第二章基因工程習(xí)題答案

1、基因工程課程習(xí)題選擇題001基因工程操作的三大基本元件是【A】I 供體 II 受體 III 載體 IV 抗體 V 配體I + II + IIII + III + IVII + III + IVII + IV + VIII + IV + V002 根據(jù)當(dāng)今生命科學(xué)理論，基因工程的用途是【E】I 分離純化基因II 大量生產(chǎn)生物分子III 構(gòu)建新型物種IV 提高基因重組效率I + II + IIII + II + IVI + III + IVII + III + IVI + II + III + IV003 根據(jù)基因工程的定義，下列各名詞中不能替代基因工程的是【A】基因誘變分子克隆DNA 重組遺傳工

2、程基因無(wú)性繁殖004 基因工程的單元操作順序是【B】接檢切轉(zhuǎn)檢 見(jiàn)憚格憚軌 格禮憚挑憚 禮提禮見(jiàn)掾 增，轉(zhuǎn)，檢，切，接 切，接，轉(zhuǎn)，增，檢 接，轉(zhuǎn)，增，檢，切 檢，切，接，增，轉(zhuǎn) A B c D E005 下列有關(guān)基因的敘述，錯(cuò)誤的是【A】蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的唯一產(chǎn)物基因是 DNA 鏈上具有編碼功能的片段基因也可以是RNA基因突變不一定導(dǎo)致其表達(dá)產(chǎn)物改變結(jié)構(gòu)基因具有方向性D】006 限制性核酸內(nèi)切酶是由細(xì)菌產(chǎn)生的，其生理意義是A修復(fù)自身的遺傳缺陷B促進(jìn)自身的基因重組C強(qiáng)化自身的核酸代謝D提高自身的防御能力E補(bǔ)充自身的核甘酸消耗007 天然 PstI 限制性內(nèi)切酶的來(lái)源是【 D】A Bacillu

3、s amyloliquefaciensB Escherichia coliC Haemophilus influenzaeD Providencia stuartiiE Streptomyces lividans008 T 4 -DNA 連接酶是通過(guò)形成磷酸二酯鍵將兩段DNA 片段連接在一起，其底物的關(guān)鍵基團(tuán)是 【 D】A 2' -OH 和 5' -PB 2' -OH 和 3' -PC 3' -OH 和 2' -PD 3' -OH 和 5' -PE 5' -OH 和 3' -P009 若載體 DNA 用 M 酶切開(kāi)

4、，則下列五種帶有N 酶粘性末端的外源DNA 片段中，能直接與載體拼接的是【 D】MNA A/AGCTT T/TCGAAB C/CATGG ACATG/TC CCC/GGG G/GGCCCD G/GATCC A/GATCTE GAGCT/C G/AGCTC010 下列有關(guān)質(zhì)粒分子生物學(xué)的敘述，錯(cuò)誤的是【 B】A質(zhì)粒是共價(jià)環(huán)狀的雙鏈DNA分子B天然質(zhì)粒一般不含有限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列C質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立于染色體DNA自主復(fù)制D松弛復(fù)制型的質(zhì)?？捎寐让顾?cái)U(kuò)增E質(zhì)粒并非其宿主細(xì)胞生長(zhǎng)所必需011 帶有多個(gè)不同種復(fù)制起始區(qū)的質(zhì)粒是【 A】A穿梭質(zhì)粒B表達(dá)質(zhì)粒C探針質(zhì)粒D整合質(zhì)粒E多拷貝質(zhì)粒012 下

5、列各常用載體的裝載量排列順序，正確的是【 A】A Cosmid > 入-DNA > PlasmidB 入-DNA > Cosmid > PlasmidC Plasmid > 入-DNA > CosmidD Cosmid > Plasmid > 入-DNAE 入-DNA > Plasmid > Cosmid013 目前在高等動(dòng)物基因工程中廣泛使用的載體是【 C】A質(zhì)粒DNAB噬菌體DNAC病毒DNAD線粒體DNAE葉綠體DNA014 若某質(zhì)粒帶有l(wèi)acZ 標(biāo)記基因，那么與之相匹配的篩選方法是在篩選培養(yǎng)基中加入【 D】A半乳糖B葡萄糖C蔗

