藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)技術(shù)指南(試行)

1、藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)技術(shù)指南（試行）前言藥物體內(nèi)代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)及藥物作用靶點(diǎn)基因的遺傳變異及其表達(dá)水平的變化可通過(guò)影響藥物的體內(nèi)濃度和敏感性，導(dǎo)致藥物反應(yīng)性個(gè)體差異。近年來(lái)隨著人類(lèi)基因組學(xué)的發(fā)展，藥物基因組學(xué)領(lǐng)域得到了迅猛發(fā)展，越來(lái)越多的藥物基因組生物標(biāo)記物及其檢測(cè)方法相繼涌現(xiàn)。藥物基因組學(xué)已成為指導(dǎo)臨床個(gè)體化用藥、評(píng)估嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、指導(dǎo)新藥研發(fā)和評(píng)價(jià)新藥的重要工具，部分上市的新藥僅限于特定基因型的適應(yīng)癥患者。美國(guó)FDA已批準(zhǔn)在140余種藥物的藥品標(biāo)簽中增加藥物基因組信息，涉及的藥物基因組生物標(biāo)記物42個(gè)。此外，部分行業(yè)指南也將部分非FDA批準(zhǔn)的生物標(biāo)記物及其特性(如MGM

2、T基因甲基化)的檢測(cè)列入疾病的治療指南。藥物反應(yīng)相關(guān)基因及其表達(dá)產(chǎn)物的分子檢測(cè)是實(shí)施個(gè)體化藥物治療的前提。藥理學(xué)與遺傳學(xué)結(jié)合的關(guān)鍵環(huán)節(jié)包括藥物代謝動(dòng)力學(xué)(pharmacokinetics,PK)和藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)(pharmacodynamicsPD)兩方面。藥物代謝動(dòng)力學(xué)主要是定量研究藥物在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄規(guī)律，側(cè)重于闡明藥物的體內(nèi)過(guò)程；藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)主要研究藥物對(duì)機(jī)體的作用、作用規(guī)律及作用機(jī)制，其內(nèi)容包括藥物與作用靶位之間相互作用所引起的生化、生理學(xué)和形態(tài)學(xué)變化，側(cè)重于解釋藥物如何與作用靶點(diǎn)發(fā)生作用。對(duì)藥物代謝酶和藥物靶點(diǎn)基因進(jìn)行檢測(cè)可指導(dǎo)臨床針對(duì)特定的患者選擇合適的藥物和給藥

3、劑量，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥，從而提高藥物治療的有效性和安全性，防止嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)的發(fā)生。目前美國(guó)FDA和我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(CFDA)都已批準(zhǔn)了一系列的個(gè)體化用藥基因診斷試劑盒。這些試劑盒基本都是對(duì)人DNA樣本進(jìn)行基因檢測(cè)。而在基因表達(dá)的檢測(cè)方面，由于RNA的穩(wěn)定性差，樣本處置不當(dāng)可導(dǎo)致目標(biāo)RNA降解，使得檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，影響臨床判斷。因此，RNA檢測(cè)試劑的研發(fā)相對(duì)滯后。本指南旨在為個(gè)體化用藥基因檢測(cè)提供一致性的方法。本指南中所指的藥物基因組生物標(biāo)志物不包括影響抗感染藥物反應(yīng)性的微生物基因組變異。此外，腫瘤靶向治療藥物個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)指南見(jiàn)腫瘤個(gè)體化治療的檢測(cè)技術(shù)指南。本指南起草單位：中南大學(xué)湘

4、雅醫(yī)院臨床藥理研究所、中南大學(xué)臨床藥理研究所、中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，并經(jīng)國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)專(zhuān)家委員會(huì)、中國(guó)藥理學(xué)會(huì)藥物基因組學(xué)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)、中國(guó)藥理學(xué)會(huì)臨床藥理學(xué)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)分會(huì)組織修訂。本指南起草人：周宏灝、陳小平、張偉、劉昭前、尹繼業(yè)、李智、李曦、唐潔、俞3競(jìng)、彭靜波、曹杉、成瑜。1 .本指南適用范圍錯(cuò)誤！未定義書(shū)簽。2 .藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)概述錯(cuò)誤！未定義書(shū)簽。3 .標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)錯(cuò)誤！未定義書(shū)簽。4 .藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)分析前質(zhì)量保證錯(cuò)誤！未定義書(shū)簽。4.1 采樣前準(zhǔn)備錯(cuò)誤！未定義書(shū)簽。4.2 標(biāo)本采集錯(cuò)誤！未定義書(shū)簽。4.3 標(biāo)本的運(yùn)

5、輸與保存錯(cuò)誤！未定義書(shū)簽。4.4 標(biāo)本的接收與保存錯(cuò)誤！未定義書(shū)簽。5 .藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)分析中質(zhì)量保證錯(cuò)誤！未定義書(shū)簽。5.1 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)要求錯(cuò)誤！未定義書(shū)簽。5.2 檢測(cè)方法錯(cuò)誤！未定義書(shū)簽。5.3 儀器設(shè)備的使用、維護(hù)與保養(yǎng)175.4 人員培訓(xùn)175.5 檢測(cè)體系的性能驗(yàn)證186 .藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)分析后質(zhì)量保證196.1 .檢測(cè)報(bào)告、解釋及報(bào)告發(fā)放196.2 檢測(cè)后樣本的保存和處理237 .藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)的質(zhì)量保證237.1 檢測(cè)確認(rèn)和特征描述247.2 可操作性的SOP編寫(xiě)247.3 質(zhì)控品與室內(nèi)質(zhì)控247.4 室內(nèi)質(zhì)控的評(píng)價(jià)267.

6、5 室間質(zhì)量評(píng)價(jià)268 .制度27附錄A.基因及突變名稱(chēng)、核酸信息28附錄B.縮略語(yǔ)30附錄C.藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)項(xiàng)目列舉33附錄D.藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因相關(guān)的藥物50參考文獻(xiàn)錯(cuò)誤！未定義書(shū)簽。I1 .本指南適用范圍本指南由國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)專(zhuān)家委員會(huì)制定，旨在為臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行藥物代謝酶和藥物靶點(diǎn)基因的檢測(cè)提供指導(dǎo)。本指南的主要適用對(duì)象為開(kāi)展個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子檢測(cè)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室。2 .藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)概述藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因特性的變化可通過(guò)影響藥物的體內(nèi)濃度和靶組織對(duì)藥物的敏感性，導(dǎo)致藥物反應(yīng)性(包括藥物的療效和不良反應(yīng)發(fā)生)個(gè)

7、體差異。藥物基因組生物標(biāo)志物的檢測(cè)是臨床實(shí)施個(gè)體化藥物治療的前提。從藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因出發(fā)，對(duì)個(gè)體化用藥基因檢測(cè)的適應(yīng)人群、標(biāo)本采集、運(yùn)輸、接收、處理、樣本檢測(cè)、結(jié)果報(bào)告與解釋、室內(nèi)室間質(zhì)控需遵循的基本原則，以及可能出現(xiàn)的問(wèn)題與應(yīng)對(duì)措施等方面的內(nèi)容進(jìn)行介紹，可為基于藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)的基因檢測(cè)提供標(biāo)準(zhǔn)化指導(dǎo)。3 .標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)3.1 Ct值(thresholdcycle熒光定量PCR反應(yīng)的熒光強(qiáng)度超過(guò)設(shè)定的閾值所需的循環(huán)數(shù)。Ct值位于PCR反應(yīng)的指數(shù)期初期，與標(biāo)本中待測(cè)核酸分子的原始拷貝數(shù)呈反比，即樣本中原始拷貝數(shù)越多，熒光強(qiáng)度升高的就越快，相應(yīng)的Ct值就越小。3.2 RNA(ri

