到高倍鏡下看時有東西在動，但培養(yǎng)液不混濁，估計不是細菌污染，可能是血清問題，是支原體污染。我培養(yǎng)的細胞也出現(xiàn)過這樣的問題，我個人認為是一種支原體污染。國產(chǎn)血清是罪魁禍首，因為只要將細胞饑餓一下，不超過24小時，這種東西就會瘋長我培養(yǎng)的細胞也有出現(xiàn)這中情況。但是并不影響細胞生長。應該不是支原體污染最近，我復蘇細胞細胞的時候也發(fā)現(xiàn)過這樣的東西，盡管我用的是GIBCO的FBS,后來，每天換液之前洗幾遍后，就慢慢變少，現(xiàn)在沒了細

7、胞培養(yǎng)的細菌污染我們新建的細胞室。每周都會做清潔，用0。2%新潔爾滅消毒，照紫外。實驗前也會照至少30分鐘。培養(yǎng)基中加青霉素，鏈霉素?？墒桥囵B(yǎng)細胞時還是常有細菌污染，有時甚至分析不出原因。用培養(yǎng)瓶還好一點，用多孔板或平皿就更凄慘。我養(yǎng)的是哺乳動物細胞，不知各位有什么好的方法避免污染！謝謝！很可能是超凈臺無效了，或者培養(yǎng)基？其實嚴格操作箱污染都難我們是新的超凈臺，不可能失效。而且用同一瓶培養(yǎng)基，一瓶傳兩瓶，原始的一瓶污染，新傳的很好。所以我分析不出原因呀那么假如把原始的那瓶換新瓶養(yǎng)可以么？都污染了，我仍還來不及，那還敢換新瓶染菌有很多原因，因為整個細胞操作過程均要求無菌，所以看看操作是否規(guī)范，例

8、如戴手套等。多半是環(huán)境因素，做點平板，操作時放在幾個地方，培養(yǎng)后看看長菌情況。消毒用新潔爾滅好象不是太有用。人是最大的污染源，不知你做好手部的消毒工作以及戴口罩沒有，其實，只要你操作的好，嚴格在靠近火的附近操作，污染的幾率是很小的。從你的描述中可以看出培養(yǎng)基應該沒有問題，新的一瓶很好，老的一瓶污染，只有操作不當引起的，還需要加強練手。求助！關于細胞培養(yǎng)中的真菌污染！感激！先謝謝大家的幫助！現(xiàn)在細胞培養(yǎng)基里出現(xiàn)了很多白色和黑色的小點，有好長的時間了！細胞的形態(tài)看起來不太好，但是有些細胞也長的很好，如成纖維細胞，但是內(nèi)皮細胞就差很多！加大量的抗生素沒有效果！不知道是不是真菌污染，怎么鑒別！因為培養(yǎng)

9、了很長時間都沒有出現(xiàn)真菌的菌絲，所以不能肯定是真菌！那些白色的小圓點有點象白色鏈球菌或鏈珠菌，但是不能確定！怎么樣才能判斷確定，改用什么辦法解決！謝謝大家的幫助！殺滅真菌聽說用兩性霉素，但從沒試過。真菌污染是件很麻煩的事，可能重新復蘇細胞是最好的辦法。同時該注意如何防止污染。我覺得如果是真菌污染，培養(yǎng)基會渾濁，是肉眼可見的渾濁。在這種情況下最好趕緊將該瓶細胞扔掉，免得引起培養(yǎng)箱中的大規(guī)摸污染。在顯微鏡下，真菌是成念珠狀的，這時細胞界限不清。這可能是不規(guī)范操作引起的，安全起見還是將細胞室全面打掃一下，用新潔爾滅擦，紫外照！謝謝大家的幫助，因為實驗室以前從來就沒有這樣的污染，所以大家也沒有經(jīng)驗！現(xiàn)