6、糖D 5-澳-4-氯-3- 口引味基-b -D-半乳糖昔（X-gal ）E異丙基疏基-b -半乳糖昔（IPTG ）015質(zhì)粒是基因工程中最常用的運(yùn)載體，它的主要特點(diǎn)是【C】能自主復(fù)制不能自主復(fù)制結(jié)構(gòu)很小蛋白質(zhì)環(huán)狀 RNA 環(huán)狀 DNA能“友好”地“借居”A B C D 016 雙脫氧末端終止法測(cè)定DNA 序列是基于【 A】A DNA的聚合反應(yīng)B DNA的連接反應(yīng)C DNA的降解反應(yīng)D特殊的DNA連接酶E聚合單體2'和5'位的脫氧017 下列三種方法中，能有效區(qū)分重組子與非重組子的是【 E】I 限制性酶切II PCR 擴(kuò)增 III 抗藥性篩選A IB I + IIC I + II

7、ID II + IIIE I + II + III018鳥(niǎo)槍法克隆目的基因的戰(zhàn)略適用于IA1A原核細(xì)菌B酵母菌C絲狀真菌D植物E人類019 cDNA第一鏈合成所需的引物是【D】A Poly AB Poly CC Poly GD Poly TE發(fā)夾結(jié)構(gòu)020 Taq DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)使得 PCR技術(shù)的廣泛運(yùn)用成為可能，這是因?yàn)椤綝】A Taq DNA聚合酶能有效地變性基因擴(kuò)增產(chǎn)物B Taq DNA 聚合酶催化的聚和反應(yīng)不需要引物C Taq DNA聚合酶具有極強(qiáng)的聚和活性D Taq DNA聚合酶能使多輪擴(kuò)增反應(yīng)連續(xù)化E Taq DNA 聚合酶能使擴(kuò)增反應(yīng)在DNA變性條件下進(jìn)行021為了利用DPC

8、R技術(shù)擴(kuò)增下列染色體 DNA片段上的虛線部分，應(yīng)選用的引物順序是(III)3 1 CGGAGGBGCG。5 '3 1 年GCGGG工gC5 ' CTCGCCTGGHSGGHCGHGJlGrCGGRGGCCGC0OCGGGCGCCGCCGCCCACG3, G AGrCGG AGC CCC CG C CCTC J ；GC CTCCGGCGCGGCCCGCGGCGMSrCfrGGT«C5 1 GCCTCGCGGCCG 315 1 CCGCCCACCJ(H)(IV)A I + II B I + III C I + IV D II + III E II + IV022構(gòu)建基因文

9、庫(kù)一般使用的載體是【E】I 質(zhì)粒 II 入-DNA III CosmidA IB IIIIIII + IIII + II + III023 強(qiáng)化基因轉(zhuǎn)錄的元件是【 C】A密碼子B復(fù)制子C啟動(dòng)子D內(nèi)含子E外顯子024 啟動(dòng)子的特征之一是【 B】A GC富積區(qū)B TATA BoxC轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)D長(zhǎng)度平均 1 kbE含有某些稀有堿基025 下列基因調(diào)控元件中屬于反式調(diào)控元件的是【 A】A阻遏蛋白B啟動(dòng)子C操作子D終止子E增強(qiáng)子026 包涵體是一種【 E】A受體細(xì)胞中難溶于水的蛋白顆粒B大腸桿菌的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)C噬菌體或病毒DNA的體外包裝顆粒D用于轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞的脂質(zhì)體E外源基因表達(dá)產(chǎn)物的混合物027外源

10、基因在大腸桿菌中以融合蛋白的形式表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)是【E】I 融合基因能穩(wěn)定擴(kuò)增II 融合蛋白能抗蛋白酶的降解III 表達(dá)產(chǎn)物易于親和層析分離A IIIB I + IIC I + IIID II + IIIE I + II + III028 第二代基因工程是指【 C】A途徑工程B代謝工程C蛋白質(zhì)工程D RNA基因工程 E細(xì)胞器基因工程029基因工程菌中重組質(zhì)粒的丟失機(jī)制是【C】A重組質(zhì)粒滲透至細(xì)胞外B重組質(zhì)粒被細(xì)胞內(nèi)核酸酶降解C重組質(zhì)粒在細(xì)胞分裂時(shí)不均勻分配D重組質(zhì)粒殺死受體細(xì)胞E重組質(zhì)粒刺激受體細(xì)胞提高其通透性030利用毛細(xì)管作用原理，將凝膠電泳分離后的DNA片段轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上并根據(jù)核酸雜交原