8、bonucleicaci®核糖核酸，與DNA類(lèi)似的單鏈核酸，由核糖核甘酸按照一定的順序排列而成，含尿喀噬而不含胸腺喀呢，存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，在細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成及其他化學(xué)活動(dòng)中起重要的作用。RNA分子包含信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)、核糖體RNA(rRNA)和其他小RNA等多種類(lèi)型，分別行使不同的功能。各種RNA的混合物稱(chēng)為總RNA。3.3 rs和ss體系SNP由美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation,NCBI)建立、dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)制定的SNP命名體系，rs體系的SNP代表已獲得官方認(rèn)可和推薦

9、的參考SNP(referenceSNP),ss體系的SNP代表用戶(hù)新遞交但尚未得到認(rèn)可的SNP(submittedSNP)。3.4 TE緩沖液TE緩沖液由Tris和EDTA配置而成，主要用于溶解DNA,能穩(wěn)定儲(chǔ)存DNA。3.5 錯(cuò)配修復(fù)（mismatchrepair,MMR）在含有錯(cuò)配堿基的DNA分子中，使正常核甘酸序列恢復(fù)的核甘酸修復(fù)方式，這種類(lèi)型的修復(fù)可糾正DNA雙螺旋上錯(cuò)配的堿基對(duì)，還可修復(fù)因復(fù)制打滑而產(chǎn)生的核甘酸插入或缺失。MMR的過(guò)程需要區(qū)分母鏈和子鏈，做到只切除子鏈上錯(cuò)誤的核甘酸，而不會(huì)切除母鏈上的正常核甘酸。修復(fù)的過(guò)程是：識(shí)別出正確的鏈，切除掉不正確的部分，然后通過(guò)DNA聚合酶I

10、II和DNA連接酶的作用，合成正確配對(duì)的雙鏈DNA。3.6 單核甘酸多態(tài)性（SNP）是指由單個(gè)核甘酸A、T、C或G的改變而引起的DNA序列的改變，造成包括人類(lèi)在內(nèi)的物種之間染色體基因組的多樣性。3.7 等位基因一般是指位于一對(duì)同源染色體相同位置上控制某一性狀的不同形態(tài)的一對(duì)基因。若成對(duì)的等位基因中兩個(gè)成員完全相同，則該個(gè)體對(duì)此性狀來(lái)說(shuō)是純合子。若兩個(gè)等位基因各不相同，則該個(gè)體對(duì)該性狀來(lái)說(shuō)是雜合子。3.8 5-氟尿喀呢一種喀呢類(lèi)似物，作為胸甘酸合成酶抑制劑，阻斷DNA復(fù)制的必需原料胸腺喀呢的合成。主要用于月中瘤的治療。3.9 光密度表示紫外光照射下被檢測(cè)物吸收的光密度，260nm波長(zhǎng)下的吸光值（

11、DNA吸收峰值）可用來(lái)表示DNA的相對(duì)濃度，具體換算公式為：DNA濃度（ng/H）=OD260X50X稀釋倍數(shù)。3.10 基因芯片將大量（通常每平方厘米點(diǎn)陣密度高于400）的核酸探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷喜⑴c標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。3.11 基因是遺傳物質(zhì)的最小功能單位，是指具有一定生物學(xué)意義的一段DNAo3.12 基因型又稱(chēng)遺傳型，是某一生物個(gè)體全部基因組合的總稱(chēng)，它反映生物體的遺傳構(gòu)成，即從雙親獲得的全部基因的總和。據(jù)估計(jì)，人類(lèi)的結(jié)構(gòu)基因有3萬(wàn)個(gè)。因此，整個(gè)生物的基因型是無(wú)法表示的，遺傳學(xué)中具體使用的基因型，往往是指某一性狀的

12、基因型。3.13 基因組生物標(biāo)志物是一種可用于指示正常生物學(xué)過(guò)程、病理過(guò)程和/或?qū)χ委熂捌渌深A(yù)措施反應(yīng)性的可測(cè)量的DNA或RNA特性。其中DNA的特性可包括但不僅限于單核苷酸多態(tài)性、短序列重復(fù)次數(shù)多態(tài)性、單倍型、DNA修飾如甲基化、核苷酸的插入/缺失、拷貝數(shù)變異及細(xì)胞遺傳學(xué)重排如轉(zhuǎn)位、重復(fù)、缺失或反轉(zhuǎn)。RNA特性包括但不僅限于RNA序列、RNA表達(dá)水平、RNA處理過(guò)程(如剪接和編輯)、微小RNA。3.14 檢出限(limitofdetection，LOD)標(biāo)本中一種分析物可被檢出的最低的含量，這一分析物含量可能不是量化的具體數(shù)值。3.15 健康保險(xiǎn)隱私及責(zé)任法案(healthinsuranc

13、eportabilityandaccountabilityact，HIPAA)美國(guó)政府1996年頒布的、醫(yī)療服務(wù)行業(yè)必須遵守的法案。該法案制定了一系列安全標(biāo)準(zhǔn)，就保健計(jì)劃、供應(yīng)商及結(jié)算中心如何以電子文件的形式傳送、訪問(wèn)和存儲(chǔ)受保護(hù)的健康信息做出了詳細(xì)的規(guī)定。3.16 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreactio，nPCR)簡(jiǎn)稱(chēng)PCR技術(shù)，是一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)，應(yīng)用該技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)將一個(gè)或幾個(gè)DNA拷貝擴(kuò)增到百萬(wàn)數(shù)量級(jí)。3.17 臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室是指對(duì)取自人體的各種標(biāo)本進(jìn)行生物學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、化學(xué)、血液免疫學(xué)、血液學(xué)、生物物理學(xué)、細(xì)胞學(xué)等檢驗(yàn)，并為臨床提供醫(yī)學(xué)

14、檢驗(yàn)服務(wù)的實(shí)驗(yàn)室。3.18 靈敏度(sensitivity)測(cè)量系統(tǒng)的示值變化除以相應(yīng)的被測(cè)量值變化所得的商。3.19 室內(nèi)質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行的用于滿(mǎn)足質(zhì)量要求的操作技術(shù)和活動(dòng)。3.20 室間質(zhì)量評(píng)價(jià)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)是多家實(shí)驗(yàn)室分析同一標(biāo)本，并由外部獨(dú)立機(jī)構(gòu)收集和反饋實(shí)驗(yàn)室上報(bào)結(jié)果、評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室操作的過(guò)程，也稱(chēng)能力驗(yàn)證。3.21 脫氧核糖核酸(DNA)核酸的一種，是由特殊序列的脫氧核糖核甘酸單元（dNTP）構(gòu)成的多聚核甘酸，起攜帶遺傳信息的功能。DNA為一種雙鏈分子，通過(guò)核苷酸堿基對(duì)間的氫鍵維系。DNA包含的4種核甘酸包括：腺喋吟（A）、鳥(niǎo)喋吟（G）、胸腺喀噬（T）和胞喀噬（G）。人類(lèi)存在兩種類(lèi)型

15、的DNA:來(lái)自染色體的基因組DNA（gDNA）和線(xiàn)粒體DNA。3.22 能力驗(yàn)證（proficiencytesting，PT）多個(gè)標(biāo)本周期性地發(fā)送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析和（或）鑒定，將每一實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果與同組的其他實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果或指定值進(jìn)行比較，并將比較結(jié)果報(bào)告給參與的實(shí)驗(yàn)室，同室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。3.23 生物標(biāo)記物（biomarker）患者標(biāo)本中所含有的一種特殊的分析物質(zhì)（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)等），可用于疾病診斷、判斷疾病分期或評(píng)價(jià)新藥或新療法在目標(biāo)人群中的安全性和有效性。3.24 微衛(wèi)星指基因上含有重復(fù)的DNA短小序列或單核甘酸的區(qū)域，每個(gè)單元長(zhǎng)度在1-6bp之間。根據(jù)重復(fù)單元的構(gòu)成與分布，微衛(wèi)星D