10、在就是不能確定是不是污染。我不可能把實驗室所有的細胞都扔掉，因為有好多人都在一起養(yǎng)不同類型的細胞！現(xiàn)在確實是問題，培養(yǎng)基也沒有渾濁，操作的時候已經(jīng)十二分的小心了！我想問一下，你看到的那些白色或黑色的圓點是在低倍還是高倍顯微鏡下？若培養(yǎng)基不混濁，可能真的是細胞狀態(tài)太差，沒有貼壁還縮成球狀。難道你們實驗室所有細胞都用一瓶培養(yǎng)基？只要將污染的扔掉就行，沒必要都扔掉！兩性霉素！sigma在華美有分裝！但是濃度很小，關鍵還是環(huán)境問題！黑白圓點在100倍顯微鏡下有多大，是不是酵母菌小黑點和小白點是在200倍的顯微鏡下觀察所見，大小可能是細胞核的1/5到1/4左右！細胞狀態(tài)不好是因為跟以前培養(yǎng)的細胞來比較所

11、得，細胞能貼壁，能生長，但是沒有以前的那么快，而且形態(tài)看的也不好！另外問一下sleevexz,酵母菌是什么樣的，怎么鑒別！還有一個問題就是，實驗室用的雙抗是從Gibco公司買過來的直接使用的液體，具體規(guī)格是100ml一瓶,Pelicillin-Streptomycin一起，50倍的，要求儲存在20C,但是有效期只到2002年9月，現(xiàn)在都已經(jīng)差不多過期半年了，但是實驗室的老師都說沒有問題，可以用，現(xiàn)在大家就都是一直用這樣的抗生素在！你們說會不會是抗生素的問題的！養(yǎng)細胞經(jīng)常無緣無辜的染菌？煩煩煩！我是一個新手，但已養(yǎng)細胞近半年，最近一段時間經(jīng)常染菌，有時是培養(yǎng)基，有時連原因都找不到，在實驗中我也非

12、常小心，但結果總讓我傷心?，F(xiàn)在都有點神經(jīng)質(zhì)了，請各位指點你這個問題說大不大，說小也不小。說不大呢，七個字就可以回答你：嚴格按照無菌要求。說不小呢，這無菌要求的話匣子一打開太大。還是簡要吧：1.將試驗用品放入超凈工作臺用紫外線照射30分鐘；2.照射30分鐘后，進入緩沖間，換滅菌的無菌衣，換專用拖鞋；3.手部用5%的潔爾滅浸泡2分鐘，進入潔凈區(qū)后，用75%的酒精棉球再次擦拭裸露的手部。4.最好戴口罩；5.操作時盡量靠近火焰；6.裝培養(yǎng)基的瓶子等不要直接口向上，用一個架子斜放，瓶口朝向火焰；7.標準操作，不要讓無菌吸管到處碰來碰去；8.中途出入無菌室，再次操作時，一定要再次用75%的酒精棉球消毒。一

13、下也想不了那么多，具體的你再問吧。最好把你怎么操作的過程描述一遍，我們就好針對性的指出錯誤了。建議你把細胞室，好好清理一下，污染是這樣的，出現(xiàn)一次就比較麻煩，千萬別急。還有，你們的紫外燈沒有問題吧？非常感謝樓上的回信，在操作中我也嚴格按照無菌要求去做，因為操作臺是公用的，而其它同學很少染菌，我想主要問題應在我身上，但是又找不到主要原因。我一般是這樣操作的：紫外照后，用酒精棉榛拭手部開始操作，基本步驟是吸培養(yǎng)液到方瓶，再在方瓶中吹打混合，按比例傳代，有時吸管頭部碰在培養(yǎng)瓶口，有時吸管口棉花塞的太緊或太松不好用，有時原因都找不到，請各位指點。戴手套試試巴最好是涂片看看是什么菌？注意操作，吸管碰別處