11、理進(jìn)行分析的技術(shù)是【D】A Western 印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)B Northern 印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)C基因的表現(xiàn)型分析法D Southern 印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)031在翻譯過(guò)程中.mRNA必需首先與核糖體相結(jié)合才能進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。在原核生物中， mRNA分子上有兩個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)是起始密碼AUG ,另一個(gè)是【C】A啟動(dòng)子B調(diào)節(jié)基因C SD序列 D終止子二、填空題答案1、n型限制性內(nèi)切酶可特異性地識(shí)別呈雙重螺旋對(duì)稱結(jié)構(gòu)的特定雙鏈 DNA序列 并進(jìn)行切割。如Bst BI (tT CGAA )消化可產(chǎn)生 含5 ' CG 3'的5'磷?；损ば阅┒?末 端，Pst I (CTGCaQ )

12、消化可產(chǎn)生 5' TGCA 3 '的3' OH端黏性末端，而Sma I (CcCGGG)消化產(chǎn)生平 末端。2、識(shí)別順序相同但切割位點(diǎn)不同者稱同位一酶，識(shí)別順序與切割方式均相同者稱也酶，來(lái)源與識(shí)別順序均不同，但切割后形成的限制性片段有相同的粘性末端，稱 同尾酶。3、受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法(如：CaCl2等化學(xué)試劑法)的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許有外源 DNA的載體分子通過(guò)，這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。4、在翻譯過(guò)程中，mRNA必需首先與核糖體相結(jié)合才能進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。在原核生物中，mRNA分子上有兩個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)是起始密碼AUG ,另一個(gè)是 SD序列

13、 。5、在提取分離 DNA的過(guò)程中，加入酚-氯仿、去垢劑或酶的目的是使蛋白質(zhì)變性或水解，除去蛋白質(zhì) ,使用金屬離子螯合劑如 EDTA等的原因 是細(xì)胞內(nèi)有金屬離子，如 Mg2+,是 酶活性的輔助因子，會(huì)使 DNA被DNase分解，故除去使 DNase活性的 Mg2+以保護(hù)DNA 不被變性或降解。在小批量堿變性提取質(zhì)粒過(guò)程中加入醇溶液的目的是是DNA變性沉淀，并除去蛋白質(zhì)、糖類等其他水溶性雜質(zhì)， 使之分離,加入 Rnase的目的是 除去 DNA沉淀中的RNA ,是凝膠電泳檢測(cè)時(shí)條帶更明顯。6、PCR的全稱是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它是一種在體外模擬DNA復(fù)制方式選擇性地?cái)U(kuò)增DNA特殊區(qū)域的技術(shù)。它是在四種

14、 脫氧核昔三磷酸 存在下，以寡聚核甘酸為引物及 單鏈DNA 為模板，經(jīng)DNA聚合酶催化合成 DNA互補(bǔ)鏈的過(guò)程，其基本反應(yīng)步驟為高溫變性 、低溫退火和適溫延伸，并循環(huán)n次，達(dá)到擴(kuò)增目的。7、采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子或其他生物樣品有序地固化于 支持物表面，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中靶分子雜交，通過(guò)特定儀器對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測(cè)分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量的技術(shù)稱為生物芯片技丕，根據(jù)固定的探針不同，可分為 基因芯片 、蛋白芯片、組胞芯片和組織芯片。該技術(shù)具有高通量、快速高效、高度靈敏等特點(diǎn)。8、根據(jù)Southern blot的結(jié)果可以說(shuō)明被檢測(cè)樣