16、NA序列可分為3種類(lèi)型：?jiǎn)我恍?、?fù)合型和間斷型。3.25 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatelliteinstability，MSI）是指腫瘤基因組特定的微衛(wèi)星位點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)的非腫瘤基因組相比，因重復(fù)單位的缺失或插入而造成的結(jié)構(gòu)性等位基因的大小發(fā)生改變，出現(xiàn)新的微衛(wèi)星等位基因現(xiàn)象。3.26 線(xiàn)性在已知的范圍內(nèi)，某檢測(cè)提供的結(jié)果能夠直接與標(biāo)本的濃度（或量值）成比例關(guān)系的能力。3.27 相對(duì)定量通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法和CT值比較法測(cè)定目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以比較兩個(gè)或多個(gè)樣本中目的基因的表達(dá)差異。該方法通常用來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)量是上調(diào)還是下降。3.28 遺傳藥理學(xué)研究機(jī)體的基因多態(tài)性對(duì)藥物反應(yīng)個(gè)體差異的影響，是

17、藥物基因組學(xué)的重要內(nèi)容。3.29 藥物不良反應(yīng)（adversedrugreaction,ADR）是指上市的合格藥品在常規(guī)用法、用量情況下出現(xiàn)的，與用藥目的無(wú)關(guān)，并給患者帶來(lái)痛苦或危害的反應(yīng)。3.30 藥物的反應(yīng)性包括藥物吸收和分布(即藥代動(dòng)力學(xué))、藥物效應(yīng)(如藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué))、藥物的療效及藥物不良反應(yīng)。3.31 藥物基因組學(xué)研究人類(lèi)基因組信息與藥物反應(yīng)之間的關(guān)系，同時(shí)也可以發(fā)現(xiàn)藥物新靶點(diǎn)和提高臨床試驗(yàn)的成功率。3.32 熒光定量PCR通過(guò)應(yīng)用熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)基因檢測(cè)的定性和(或)定量分析

18、。3.33 熒光原位雜交(FISH)一種細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，可以用來(lái)對(duì)核酸進(jìn)行檢測(cè)和定位。熒光標(biāo)記的核酸探針只與具有高度相似性的核酸雜交，可用于染色體上基因的定位和定量。3.34 雜交兩個(gè)以上的分子具有相近的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)而在適宜的條件下形成雜交體，雜交體中的分子不是來(lái)自一個(gè)二聚體分子。利用兩條不同來(lái)源的多核苷酸鏈之間的互補(bǔ)性而使它們形成雜交體雙鏈被稱(chēng)為核酸雜交。3.35 知情同意(informedconsen)t患者有權(quán)利知曉自己的病情，并可以對(duì)醫(yī)務(wù)人員所采取的治療措施和臨床檢測(cè)項(xiàng)目有決定取舍的權(quán)利。3.36 控制品僅用于質(zhì)量控制目的而不是用于校準(zhǔn)分析的標(biāo)本或溶液。3.37 準(zhǔn)確度(accura

19、cy)是測(cè)量結(jié)果中系統(tǒng)誤差與隨機(jī)誤差的綜合，表示測(cè)量結(jié)果與真值的一致程度。3.38 正確度(trueness)無(wú)窮多次重復(fù)測(cè)量所得量值的平均值與一個(gè)參考量值間的一致程度。3.39 精密度(precision)是指在一定條件下進(jìn)行多次測(cè)定時(shí)，所得測(cè)定結(jié)果之間的符合程度，表示測(cè)量結(jié)果中的隨機(jī)誤差大小的程度。3.40 特異性（specificity）在出現(xiàn)干擾現(xiàn)象（影響量）時(shí)，試驗(yàn)或檢測(cè)程序能夠正確地識(shí)別或定量確定某一實(shí)體物質(zhì)的能力。4 .藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)分析前質(zhì)量保證根據(jù)臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的條件確定合適的分子診斷項(xiàng)目和恰當(dāng)?shù)臉颖咎幚硎谴_保核酸定性定量檢測(cè)準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。標(biāo)本在檢測(cè)前必須確

20、保標(biāo)本的采集、運(yùn)輸和儲(chǔ)存符合要求。標(biāo)本處置不當(dāng)可能引起核酸降解，導(dǎo)致定量檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。4.1 采樣前準(zhǔn)備1）分子診斷項(xiàng)目的申請(qǐng)與完善藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)采樣前需填寫(xiě)規(guī)范的申請(qǐng)單，申請(qǐng)單應(yīng)包含足夠的信息，以識(shí)別患者和有資格開(kāi)具申請(qǐng)單的臨床醫(yī)生。臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)臨床需求合理選擇分子診斷項(xiàng)目。個(gè)體化用藥領(lǐng)域發(fā)展迅速，臨檢實(shí)驗(yàn)室應(yīng)加強(qiáng)與臨床醫(yī)師的溝通，及時(shí)指導(dǎo)臨床醫(yī)師選擇有價(jià)值的診斷項(xiàng)目，幫助醫(yī)師合理解釋檢驗(yàn)結(jié)果；不斷接受正確合理的臨床醫(yī)師的反饋意見(jiàn)，及時(shí)了解臨床對(duì)個(gè)體化用藥分子檢測(cè)的需求，優(yōu)化項(xiàng)目目錄。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)其具體的工作流程，確定質(zhì)量監(jiān)測(cè)指標(biāo)，如患者診斷信息完整率、適當(dāng)臨床判斷率等

21、，并定期對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析，定期對(duì)檢驗(yàn)申請(qǐng)進(jìn)行評(píng)審。2）患者的正確識(shí)別及知情同意患者的正確識(shí)別是確保獲得正確的臨床標(biāo)本的前提。收集標(biāo)本的容器上應(yīng)注明患者的信息，通常應(yīng)包括姓名、送檢醫(yī)院及科室、住院號(hào)等。醫(yī)護(hù)人員在采樣前需首先核對(duì)確定患者的身份，核實(shí)能標(biāo)示患者的信息。標(biāo)本收集前應(yīng)向患者介紹個(gè)體化用藥基因檢測(cè)的意義，以得到患者的認(rèn)同，即知情同意。采樣前需告知患者所檢測(cè)項(xiàng)目的目的、意義、基本過(guò)程、項(xiàng)目可能存在的不足如檢測(cè)結(jié)果可能出現(xiàn)與臨床用藥實(shí)際不相符的情況、剩余核酸的去向（包括可能匿名用于科研項(xiàng)目）及保存時(shí)間，保護(hù)受檢者的個(gè)人隱私（包括醫(yī)療記錄和醫(yī)療數(shù)據(jù)）。對(duì)實(shí)施有創(chuàng)檢查的分子診斷項(xiàng)目如穿刺取活

22、檢組織，應(yīng)清楚地告知患者及家屬檢查可能遇到的風(fēng)險(xiǎn)和緊急情況下的緊急預(yù)案。知情同意書(shū)是醫(yī)方履行如實(shí)告知義務(wù)的證據(jù)，也是患者行使選擇權(quán)的書(shū)面依據(jù)。3）送檢單的填寫(xiě)與項(xiàng)目的復(fù)核標(biāo)本采集前需填寫(xiě)送檢申請(qǐng)單，提供受檢者必需的信息。申請(qǐng)單需填寫(xiě)的信息包括：申請(qǐng)的檢測(cè)項(xiàng)目、標(biāo)本編號(hào)、受檢者姓名、性別、出生日期、民族、采樣日期及時(shí)間、標(biāo)本來(lái)源（組織類(lèi)型）、相關(guān)臨床資料（如身高、體重、疾病診斷、疾病分型分期、合并疾病、用藥情況）、采樣單位及科室名稱(chēng)、送檢醫(yī)師姓名等信息。臨檢實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有專(zhuān)業(yè)人員根據(jù)信息采集表對(duì)檢測(cè)項(xiàng)目的合理性進(jìn)行審核，必要時(shí)可與送檢醫(yī)師討論。4.2 標(biāo)本采集臨床分子診斷實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)各種個(gè)體化用藥分子