14、立即更換。污染是常有的事，也不必太給自己壓力，熟能生巧。你的滴管吸管進培養(yǎng)液瓶和細胞培養(yǎng)瓶前要在酒精燈上仔細烤一下，滴管不要反復用。其實無菌操作第一重要的就是你的超凈臺是不是還能用，濾網(wǎng)要及時清洗的。其次就是瓶口、滴管、移液器操作是過火的是否正確。還有一點很重要，手一定不能在任何瓶口上方經(jīng)過！從你操作的步驟來看，你的細胞應該是很好操作的。沒看到你要用消化液，這就減少了污染的機會。你用的吸管是自己做的嗎？經(jīng)常練練，熟能生巧，時間長了，你就知道如何控制所塞的棉花量了。（用牙簽或12號針頭等工具來塞比較方便，塞完后用火將露出的部分燒掉再滅菌，這樣就不會在上吸耳球的過程中，出現(xiàn)將棉花弄掉的情況），另外

15、，你要勤剪指甲，不要戴首飾，吸管一周滅一次菌，不要沒用完老用。操作是導致污染的最主要原因根據(jù)本人的經(jīng)驗，操作是導致細菌污染的最主要原因。本人以前曾經(jīng)在一個相當嚴格的實驗室工作過，那里的細胞室的要求是按照外科手術室要求的，更衣，換鞋，洗手，酒精擦手，戴口罩、帽子，所有培養(yǎng)液中加雙抗，所有細胞操作器械專用；每天紫外燈照射40分鐘后才允許進入。但是，就是這樣的條件，操作不好，一樣要污染?，F(xiàn)在本人工作的實驗室要求比那個實驗室差的天遠地遠，但是只要操作仔細了，一樣可以把最難養(yǎng)的細胞養(yǎng)好。本人曾經(jīng)參觀過一些名人進行細胞操作，也就是換上拖鞋，連工作服都不換就進細胞室，細胞一樣沒有問題。所以，最主要的是：工作

16、服，尤其是袖口，消毒情況如何，袖口是否能夠扎緊。如果不能保證，不如索性把袖口挽起來，把手臂用酒精擦一遍（其實我本人連擦都懶得擦，一樣沒事）。操作時，滴管兩頭都要燒。還有一點很重要，就是滴管頭在加液體的時候，不要深入瓶口太多。在倒培養(yǎng)液的時候，可以拿起培養(yǎng)瓶直接倒，但是注意要倒干凈，瓶口沾的最后一滴液體千萬不可回流倒瓶內(nèi)。還有一些基本的問題，比如瓶口要多燒一會，懷疑滴管有污染就一定要換。一旦細胞出現(xiàn)污染的跡象了，就一定要扔掉。如果實在想挽救，可以用一些高檔抗生素（醫(yī)院里給病人加藥后的藥瓶，用無菌鹽水涮涮就能用，濃度足夠），但要小心濃度太高細胞也會死亡。對付霉菌通常用飽和的硫酸銅溶液，放在培養(yǎng)箱的

17、裝水盤中，細胞房的空調(diào)要用除濕的功能。如果不幸染上，要用84液擦培養(yǎng)箱，再用75%酒精擦。滅菌操作：在無菌箱內(nèi)每立方米用甲醛810毫升，高鎰酸鉀5克，熏蒸45分鐘后接種在無菌箱中每立方米用甲醛8-10毫升、高鎰酸鉀0.25千克，熏蒸45分鐘后接種，栽培種接種量按每瓶二級不接30-40袋為宜。（一）常用消毒劑現(xiàn)將常用的消毒藥品及其配制、使用方法，介紹如下：1.35%甲醛水溶液（HCHO）:又名福爾馬林，使蛋白質(zhì)變性。用于培養(yǎng)室、無菌室的滅菌。2 .0.1%的升汞水（HgCL3）:能使蛋白質(zhì)變性，抑制酶類。0.1%升汞配制方法是稱取升汞0.1克，用少許酒精溶解，再加水至100毫升即成。用于無菌箱、