15、品中的 DNA 及其含量.了解基因的狀態(tài)，如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等，Northern blot則用于檢測(cè)樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA ）及其含量 ，而 Western blot的結(jié)果可以明被檢測(cè)基因在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)狀況 。9、基因工程中用來(lái)獲得有功能的異源蛋白質(zhì)的體系稱為表達(dá)系統(tǒng)。10、用火藥爆炸或者高壓氣體加速將包裹了DNA的球狀金粉或者鴇粉顆粒直接送入完整的植物組織或者細(xì)胞中，這一方法稱為基因槍法 ?；蚬こ陶n程習(xí)題問(wèn)答題1、基因工程的操作過(guò)程的主要步驟包括哪些? 切、接、轉(zhuǎn)、增、篩（檢）用內(nèi)切 舞切割,分裂也 來(lái)增殖方法：從生物基因組中分離得到一一基因組DNA酶切產(chǎn)物(1

16、)切獲得DNA片段，取得目的基因；載體的選擇與制備。從總RNA中分離得到 mRNA ,再逆轉(zhuǎn)錄得到 cDNA人工合成一一化學(xué)合成；PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))(2)接一一DNA片段和載體DNA在體外連接，形成重組子。(3)轉(zhuǎn)一一將重組的DNA引入宿主細(xì)胞人式：轉(zhuǎn)化一一某一基因型細(xì)胞從周圍介質(zhì)中吸收另一基因型細(xì)胞的DNA ,而使其基因型和表型發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象；轉(zhuǎn)染一一除去蛋白質(zhì)外殼的病毒核酸感染細(xì)胞或原生質(zhì)體的過(guò)程；轉(zhuǎn)導(dǎo)一一用噬菌體做載體，將一個(gè)細(xì)胞的基因傳遞給另一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。還有顯微注射等。(4)增一一培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使目的基因在其中進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增，并將其整合到受體細(xì)胞的基因組中。(5)篩、

17、檢一一重組子的篩選與鑒定。篩選和鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得使外源基因高效表達(dá)的基因工程菌或細(xì)胞。2、什么是限制性核酸內(nèi)切酶？第二型限制酶有何特點(diǎn)？限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶，restriction endonuclease)是一類能夠識(shí)別雙鏈 DNA 分子中的某些特定核甘酸序列，并對(duì)DNA分子進(jìn)行切割的核酸內(nèi)切酶。第二型限制酶特點(diǎn)：2亞基，單輔因子；識(shí)別序列是由4、5、6或7個(gè)核甘酸組成的特定核昔酸序列，識(shí)別位點(diǎn)雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱結(jié)構(gòu)，切割與識(shí)別位點(diǎn)相同或相近。分子量較小，僅需Mg 2+作為催化反應(yīng)的輔助因子，不需ATP。3、分析影響限制性內(nèi)切酶酶切的因素有哪些？(1)溫度：大部分限制性內(nèi)切酶最適反應(yīng)溫度為3

18、7 C,少數(shù)酶高于或低于這個(gè)溫度。（2）時(shí)間：合適，大多為1 h,可過(guò)夜反應(yīng)。（ 3）溶液體系：要求有穩(wěn)定的pH 環(huán)境。標(biāo)準(zhǔn)的緩沖溶液中含有氯化鈣、氯化鎂或氯化鉀、Tris-HCl、3 -疏基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）以及牛血清蛋白質(zhì)（BSA ）和Mg2+ ,具有一定的酸堿值即pH 值。（4）鹽離子濃度：不同的限制性內(nèi)切酶對(duì)鹽離子強(qiáng)度（ Na+）有不同的要求，一般按離子強(qiáng)度不同分為低（0mmol/L ） 、中（ 50mmol/L ） 、高鹽（100mmol/L ）三類。Mg2+ 也是限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)所需。（ 5）反應(yīng)體積和甘油濃度：在進(jìn)行酶切反應(yīng)時(shí)，加酶的體積一般不超過(guò)總反應(yīng)的10%，若加