23、診斷臨床標(biāo)本的采集按檢測(cè)要求建立SOP。標(biāo)本采集人員應(yīng)經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的培訓(xùn)。采樣前應(yīng)對(duì)標(biāo)本采集容器進(jìn)行評(píng)價(jià)，確保容器本身不會(huì)干擾測(cè)定過(guò)程，并保存評(píng)估記錄。用于藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)的標(biāo)本在采集時(shí)間上無(wú)特殊要求。靜脈血液采集之前應(yīng)按要求對(duì)預(yù)采血的部位徹底消毒。月中瘤組織中DNA的分析利用常規(guī)診斷所用的標(biāo)本即可，但用于RNA分析的標(biāo)本需專(zhuān)門(mén)采集，并準(zhǔn)備好液氮等速凍所需的材料及設(shè)備。標(biāo)本采集需要在密閉、一次性采樣系統(tǒng)中完成，所用的材料如注射器、棉簽、拭子等應(yīng)為一次性使用，以防止污染。無(wú)論采集哪種類(lèi)型的標(biāo)本，采樣時(shí)都必須戴手套，以避免標(biāo)本中病原微生物感染和皮膚脫落細(xì)胞對(duì)標(biāo)本的污染。用于藥物代謝酶和

24、藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)的標(biāo)本類(lèi)型有多種，包括全血標(biāo)本、組織標(biāo)本（新鮮組織、冰凍組織、石蠟包埋組織、穿刺標(biāo)本）、口腔拭子、骨髓、胸腹水等。樣本采樣原則見(jiàn)個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南。1）全血和骨髓標(biāo)本全血標(biāo)本采集到含有適當(dāng)抗凝劑或添加物的采樣管中，添加物根據(jù)被測(cè)量（DNA、細(xì)胞內(nèi)RNA）、檢測(cè)項(xiàng)目和采樣體積而定。因肝素可抑制PCR,全血或骨髓標(biāo)本一般用EDTA或枸檬酸鹽抗凝。采樣前需在采樣管或注射器上標(biāo)注標(biāo)本信息。全血標(biāo)本采集外周靜脈血23mL并置于采血管中，將采血管輕輕顛倒混勻數(shù)次以確保充分抗凝，避免溶血。如檢測(cè)目的是細(xì)胞內(nèi)RNA,建議用含RNA穩(wěn)定劑的采樣管，或采樣后盡快將全血或骨髓加入到RNA

25、穩(wěn)定溶液中。采集干血斑標(biāo)本時(shí)，可向無(wú)菌濾紙上滴加約50NL全血，根據(jù)需要可連續(xù)在數(shù)個(gè)印圈上滴加標(biāo)本，于室溫自然干燥至少4小時(shí)。干血斑標(biāo)本采集時(shí)不要堆疊血斑，不與其他界面接觸，待血斑充分干燥后應(yīng)放入無(wú)菌袋中，避免血斑之間的相互污染，同時(shí)加入干燥劑和濕度指示卡，密封包裝后運(yùn)送。2）組織標(biāo)本當(dāng)待檢測(cè)的組織與血液或口腔脫落細(xì)胞基因型不一致時(shí)，或當(dāng)組織是待測(cè)核酸必須的來(lái)源時(shí)（如檢測(cè)月中瘤組織中mRNA表達(dá)、融合基因、基因擴(kuò)增或缺失、甲基化水平、微衛(wèi)星不穩(wěn)定等），需采集組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)?？捎玫慕M織標(biāo)本包括新鮮組織、活檢組織、石蠟包埋組織和石蠟切片。a）新鮮組織和活檢組織：采樣大小取決于組織類(lèi)型。一般而言，

26、無(wú)論是哪種組織類(lèi)型，在沒(méi)有大量脂肪細(xì)胞侵潤(rùn)的情況下，10mg組織標(biāo)本可提取DNA或RNA10Ng。無(wú)菌條件下取米粒大小手術(shù)或活檢組織（約25mg）;月中瘤組織要求未壞死月中瘤組織比例70%。穿刺取實(shí)體月中瘤組織時(shí)，取得的細(xì)胞數(shù)與穿刺針的粗細(xì)有關(guān)，21G細(xì)針每次獲得100個(gè)細(xì)胞，19G細(xì)針每次獲得之150個(gè)細(xì)胞，支氣管活檢每次獲得之300個(gè)細(xì)胞，CT介導(dǎo)的細(xì)針穿刺每次可獲得之500個(gè)細(xì)胞。通常檢測(cè)時(shí)標(biāo)本中月中瘤細(xì)胞的數(shù)量需達(dá)到200400個(gè)。在某些情況下，要求同時(shí)采集無(wú)病變的組織或外周血作為對(duì)照（如微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)）。組織塊取樣后的處理與保存見(jiàn)個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南。b）石蠟包埋組織：推薦

27、用10%中性緩沖甲醛溶液固定組織標(biāo)本，避免使用含重金屬離子的固定液如Bouin液等。甲醛介導(dǎo)的DNA損傷在固定3小時(shí)后明顯發(fā)生，且時(shí)間越長(zhǎng)，DNA損傷越嚴(yán)重。因此推薦較小的組織（如活檢組織標(biāo)本）固定612小時(shí)，較大的組織（如手術(shù)切除標(biāo)本）固定648小時(shí)。甲醛固定的石蠟包埋組織不適于用作RNA檢測(cè)，但在沒(méi)有其他標(biāo)本可供選擇時(shí)，可考慮選擇沒(méi)有污染部分提取的RNA用于檢測(cè)，待測(cè)RNA序列的長(zhǎng)度最好130bp。組織標(biāo)本切片時(shí)應(yīng)特別注意避免標(biāo)本間的交叉污染。c）組織切片：用于DNA檢測(cè)時(shí)，手術(shù)標(biāo)本需提供10小遮的石蟲(chóng)t切片48張，面積為成人拇指蓋大??；活檢穿刺標(biāo)本提供10pm厚切片810張。所有切片均為

28、白片。月中瘤組織切片應(yīng)在HE染色后，經(jīng)病理醫(yī)師顯微鏡下觀察，以判斷是否含有月中瘤細(xì)胞及月中瘤細(xì)胞的數(shù)量是否足夠（一般要求50%）、壞死組織比例10%,并在對(duì)應(yīng)的白片上畫(huà)出癌巢，對(duì)月中瘤細(xì)胞密集區(qū)域進(jìn)行標(biāo)注。DNA測(cè)序法要求月中瘤細(xì)胞至少占組織細(xì)胞的50%。應(yīng)采取措施避免核酸交叉污染，制備不同患者病理切片標(biāo)本時(shí)，需更換新刀片。3） 口腔脫落細(xì)胞口腔脫落細(xì)胞可同時(shí)用于DNA和RNA分析。常用的是口腔拭子，患者清水漱口后，將消毒醫(yī)用棉簽伸進(jìn)口腔，在口腔內(nèi)側(cè)臉頰粘膜處左右反復(fù)擦拭20次左右，取出棉簽，將棉簽置于干凈濾紙上陰干，每位受檢者至少采集棉簽3根。棉簽立即放入干凈封口塑料袋內(nèi)封閉并放入紙質(zhì)信封，

