液體乳中三聚氰胺的快速檢測膠體金免疫層析法

1、附件7液體乳中三聚氰胺的快速檢測膠體金免疫層析法（征求意見稿）1范圍本方法規(guī)定了液體乳中三聚氰胺的膠體金免疫層析快速檢測方法。 本方法適用于巴氏殺菌乳、滅菌乳、調(diào)制乳和發(fā)酵乳中三聚氰胺的快速測定。2原理本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的三聚氰胺與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和試紙條或檢測卡中檢測線（T線）上抗原的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測線顏色深淺的變化。 通過檢測線與控制線（C線）顏色深淺比較，對(duì)樣品中三聚氰胺進(jìn)行定性判定。3試劑和材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。3.1試劑3.1.1 甲醇。3.1.2 三羥甲基氨基甲烷（Tris ）。3.

2、1.3 1mol/L鹽酸：移取79.36mL濃鹽酸，加水100mL水中，定容至1L。甲醇水溶液：準(zhǔn)確量取 50 mL甲醇和50 mL水，混勻后備用。3.1.5 稀釋液：準(zhǔn)確稱取 6.05 g Tris（ ）和 8.5 g 1 mol/L鹽酸（），加水定容至1 L ,混勻 后備用。3.2參考物質(zhì)參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量見表1，純度 99%表1三聚氰胺參考物質(zhì)中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量中文名稱英文名稱CAS登錄號(hào)分子式相對(duì)分子質(zhì)量三聚氰胺Melami ne108-78-1C3H6N 6126.12注：或等同可溯源物質(zhì)。3.2）適量

3、，置于10 mL容量1 mg/mL的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ) 3個(gè)月。3.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 mg/mL ）:精密稱取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（ 瓶中，用甲醇水溶液（）溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為 備液；或可直接購三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。4C避光保存?zhèn)溆?，有效?.4 材料三聚氰胺膠體金免疫層析試劑盒：適用基質(zhì)為液體乳。3.4.1 金標(biāo)微孔（含膠體金標(biāo)記的特異性抗體）。3.4.2 試紙條或檢測卡。4 儀器和設(shè)備4.1 移液器：200 L、1000 k 和 5 mL。4.2 渦旋混合器。4.3 電子天平：感量為 0.01 g。4.4 環(huán)境條件：溫度 15 35C，濕度 80%5 分析步驟5.1

4、 試樣制備取適量有代表性樣品充分混勻。5.2 試樣提取準(zhǔn)確稱取樣品0.5 g于離心管中，加入 5 mL稀釋液（）,渦旋混勻提取5 min，即得待測 液。5.3 測定步驟5.3.1 試紙條與金標(biāo)微孔測定步驟吸取150200 kL羊品待測液于金標(biāo)微孔（3.4.1 ）中，抽吸510次使混合均勻，不要有氣泡， 40C溫育3 min，將檢測試紙條（）樣品端垂直向下插入金標(biāo)微孔中，40 C溫育5 min，從微孔中取出試紙條，進(jìn)行結(jié)果判定。5.3.2 檢測卡測定步驟吸取150 200 kL羊品待測液于檢測卡加樣孔（）中，室溫反應(yīng)35 min，進(jìn)行結(jié)果判定。5.4 質(zhì)控試驗(yàn)每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和加標(biāo)質(zhì)控

5、試驗(yàn)。5.4.1 空白試驗(yàn)稱取空白試樣，按照 5.2和5.3步驟與樣品同法操作。5.4.2 加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取空白試樣100 g （精確至0.01 g）置于100 mL玻璃溶液瓶中，加入 250 k三聚氰胺標(biāo) 準(zhǔn)溶液（1 mg/mL ）（），使試樣中三聚氰胺濃度為 2.5 mg/kg，按照5.2和5.3步驟與樣品同法 操作。6 結(jié)果判定要求通過對(duì)比控制線（C線）和檢測線（T線）的顏色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。目視結(jié)果判讀如圖1。6.1 無效控制線（C線）不顯色，表明不正確操作或試紙條/檢測卡無效。6.2 陽性結(jié)果消線法檢測線（T線）不顯色，控制線（C線）顯色，表明樣品中三聚氰胺含量高于方法檢測限，

6、判定為陽性。6.2.2 比色法檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色淺或幾乎不顯色，表明樣品中三聚氰胺含量高于方 法檢測限，判定為陽性。6.3陰性結(jié)果消線法檢測線（T線）、控制線（C線）均顯色，表明樣品中三聚氰胺含量低于方法檢測限，判定為 陰性。6.3.2 比色法檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色深或者檢測線（T線）顏色與控制線（C線）顏色相 當(dāng)，表明樣品中三聚氰胺含量低于方法檢測限，判定為陰性。-一二一rr-nU圖1試紙條/檢測卡目視判定示意圖6.4質(zhì)控試驗(yàn)要求空白試驗(yàn)測定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)測定結(jié)果應(yīng)為陽性。7結(jié)論三聚氰胺與滅蠅胺有交叉反應(yīng)，當(dāng)檢測結(jié)果為陽性時(shí)，應(yīng)對(duì)三聚氰胺結(jié)果進(jìn)

7、行確證。8性能指標(biāo)8.1檢測限：2.5mg/kg 。8.2靈敏度：靈敏度應(yīng) > 99%8.3特異性：特異性應(yīng) > 85%8.4假陰性率：假陰性率應(yīng)< 1%8.5假陽性率：假陽性率應(yīng)< 15%注：性能指標(biāo)計(jì)算方法參見附錄A。9 其他本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時(shí)不做 限定，可根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。方法使用者應(yīng)使用經(jīng)過驗(yàn)證的滿足本方法規(guī)定的各項(xiàng)性能 指標(biāo)的試劑、試劑盒。本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法( GB/T 22388-2008)。本方法使用試劑盒可能與滅蠅胺存在交叉反應(yīng)，當(dāng)結(jié)果判定為陽

8、性時(shí)，應(yīng)采用實(shí)驗(yàn)室儀器方 法食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法(GB/T 22388-2008 )對(duì)三聚氰胺結(jié)果進(jìn)行確證。附錄A快速檢測方法性能指標(biāo)計(jì)算表表A.1性能指標(biāo)計(jì)算方法樣品情況a檢測結(jié)果b總數(shù)陽性陰性陽性N11N12N1.=N11+N12陰性N21N22N2.=N21+N22總數(shù)N.1=N11+N21N.2=N12+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2顯著性差異（X）2 2x= ( |N12-N21|-1 )/ ( N12+N21 ),自由度(df) =1靈敏度（P+, %）p+=N11/N1.特異性（P-, %）p-=N22/N2.假陰性率（pf-, %）pf-=N12/N1.=100-靈敏度假陽性率（pf+, %）pf+-N21/N2=100-特異性相對(duì)準(zhǔn)確度，%c(N11+N22 ) /(N1.+N2.)注：a由參比方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果或者樣品中實(shí)際的公議值結(jié)果； b由待確認(rèn)方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果。靈敏度的計(jì)算使用確認(rèn)后的結(jié)果。N :任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個(gè)下標(biāo)指行，第二個(gè)下標(biāo)指列。例如：N11表示第一行，第 列，N1.表示所有的第 行，N.2表示所有的第二列； N12表示第 行，第二列