19、酶體積太大，甘油濃度過(guò)高，則會(huì)影響酶切反應(yīng)。（ 6） DNA 的純度和結(jié)構(gòu)： DNA 樣品中所含的蛋白質(zhì)、有機(jī)溶劑及RNA 等雜質(zhì)均會(huì)影響酶切反應(yīng)速度和酶切的完全度，酶切的底物一般是雙鏈DNA， DNA 的甲基化位置會(huì)影響酶切反應(yīng)。4、一個(gè)典型的原核表達(dá)質(zhì)粒的主要元件有哪些？基因工程P53能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的序列即復(fù)制子；控制轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子如lac、 trp 等； 選擇標(biāo)記的編碼序列如各種抗生素抗性基因；多克隆位點(diǎn)（MCS ）；轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，如一個(gè)合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和起始密碼子ATG 等。5、以人工構(gòu)建的pBR322 質(zhì)粒為例說(shuō)明基因工程載體的特點(diǎn)。有多個(gè)限制性內(nèi)切酶單一位點(diǎn)（EcoRI,

20、 Hindin等）四環(huán)素抗性基因 Tetr和氨芳青霉素抗性基因Ampr ,且Tetr中有BamH I （G JGATCC ）切點(diǎn)，Amp r 中有 Pst I 切點(diǎn)（CTGCA J G）和 Sal I 切點(diǎn)（GTCGAC ）?？梢酝ㄟ^(guò)AmprTets來(lái)篩選重組體。 一一插入失活篩選原理。在細(xì)胞中是多拷貝的，是松弛型復(fù)制子。具有復(fù)制起始點(diǎn)（ori）。分子量較小，安全。nh l | E6、小批量堿變性提取質(zhì)粒 DNA的原理與基本過(guò)程如何？堿變性法是常用的質(zhì)粒抽提方法，其原理是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在 pH值高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體 DNA的氫鍵斷裂，

21、雙 螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性。質(zhì)粒 DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ) 鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)以 pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其 pH值至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心，染色體 DNA與不穩(wěn)定的大分子 RNA、蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而 被除去。小批量堿變性提取質(zhì)粒 DNA的基本過(guò)程為一一(1)酶或機(jī)械法等方法破壞細(xì)胞，釋放出胞內(nèi)物質(zhì)；(2)加堿使DNA與蛋白質(zhì)變性，加中和?復(fù)性。因?yàn)橘|(zhì)粒DNA分子量小易復(fù)性，從而使得其與基因組 DNA分離；(3)在上清液中通過(guò)酚一氯仿抽提、去垢劑或酶使剩

22、余蛋白質(zhì)變性或水解，除去蛋白質(zhì);(4)再加入醇溶液使質(zhì)粒 DNA變性沉淀而與其他水溶性物質(zhì)分離；(5)將沉淀溶解于有 RNase的TE溶液中，溫育降解 RNA后電泳檢測(cè)、-20 C保存。7、什么是基因文庫(kù)？基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)制備方法有何區(qū)別？通過(guò)克隆技術(shù)將大分子 DNA編碼的全部或者絕大多數(shù)基因或基因組進(jìn)行擴(kuò)增后的DNA片段混合物，稱為基因文庫(kù)或 DNA文庫(kù)、克隆庫(kù)。分為基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)兩種。基因組DNA文庫(kù)的制備：從生物組織細(xì)胞提取出全部DNA,用物理方法(超聲波、攪拌剪力等）或酶法（限制性核酸內(nèi)切酶的不完全酶解）將DNA 降解成預(yù)期大小的片段，然后將這些片段與適當(dāng)?shù)妮d體（常用

23、噬菌體、粘?；験AC 載體）連接，轉(zhuǎn)入受體細(xì)菌或細(xì)胞，這樣每一個(gè)細(xì)胞接受了含有一個(gè)基因組DNA 片段與載體連接的重組DNA分子，而且可以繁殖擴(kuò)增，許多細(xì)胞一起組成一個(gè)含有基因組各DNA 片段克隆的集合體，就是基因組文庫(kù)。cDNA文庫(kù)的制備：提取出組織細(xì)胞的全部mRNA ,在體外反轉(zhuǎn)錄成 cDNA ,與適當(dāng)?shù)妮d體（常用噬菌體或質(zhì)粒載體）連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個(gè)細(xì)菌含有一段cDNA ，并能繁殖擴(kuò)增，許多細(xì)胞一起組成包含著某細(xì)胞全部mRNA 信息的 cDNA 克隆集合稱為該組織細(xì)胞的cDNA 文庫(kù)。8、 PCR 的定義、原理、方法？在生命科學(xué)領(lǐng)域有何具體用途？一種在體外模擬DNA 復(fù)制方式選擇性的擴(kuò)