29、信封上應(yīng)做好詳細(xì)標(biāo)記。濾紙應(yīng)經(jīng)過(guò)滅菌處理，以防細(xì)菌生長(zhǎng)抑制核酸酶的活性。漱口標(biāo)本也可作為口腔脫落細(xì)胞的來(lái)源。用于RNA分析的口腔脫落細(xì)胞必須保存在RNA穩(wěn)定劑中。4.3 標(biāo)本的運(yùn)輸與保存分子檢測(cè)人員應(yīng)熟知標(biāo)本運(yùn)送與保存的條件要求。標(biāo)本一經(jīng)采集，應(yīng)盡快送到臨檢實(shí)驗(yàn)室。臨檢實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定樣本運(yùn)輸與保存的SOP。在運(yùn)送工具的選擇、標(biāo)本的運(yùn)送和保存環(huán)境等方面應(yīng)嚴(yán)格按規(guī)定執(zhí)行。運(yùn)送過(guò)程中應(yīng)防止盛放標(biāo)本的容器破碎和標(biāo)本丟失，注意標(biāo)本的隔離、封裝、容器的密閉。標(biāo)本應(yīng)標(biāo)明采集的日期和時(shí)間、運(yùn)送時(shí)間、實(shí)驗(yàn)室接收時(shí)間、實(shí)驗(yàn)室接收時(shí)標(biāo)本的溫度。運(yùn)送條件根據(jù)標(biāo)本類(lèi)型和待測(cè)靶核酸的性質(zhì)而定。DNA分析應(yīng)在采集后8小時(shí)內(nèi)送

30、達(dá)實(shí)驗(yàn)室，否則需低溫運(yùn)送。當(dāng)待測(cè)核酸為RNA時(shí)，能在10分鐘內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)本可室溫運(yùn)送；如果運(yùn)送時(shí)間較長(zhǎng)，則應(yīng)將標(biāo)本置于干冰中，4小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室；如果標(biāo)本中添加了RNA穩(wěn)定劑，則可室溫運(yùn)送或郵寄。標(biāo)本的長(zhǎng)距離運(yùn)送應(yīng)符合生物安全要求。標(biāo)本運(yùn)輸人員應(yīng)接受適用于標(biāo)本類(lèi)型和遠(yuǎn)程運(yùn)輸?shù)陌踩桶b程序的培訓(xùn)。1)樣本運(yùn)輸中需注意的常規(guī)事項(xiàng)a) 放置血液標(biāo)本的采血管應(yīng)用石蠟?zāi)せ蛲该髂z帶封住管蓋，以防標(biāo)本運(yùn)送過(guò)程中采血管管蓋脫離；標(biāo)本運(yùn)輸過(guò)程中選用輕質(zhì)且不易破碎的包裝物，并在包裝間隙用細(xì)碎輕質(zhì)材料填充。b) 標(biāo)本運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中要避免將標(biāo)本暴露于可能導(dǎo)致核酸降解的環(huán)境中。c) 選擇可靠的快遞公司，樣本寄出

31、后應(yīng)盡快告知檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室快遞單號(hào)及相關(guān)信息，以便對(duì)樣本運(yùn)輸情況進(jìn)行查詢(xún)和跟蹤。樣本要求在盡量短的時(shí)間內(nèi)送達(dá)臨檢實(shí)驗(yàn)室。d) 組織或血液標(biāo)本的采集過(guò)程中可能引起部分基因的表達(dá)上調(diào)，定量分析基因表達(dá)時(shí)需考慮到。2)常見(jiàn)標(biāo)本運(yùn)輸和保存注意事項(xiàng)見(jiàn)個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南。4.4 標(biāo)本的接收與保存1)標(biāo)本的驗(yàn)收、接受與拒收：臨床分子診斷實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立嚴(yán)格的標(biāo)本驗(yàn)收制度和不合格標(biāo)本拒收制度，并安排專(zhuān)人接收標(biāo)本。標(biāo)本驗(yàn)收的內(nèi)容包括：檢查申請(qǐng)單的項(xiàng)目填寫(xiě)是否符合要求、標(biāo)識(shí)是否清楚；申請(qǐng)單有無(wú)醫(yī)師簽字；申請(qǐng)單所填項(xiàng)目是否與標(biāo)本所示一致；申請(qǐng)單姓名、科別、門(mén)診或住院號(hào)與標(biāo)本的標(biāo)簽是否一致；是否簽署了知情同意書(shū)；核實(shí)

32、標(biāo)本采集及送檢之間的時(shí)間間隔（要求采樣1周以?xún)?nèi)）；檢查標(biāo)本的量和外觀質(zhì)量，血液標(biāo)本的外觀質(zhì)量包括采血管是否密閉、有無(wú)溶血、管壁有無(wú)破損、標(biāo)本是否有明顯的污染跡象（如開(kāi)蓋），樣本接收時(shí)的大致溫度，樣本量是否符合要求。手術(shù)切除組織標(biāo)本需做切片和HE染色，由有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量是否滿(mǎn)足檢測(cè)需要。若送檢的為DNA樣本時(shí)，要求體積大于20nL,OD260/280為1.61.8之間，濃度大于50ng/仙L,瓊脂糖電泳后電泳條帶大于50kb。拒收無(wú)標(biāo)簽、標(biāo)簽不清晰、采血管破裂、已開(kāi)蓋、運(yùn)送時(shí)間超過(guò)1周的樣本。拒收標(biāo)本時(shí)應(yīng)及時(shí)與送檢單位聯(lián)系，要求重新采樣或重新送樣。每個(gè)接受的合格標(biāo)本均應(yīng)分配一個(gè)

33、唯一的標(biāo)識(shí)碼。樣本簽收時(shí)實(shí)行送樣人和收樣人雙簽名制度。標(biāo)本接收后，如不能立即檢測(cè)，必須按要求進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋４妗?）樣本的登記與錄入：樣本簽收后立即登記樣本基本信息，收樣日期和時(shí)間，并盡快將標(biāo)本信息錄入實(shí)驗(yàn)室（或醫(yī)院）信息系統(tǒng)，后續(xù)的操作過(guò)程及樣本保存均用唯一編號(hào)。3）標(biāo)本預(yù)處理：部分送檢標(biāo)本到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后需進(jìn)行預(yù)處理，如保存于濾紙上的血液標(biāo)本需采用穿孔機(jī)將濾紙上的血斑取下裝入離心管中，用溶解液沖洗浸泡濾紙，搖床上室溫孵育以除去濾紙上的血紅蛋白。為避免交叉污染，一個(gè)干血斑取材完畢后，穿孔機(jī)需用70%的乙醇徹底清洗，PBS沖洗后，方可用于下一個(gè)干血斑的采集。甲醛固定石蠟包埋組織在進(jìn)行核酸檢測(cè)前需進(jìn)行徹

34、底的脫蠟，二甲苯是常用的高效脫蠟有機(jī)溶劑。4）接收后標(biāo)本的保存見(jiàn)個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南。5 .藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)分析中質(zhì)量保證藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)必須有嚴(yán)格的質(zhì)量控制措施，涉及基因擴(kuò)增的檢測(cè)項(xiàng)目必須在通過(guò)技術(shù)審核的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室完成。分析中質(zhì)量控制的內(nèi)容包括：實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的要求；檢測(cè)程序的選擇、驗(yàn)證及確認(rèn)；儀器設(shè)備的使用、維護(hù)與校準(zhǔn)；人員培訓(xùn)；樣本的準(zhǔn)備（如核酸純化等）；執(zhí)行檢測(cè)；確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果的可靠性。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定室內(nèi)質(zhì)量控制操作程序（SOP）和參加室間質(zhì)評(píng)或?qū)嶒?yàn)室問(wèn)比對(duì)。5.1 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)要求原則上按照個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南的要求進(jìn)行。作為藥物代謝酶和