18、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿四周表面以及手指的滅菌。3 .石炭酸（C6H50H）,5%濃度噴霧后，能使蛋白變性沉淀。石炭酸（苯酚）50毫升，加水950毫升配成。用于工作服、實驗桌的滅菌。殺菌效果同升汞。4 .高鎰酸鉀（KMn04）:氧化劑。0.1%濃度能使蛋白質(zhì)與氨基酸氧化，失去酶的活性，用于消毒，能抑制或殺死雜菌。5 .乙醇（CH3CH30H）:又稱酒精。消毒以75%濃度的效果最好。它能使蛋白質(zhì)脫水變性。高濃度酒精會使蛋白質(zhì)很快脫水凝固，消毒作用反而減弱。6 .新潔爾滅：0.25%新潔爾滅用于無菌箱、無菌室的滅菌。一般新潔爾滅5%原液50毫升；加水950毫升配成。7 .漂白粉水：取漂白粉10克，加水140

19、毫升配成。通常在使用前臨時配制，靜置12小時，取上清液噴射，進行室內(nèi)消毒，每平方米用1升。8 .藥皂：煤酚皂、硼酸皂等各種藥皂的水溶液，均可用于器具、橡皮塞及手指的消毒。9 .2%硫酸銅溶液：用硫酸銅（膽磯）2克，加水至100毫升加熱溶解配成。用于床架、木架等各種菌種架的消毒。還可用5%硫酸銅溶液。10 .0.5%波爾多液：先用硫酸銅1斤，溶于100斤水，再用石灰1斤，加水100斤。然后等量混合起來即成。用于菌種架、段木的消毒。11 .多菌靈：用于殺滅真菌、半知茵。1:800倍拌料或1:500倍噴灑均可。（二）無菌箱及無菌室的消毒滅菌無菌箱的消毒滅菌，可采取以下幾種方法：1 .用甲醛和高鎰酸鉀

20、混合熏蒸：一般每平方米需40%甲醛10毫升、高鎰酸鉀8毫升，進行熏蒸。使用時，先密閉門窗，量甲醛溶液盛入容器中、然后倒入量好的高鎰酸鉀，人員隨之離開接種室，關緊房門，熏蒸2030分鐘即可。2 .0.1%升汞水消毒：用0.1%升汞水浸過的紗布或海綿進行指擦，或用噴霧器噴霧滅菌，使箱內(nèi)的上下左右都沾上升汞水，手也可用升汞水消毒，并把袖子卷起來。噴霧后2030分鐘，箱內(nèi)的雜菌和霧滴一起落到箱底被殺死，內(nèi)部的空氣就變得很清潔。3 .紫外線照射滅菌：在無菌箱中裝一支200伏、30瓦的紫外線燈管；每次開2030分鐘，就能達到空間殺菌的目的。照射結束后，罩黑布半小時，以增強殺菌效果。4 .石炭酸噴霧：在每次

21、接種之前，用5%石炭酸溶液噴霧，可促使空氣中的微粒和雜菌沉降，防止桌面微塵飛揚，并有殺菌作用。5 .石灰揩擦：經(jīng)常用藥物熏蒸，易造成酸性環(huán)境，特別用甲醛和高鎰酸鉀熏蒸長久，污染往往越來越嚴重，預防辦法可把各種藥品交替使用，過一段時間（約五周）用石灰擦洗一遍。實踐證明，這樣做效果很好。無菌室消毒同無菌箱。（三）無菌室的使用規(guī)程無菌室無固定程序，但按一般操作應遵循如下規(guī)程：1 .接種室內(nèi)和緩沖室內(nèi)使用前，用5%石炭酸溶液噴霧。把所需要的器材搬入緩沖室清洗，等曬干后搬入接種室，打開紫外線燈，照射殺菌。2 .穿上工作服及無菌工作帽、鞋，然后用煤皂液洗手2分鐘。進人接種室后，查驗器械是否放在一定位置。然后用5%石炭酸溶液重點在工作臺的上方和附近的地面上噴霧。然后退回緩沖室。還可給接種室門口地面灑一層石灰，進門時