24、增DNA 特殊區(qū)域的技術(shù)，又稱為無(wú)細(xì)胞克隆系統(tǒng)或特異性DNA 序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法。是在四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）存在下， 以寡聚核苷酸為引物及單鏈DNA 為模板， 經(jīng) DNA 聚合酶催化合成DNA 互補(bǔ)鏈的過(guò)程。原理與方法:1. 高溫變性雙鏈 DNA 在高溫下解鏈（變性）變成單鏈的過(guò)程;2. 低溫退火降溫后變性的單鏈DNA 可按照 A=T, C 三 G 特異性配對(duì)的原則重新結(jié)合恢復(fù)雙鏈結(jié)構(gòu); 同模板 DNA 特異性互補(bǔ)結(jié)合的引物的結(jié)合3. 適溫延伸DNA 聚合酶的酶促作用, 即可沿引物DNA 的 5向 3末端合成、延長(zhǎng)與模板互補(bǔ)的核苷酸鏈;4. 循環(huán)n 次。用途：1. 特異性擴(kuò)增目

25、的（模板）DNA 。2. 特異性檢測(cè)目的 RNA （如表達(dá)水平）（通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)）3. 用于基因重組（擴(kuò)增特定DNA 片段）4. 制備特異性探針5. 用于 DNA 測(cè)序6. 用于基因定位分析7. 通過(guò)誘變寡核苷酸引物產(chǎn)生各種突變體8. 用于分析基因組DNA 的多態(tài)性(Random Amplified Poly-morphic DNA = RAPD)9. 構(gòu)建 cDNA 或基因組DNA 文庫(kù) (從 mRNA 或基因組DNA 中)10. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR： DNA 或 RNA 的絕對(duì)定量分析9、瓊脂糖凝膠電泳分離DNA 的原理是什么？瓊脂糖是從瓊脂中提取的一種多糖，具親水性，但不帶電荷，是一種

26、很好的電泳支持物。DNA 分子在瓊脂糖凝膠中時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA 分子在高于等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng) 度下 , DNA 分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)。具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA 片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA 分子泳動(dòng)速度不一樣。10 、什么是原位雜交技術(shù)？其基本過(guò)程如何？ 根據(jù)核酸雜交原理，利用基因探針檢出培養(yǎng)板上重組轉(zhuǎn)化體菌落位置的技術(shù)?；具^(guò)程：( 1)將硝酸纖維素濾膜鋪放在生長(zhǎng)著轉(zhuǎn)化菌落的平板表面，使其中的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上。(2)取出濾膜，作溶菌、堿變性(0.5mol/L NaOH),酸中和

27、(Tris.Cl pH7.4)等處 理后，轉(zhuǎn)移到一張干的濾紙上，置于室溫2030min ，使濾膜干燥。將濾膜夾在兩張干的濾紙之間，在真空烤箱中于80c烘烤2h,固定DNA。( 3) 帶有 DNA 印跡的濾膜同32P 標(biāo)記的適當(dāng)探針雜交、以檢測(cè)帶有重組質(zhì)粒(含有被研究的 DNA 插入片段)的陽(yáng)性菌落。(4)將放射自顯影的 X光底片同保留下來(lái)的原菌落平板對(duì)照，從中挑出陽(yáng)性菌落供作進(jìn)一步的分析研究保留原 盤平板(A)沖0生長(zhǎng)若轉(zhuǎn)化菌落籬板硝酸纖雍素濾膜溶菌堿變性酸中和洗去細(xì)胞碎片挑取陽(yáng)性菌落置于溶菌液中的濾膜(C)X.雜交r"上"-1口-日溫更顯示陽(yáng)性菌海靛放射日,早懸空瞎鼾1的