35、藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)核心技術(shù)之一的PCR,要保證結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，首要措施就是防“污染”。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法要求進(jìn)行設(shè)置，并按要求嚴(yán)格控制空氣流向，避免PCR產(chǎn)物污染。5.2 檢測(cè)方法藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)過(guò)程一般包括核酸提取和靶標(biāo)檢測(cè)兩階段。5.2.1 核酸提取方法DNA提取用酚-氯仿提取法和鹽析法等均可。酚-氯仿法提取可能導(dǎo)致DNA樣品中酚或氯仿殘留，從而抑制后續(xù)的PCR反應(yīng)。鹽析法提取可能存在蛋白質(zhì)及其他物質(zhì)的殘余，DNA的純度和得率不高。DNA提取操作要求在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。DNA一般溶解在pH為7.2的TE(Tris-EDTA)溶液中，可減

36、少其降解。但如果DNA在提取后幾天內(nèi)用于PCR,也可用雙蒸水進(jìn)行溶解。提取出的DNA要求OD260/280介于1.61.8之間，濃度大于50ng/nJDNA相對(duì)穩(wěn)定，在無(wú)DNA酶的情況下，常溫下純化的DNA在TE緩沖液中可放置26周，28七冰箱中可放置至少1年。為降低DNA酶的活性和確保DNA的完整性，純化的DNA標(biāo)本的長(zhǎng)期保存應(yīng)在0°C以下的環(huán)境中。建議將DNA原液保存于-70oC或以下的環(huán)境中。DNA應(yīng)放置在帶蓋密封、疏水的塑料管中(帶橡膠墊片的塑料管更好，可防蒸發(fā))。聚丙烯容易吸附DNA,尤其是在高離子強(qiáng)度的時(shí)候，聚乙烯結(jié)合DNA的能力更強(qiáng)。DNA最適于保存在異質(zhì)同品聚合物材料

37、的塑料管或經(jīng)特殊處理的聚丙烯塑料管中。RNA的提取用異硫氟酸胴結(jié)合酚-氯仿提取法，要求提取后的RNAOD260/280介于1.82.1之間，瓊脂糖電泳28S:18S>2。因RNA很容易被降解，純化好的RNA最好沉淀在無(wú)水乙醇中-70或更低溫度下保存。RNA需儲(chǔ)存在滅菌、疏水、并用焦碳酸二乙酯(DEPC)滅活了RNA酶的塑料管中，操作過(guò)程需帶手套。盡量將RNA溶解于偏堿性(pH7.17.5)溶液中。純化的RNA在首次凍融后3小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，但反復(fù)凍融可導(dǎo)致降解。5.2.2藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)的檢測(cè)方法用于靶標(biāo)檢測(cè)的方法包括PCR-直接測(cè)序法、PCR-焦磷酸測(cè)序法、熒光定量PCR

38、法、PCR-基因芯片法、PCR-電泳分析、PCR-高分辨率熔解曲線(xiàn)法、等位基因特異性PCR法、PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法、原位雜交(ISH)等多種方法，每種方法的原理和優(yōu)缺點(diǎn)如下：1） PCR-直接測(cè)序法也稱(chēng)PCR-Sanger測(cè)序，該方法基于雙脫氧核糖核酸（ddNTP）末端終止法，根據(jù)核苷酸在某一固定點(diǎn)開(kāi)始延伸，隨機(jī)在某一特定堿基處終止，由于摻入的每個(gè)堿基都進(jìn)行了熒光標(biāo)記，因此產(chǎn)生了以A、T、C、G結(jié)束的四組相差一個(gè)堿基的不同長(zhǎng)度的系列核酸片段；通過(guò)毛細(xì)管電泳分離這些片段后讀取待測(cè)核酸的堿基序列。Sanger法測(cè)序是DNA序列分析的經(jīng)典方法。由于該方法可直接讀取DNA的序列，因此被認(rèn)為

39、是基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)。PCR-Sanger測(cè)序法的操作過(guò)程主要包括PCR擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物純化、測(cè)序反應(yīng)、測(cè)序和結(jié)果分析四個(gè)主要步驟。分析時(shí)需要設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性質(zhì)控品。該方法屬于定性檢測(cè)，優(yōu)點(diǎn)是測(cè)序長(zhǎng)度較長(zhǎng)，可發(fā)現(xiàn)新的變異位點(diǎn)。主要不足：靈敏度不高，尤其是在進(jìn)行腫瘤組織體細(xì)胞突變檢測(cè)時(shí)，當(dāng)組織中靶標(biāo)基因突變比例低于20時(shí)，可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果；對(duì)試劑和儀器有特殊要求，不易普及；操作復(fù)雜，成本相對(duì)較高，速度慢、通量低。2） PCR-焦磷酸測(cè)序法本方法是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)需設(shè)計(jì)一條生物素標(biāo)記的測(cè)序引物，當(dāng)引物與單鏈模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒

40、光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。所需試劑包括樣本處理試劑、核酸擴(kuò)增試劑、單鏈模板制備試劑、焦磷酸測(cè)序試劑和陽(yáng)性質(zhì)控品五大類(lèi)。所需儀器為PCR儀和焦磷酸測(cè)序儀。為避免假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，應(yīng)嚴(yán)格區(qū)分陽(yáng)性質(zhì)控品和反應(yīng)試劑的使用，防止因試劑污染致假陽(yáng)性發(fā)生。該方法的主要優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)靈敏度較高，對(duì)體細(xì)胞突變和甲基化等可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)；分型準(zhǔn)確可靠，通量較高，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)靈活，可發(fā)現(xiàn)新的突變或遺傳變異。主要缺點(diǎn)：對(duì)試劑和儀器有特殊要求，不易普及；檢測(cè)靈敏度有限，對(duì)腫瘤組織中的低豐度體細(xì)胞

41、突變（<3）容易出現(xiàn)假陰性；測(cè)序長(zhǎng)度僅10多個(gè)堿基，不能對(duì)長(zhǎng)片段進(jìn)行分析。3）實(shí)時(shí)熒光PCR法根據(jù)檢測(cè)原理的不同，實(shí)時(shí)熒光PCR法可分為探針?lè)ê头翘结樂(lè)▋煞N，前者利用與靶序列特異雜交的探針（Taqman和分子信標(biāo)）來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，后者利用熒光染料或特殊設(shè)計(jì)的引物來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。Taqman探針?lè)ㄍ瑫r(shí)綜合了5端核酸酶活性和熒光等技術(shù)，其在反應(yīng)過(guò)程使用4條寡核苷酸鏈，其中兩條為等位基因特異性探針，兩條為PCR引物。兩條探針可分別與突變型和野生型模板互補(bǔ)，其兩端分別應(yīng)用含報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的染料進(jìn)行標(biāo)記，兩條探針的報(bào)告基團(tuán)熒光染料不一樣。在進(jìn)行SNP檢測(cè)時(shí)，PCR擴(kuò)增的退火過(guò)程導(dǎo)致

42、探針與模板雜交結(jié)合，當(dāng)引物延伸至探針處時(shí)，DNA聚合酶的5端外切酶活性將探針的5端報(bào)告基團(tuán)從探針上切除，使之與淬滅基團(tuán)分離，從而釋放出相對(duì)應(yīng)的熒光，而沒(méi)有配對(duì)的探針仍然保持完整而不會(huì)發(fā)熒光。不同的等位基因探針由于標(biāo)記的熒光染料不同，因此所發(fā)熒光信號(hào)不同，可通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)判斷樣本的基因型。實(shí)時(shí)熒光PCR法靈敏度高，分型準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便快捷，所用儀器容易普及，易于推廣使用。但該方法通量不高，探針成本較高，單個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)成本與樣本量有關(guān)，樣本量越小，成本越高。本方法主要適于對(duì)少量位點(diǎn)、大樣本進(jìn)行分型。目前CFDA已批準(zhǔn)CYP2c9、VKORC1等多種基因多態(tài)性檢測(cè)的PCR-熒光檢測(cè)試劑盒。4)

43、PCR-基因芯片法該方法以特定的寡核苷酸片段作為探針，將其有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后將樣品DNA通過(guò)PCR擴(kuò)增、熒光標(biāo)記等程序，按堿基配對(duì)原理與芯片雜交，再通過(guò)熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)芯片上的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)和分析，從而迅速獲得個(gè)體的基因型信息。基因芯片分型法的操作過(guò)程包括PCR核酸擴(kuò)增、雜交、芯片掃描和結(jié)果分析。該方法用于DNA基因分型時(shí)屬于定性檢測(cè)，靈敏度為50ng/仙L基因芯片法分析時(shí)需設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性質(zhì)控品。應(yīng)用基因芯片檢測(cè)試劑盒時(shí)應(yīng)確保試劑在開(kāi)封前按要求保存、各組分液體使用前振蕩混勻，雜交和洗片操作務(wù)必在避光條件下進(jìn)行，PCR反應(yīng)液和定位參照需避光保存，芯片加樣時(shí)注意使液體鋪滿(mǎn)整個(gè)反應(yīng)

44、區(qū)，但不能溢出、不能出現(xiàn)氣泡，以防交叉污染。其主要優(yōu)點(diǎn)是可同時(shí)對(duì)多個(gè)待測(cè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。我國(guó)CFDA已批準(zhǔn)多種用于藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因如ALDH2、CYP2C9、CY2C19、CYP2D6、ADR1、ACE、VKORC1多態(tài)性檢測(cè)的基因芯片試劑盒。5) PCR-電泳分析該方法是指對(duì)待分析的目的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳或毛細(xì)管電泳分析，根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小對(duì)基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。該方法屬于定性檢測(cè)，且只能用于對(duì)已知的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，不能識(shí)別未知多態(tài)性。瓊脂糖電泳法適用于對(duì)片段較長(zhǎng)的插入缺失多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，如ACE插入缺失多態(tài)性；毛細(xì)管電泳法適于對(duì)較短的插

45、入缺失多態(tài)性如UGT1A1*28多態(tài)性和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)進(jìn)行檢測(cè)。PCR過(guò)程中需建立陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，電泳分析時(shí)需同時(shí)用分子量標(biāo)記物進(jìn)行片段大小的判斷。當(dāng)分子量標(biāo)記物反應(yīng)管無(wú)條帶或出現(xiàn)較弱的條帶時(shí)，可能的原因包括點(diǎn)樣孔漏、熒光染料不夠或失效、電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或電壓過(guò)大。該方法的優(yōu)點(diǎn)是成本低，在普通實(shí)驗(yàn)室即可開(kāi)展；缺點(diǎn)是只適合對(duì)DNA插入/缺失多態(tài)性或融合基因進(jìn)行定性測(cè)定，不能用于SNP的檢測(cè)。6) PCR-高分辨率熔解曲線(xiàn)(HRM)法該方法通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)的熔解曲線(xiàn)分析進(jìn)行基因分型。PCR擴(kuò)增的熔解曲線(xiàn)取決于其擴(kuò)增序列，序列中一個(gè)堿基的差異都可導(dǎo)致雙鏈DNA的解鏈溫度發(fā)生變化。HRM

46、法應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀監(jiān)測(cè)這種細(xì)微的溫度變化，確定所擴(kuò)增的目的片段中是否存在突變，從而用于基因分型。HRM分析使用LCGreen等飽和熒光染料，該類(lèi)染料在飽和濃度時(shí)對(duì)PCR反應(yīng)無(wú)抑制作用，因此可以高濃度使用，從而全部結(jié)合DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝。在雙鏈DNA的變性過(guò)程不存在熒光分子的重排，其特異度得到大幅提升，因此，熔解曲線(xiàn)細(xì)微的變化可以反映擴(kuò)增片段中堿基的差異。應(yīng)用本方法進(jìn)行基因分型屬于定性分析。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、通量大、使用成本低、結(jié)果準(zhǔn)確，有利于實(shí)現(xiàn)閉管操作，在進(jìn)行甲基化檢測(cè)時(shí)可根據(jù)熔解曲線(xiàn)確定甲基化程度的高低。該方法的缺點(diǎn)是：不能排除待測(cè)核酸中新出現(xiàn)的遺傳變異；由于單個(gè)堿基突變

47、導(dǎo)致DNA解鏈溫度的變化非常小，該方法對(duì)儀器的靈敏度和分辨率有較高要求。7)等位基因特異性PCR(Allele-specificPCR，AS-PCR)又稱(chēng)為擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR(AmplificationRefractoryMutationSystemPCR，ARMS-PCR)。該技術(shù)的基本原理：由于TaqDNA聚合酶缺乏3'到5'端的外切酶活性，3端錯(cuò)配的堿基會(huì)導(dǎo)致引物延伸速度變慢，當(dāng)錯(cuò)配達(dá)到一定程度時(shí)，引物延伸將終止，得不到特異長(zhǎng)度的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，從而提示模板DNA沒(méi)有與引物3端配對(duì)的堿基，反之則有。因此，AS-PCR反應(yīng)需要兩條等位基因特異的引物和一條共用的反向引物，

48、兩條非特異性引物在3端與模板錯(cuò)配，但其他部分堿基序列完全一樣。只有引物的3端與模板完全配對(duì)時(shí)，PCR擴(kuò)增才可以進(jìn)行。PCR產(chǎn)物可通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行分析和基因型的判斷。該方法也可與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)合起來(lái)進(jìn)行基因分型。該方法可以用于檢測(cè)各種類(lèi)型的SNP,其優(yōu)勢(shì)是靈敏度高，特別適合于對(duì)月中瘤組織中的體細(xì)胞突變進(jìn)行檢測(cè)；缺點(diǎn)是假陽(yáng)性率較高。8）PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法（RFLP）是一種基于酶切原理的方法，是最早用于基因分型的經(jīng)典方法之一，現(xiàn)在仍被廣泛采用。該方法主要基于某些限制性?xún)?nèi)切酶可以特異性識(shí)別某一特定序列和結(jié)構(gòu)DNA,并對(duì)其進(jìn)行剪切的原理。限制性?xún)?nèi)切酶通常識(shí)別雙

49、鏈DNA的某一特定序列，并在特定位置或者附近將雙鏈DNA切斷，從而產(chǎn)生較短的DNA片段。由于限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列的嚴(yán)格性，一個(gè)堿基的變化都可以導(dǎo)致酶切活性的消失。利用這一特性，若待分型的SNP位點(diǎn)在某一限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)上，將會(huì)導(dǎo)致該酶只對(duì)其中的一種等位基因具有酶切活性。因此，對(duì)位于限制性酶切識(shí)別位點(diǎn)的SNP進(jìn)行分型時(shí)，可以使用包含該位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物與相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行溫育。酶切以后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，并根據(jù)酶切產(chǎn)物片段的大小來(lái)進(jìn)行基因分型。該方法不需要任何探針，也不需要特別的儀器設(shè)備，成本較低，實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)。但缺點(diǎn)也很明顯，主要是通量太低，大量分型時(shí)工作量大，并且只適用于部分

50、SNP分型9）原位雜交（ISH）法ISH法以各種人體標(biāo)本，包括相應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法制備的細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)標(biāo)本（福爾馬林固定石蠟包埋）作為靶標(biāo)，采用目的DNA探針與該靶標(biāo)進(jìn)行分子雜交，從而檢測(cè)相關(guān)的靶基因異常。ISH技術(shù)按照探針標(biāo)記物的類(lèi)型，可分為亮視野原位雜交和熒光原位雜交（FISH）。ISH法檢測(cè)的靶標(biāo)具有完整的細(xì)胞核，無(wú)需進(jìn)行核酸的提取。其具體的方法學(xué)原理見(jiàn)原位雜交（ISH）指南。在藥物代謝酶和靶點(diǎn)基因檢測(cè)中，ISH法主要用于測(cè)定基因擴(kuò)增和基因缺失異常。表1.各種藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)及適用性比較方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)適用性AS-PCR靈敏度高，適于對(duì)對(duì)小樣本、低突變比例的月中瘤組織中突變

51、體細(xì)胞突變進(jìn)行檢測(cè)。比例較低的體細(xì)胞突變進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光PCR通量較高，操作簡(jiǎn)探針較昂貴對(duì)相同位點(diǎn)、大樣本標(biāo)本45焦磷酸測(cè)序HRMSanger法測(cè)序PCR-RFLP基因芯片法原位雜交(ISH)單，儀器設(shè)備易普及。高通量，高靈敏需要特殊儀器設(shè)度，可以檢測(cè)插入/缺失突變和未知突變。等位基因含量的比例可用于室內(nèi)質(zhì)控。成本低，靈敏度高，閉管操作，降低污染風(fēng)險(xiǎn)。直接獲取序列，分型的金標(biāo)準(zhǔn)，可發(fā)現(xiàn)未知突變。無(wú)需特殊的儀器設(shè)備，成本較低,實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)。在細(xì)胞核原位對(duì)基因的異常進(jìn)行檢測(cè)備。需要特殊儀器設(shè)備，條件摸索過(guò)程較為困難通量低，不能檢測(cè)突變比例小于20%的SNP。通量低，只適用于部分SNP

52、分型靈活度低，成本高，需要特殊的儀器設(shè)備。成本高，通量低,時(shí)間較長(zhǎng)。5.2.3藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)項(xiàng)目及類(lèi)型遺傳藥理學(xué)知識(shí)庫(kù)（PharmGKB）為4級(jí)，并認(rèn)為其中1級(jí)項(xiàng)目（包括級(jí)項(xiàng)目適于臨床應(yīng)用的證據(jù)最少1。進(jìn)行檢測(cè)，可用于mRNA表達(dá)檢測(cè)。適合于較大樣本、突變比例高于5%的各種類(lèi)型SNP檢測(cè)、甲基化位點(diǎn)的確定。適合有該類(lèi)機(jī)器的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展各種類(lèi)型SNP分型研究；可用于已知甲基化位點(diǎn)的檢測(cè)。各種SNP的檢測(cè)，未知突變的篩查以及驗(yàn)證其他分型的結(jié)果。適用于無(wú)條件夠買(mǎi)貴重儀器設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展小樣本的分型檢測(cè)。適用于具備芯片檢測(cè)能力的實(shí)驗(yàn)室對(duì)已知固定位點(diǎn)、大樣本標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。適于對(duì)基因擴(kuò)增和

53、缺失異常進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)項(xiàng)目成熟程度將個(gè)體化用藥基因檢測(cè)項(xiàng)目分1A級(jí)和1B級(jí)）滿(mǎn)足臨床應(yīng)用的最高標(biāo)準(zhǔn)，而41A級(jí)項(xiàng)目為同時(shí)獲臨床遺傳藥理學(xué)實(shí)施聯(lián)盟（ClinicalPharmacogeneticsImplementationconsortium，CPIC）、認(rèn)可CPIC藥物基因組學(xué)指南的醫(yī)學(xué)會(huì)、以及美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院藥物基因組學(xué)研究網(wǎng)絡(luò)（PharmagenomicsResearchNetwork，PGRN）認(rèn)同的項(xiàng)目，這類(lèi)項(xiàng)目通常經(jīng)大規(guī)模隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)（RCT）對(duì)項(xiàng)目的意義進(jìn)行了論證；1B級(jí)項(xiàng)目有確切的臨床證據(jù)提示相關(guān)性，且這種相關(guān)性被具有一定樣本規(guī)模的研究所證實(shí)，但還需進(jìn)一步的臨床證據(jù)。根據(jù)

54、檢測(cè)項(xiàng)目所涉及的基因在影響藥物反應(yīng)中的作用機(jī)制和被測(cè)靶分子（DNA或RNA）的不同，個(gè)體化用藥分子檢測(cè)項(xiàng)目包括藥物代謝酶與轉(zhuǎn)運(yùn)體基因遺傳多態(tài)性檢測(cè)、藥物作用靶點(diǎn)基因遺傳變異檢測(cè)、其他基因變異檢測(cè)和藥物作用靶點(diǎn)基因mRNA表達(dá)檢測(cè)四種類(lèi)型（附錄C）。5.3 儀器設(shè)備的使用、維護(hù)與保養(yǎng)原則上按照個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南的要求進(jìn)行。藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)涉及的儀器設(shè)備眾多，實(shí)驗(yàn)室可參考生產(chǎn)商提供的操作說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)書(shū)面的、有案可查的預(yù)防性維護(hù)及校準(zhǔn)計(jì)劃，確定儀器設(shè)備的維護(hù)周期，建立儀器設(shè)備日常維護(hù)的SOP。對(duì)于某些計(jì)量分析儀器，應(yīng)依照我國(guó)計(jì)量法規(guī)定，由計(jì)量檢定機(jī)構(gòu)定期進(jìn)行校驗(yàn)，并保存好校驗(yàn)證

55、書(shū)。加熱系統(tǒng)及冰箱等設(shè)備的維護(hù)包括對(duì)溫度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。儀器維護(hù)過(guò)程中要注意清潔劑的使用，尤其是儀器的光路系統(tǒng)。每臺(tái)儀器應(yīng)該配備專(zhuān)用的清潔工具。在例行儀器的維護(hù)和保養(yǎng)后，應(yīng)填寫(xiě)儀器維護(hù)保養(yǎng)記錄表。如維護(hù)中發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，應(yīng)及時(shí)匯報(bào)并將出現(xiàn)的問(wèn)題詳細(xì)記錄，最后由維護(hù)操作人員簽名。5.4 人員培訓(xùn)原則上按照個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南的要求進(jìn)行。藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)通常要涉及試劑配制、核酸提取、儀器編程、結(jié)果分析和報(bào)告等步驟。操作人員需要有一定的專(zhuān)業(yè)技術(shù)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)才能獲得穩(wěn)定可靠的檢測(cè)結(jié)果。加強(qiáng)人員培訓(xùn)是確保檢測(cè)質(zhì)量的關(guān)鍵。人員培訓(xùn)分為入職培訓(xùn)、內(nèi)部培訓(xùn)和外部培訓(xùn)。通過(guò)培訓(xùn)，讓操作人員掌握和建立安全

56、操作的概念、“防污染”的概念、具備獨(dú)立進(jìn)行質(zhì)控活動(dòng)和儀器維護(hù)的能力，可對(duì)試劑和質(zhì)控品的出入庫(kù)及使用情況、設(shè)備保養(yǎng)等情況進(jìn)行準(zhǔn)確記錄，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)室工作人員在培訓(xùn)后書(shū)面確認(rèn)其已接受適當(dāng)?shù)呐嘤?xùn)，閱讀并理解了相關(guān)SOP。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員進(jìn)行處事能力考核和周期性能力再考核，定期開(kāi)展內(nèi)部培訓(xùn)。外部培訓(xùn)包括國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委臨床檢驗(yàn)中心和國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)培訓(xùn)基地等機(jī)構(gòu)組織開(kāi)展的各種技術(shù)培訓(xùn)。5.5 檢測(cè)體系的性能驗(yàn)證原則上按照個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南的要求進(jìn)行。臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的體外診斷試劑包括國(guó)家藥品食品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)的試劑盒和國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)試點(diǎn)單位通過(guò)性能評(píng)定、具有嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）的自配試劑（LDT）o所有試劑都需進(jìn)行性能評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)室所購(gòu)買(mǎi)的商業(yè)化的儀器應(yīng)根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行驗(yàn)證。在報(bào)告結(jié)果之前實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該證明其性能能