28、x光底片跡的濾膜烤干(D)11、什么是啟動(dòng)子？什么是SD序列？啟動(dòng)子(promoter , P)：是指能被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段 DNA序列 (40bp-60bp)。富含 A-T 堿基對(duì)，具有保守序列： -10 區(qū)(pribnow box)： TATAAT; -35 區(qū):不同的啟動(dòng)子的效率不同，強(qiáng)啟動(dòng)子指導(dǎo)產(chǎn)生較多量的mRNA ,弱啟動(dòng)子指導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄合成的mRNA很少。啟動(dòng)子的強(qiáng)度主要決定于啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)。原核生物RNA聚合酶不能識(shí)別真核細(xì)胞啟動(dòng)子，因此真核基因在原核生物表達(dá)時(shí)，應(yīng)將真核基因置于原核生物強(qiáng)啟動(dòng)子下，以實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)錄。在原核生物中，mRNA起始密碼子 AUG上游3-

29、11bp處一段能與16SrRNA3 '端序列互 補(bǔ)的富含喋吟的堿基序列稱為SD序列(SD sequence)。mRNA分子上有兩個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)是起始密碼 AUG ,另一個(gè)是起始密碼 AUG上游處的一段的序列.后者稱為SD序列。12、什么是操縱子？請(qǐng)用簡(jiǎn)圖表示操縱子的基本結(jié)構(gòu)并以乳糖操縱子負(fù)調(diào)控系統(tǒng)(阻遏蛋 白調(diào)控作用)為例說(shuō)明其功能。操縱子是原核生物轉(zhuǎn)錄單位。操縱子組成為結(jié)構(gòu)基因連同其上游的調(diào)控序列(啟動(dòng)子 promotor P、操縱基因operator O、其他調(diào)節(jié)序列)共同構(gòu)成一個(gè)操縱子。P OI Z I Y A阻逋物箕因啟動(dòng)子'“操縱基因產(chǎn)生阻遏蛋白R(shí)NA酶結(jié)合結(jié)

30、合阻遏物,i基因 無(wú)誘導(dǎo)物時(shí)1阻遏物 T蛋白亞基器RNA聚合酶Lac Z阻遏蛋白Lac Y lac Ai基因有誘導(dǎo)物時(shí) P O LacZLac Y lac A乳糖操縱子（lacoperon）的調(diào)控方式甲轉(zhuǎn)錄阻遏物蛋白亞基翻譯6半乳糖甘酶6半乳糖昔通透酶6半乳糖昔乙酰轉(zhuǎn)移酶mRNA無(wú)誘導(dǎo)物（乳糖）時(shí)，阻遏物基因I產(chǎn)生的阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合，位點(diǎn)關(guān)閉，RNA多聚酶通不過(guò)，轉(zhuǎn)錄不進(jìn)行，基因關(guān)閉；有誘導(dǎo)物（乳糖）時(shí)，誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，阻遏蛋白失活，從 o點(diǎn)脫離，o位點(diǎn)打 開(kāi)，RNA多聚酶通過(guò)，Z、Y、A轉(zhuǎn)錄。即基因表達(dá)。13、為什么用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)真核生物的蛋白質(zhì)時(shí)，克隆的真核基因不能來(lái)自基因

31、組文 庫(kù)？真核基因應(yīng)如何獲得？對(duì)真核細(xì)胞來(lái)說(shuō)，從基因組 DNA文庫(kù)獲得的基因與從 cDNA文庫(kù)獲得的不同，基因組DNA文庫(kù)所含的是帶有含子和外顯子的基因組基因，而從 cDNA文庫(kù)中獲得的是已經(jīng)過(guò)剪 接、去除了內(nèi)含子的 cDNA。因?yàn)樵思?xì)胞不具有 mRNA轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，不能進(jìn)行剪接、 去除內(nèi)含子等操作，所以用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)真核生物的蛋白質(zhì)時(shí)，克隆的真核基因不能來(lái)自基因組文庫(kù)，應(yīng)從cDNA文庫(kù)中獲得，或者通過(guò)提取mRNA后RT-PCR方法獲得。14 、如何提高真核基因在原核宿主中的表達(dá)效率？（ 1 ）選擇合適載體，提高翻譯水平強(qiáng)啟動(dòng)子 提高轉(zhuǎn)錄水平核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ATG-SD ）距離合適在基

32、因重組過(guò)程中應(yīng)將結(jié)構(gòu)基因接于SD 序列之后以便為mRNA 提供核糖體結(jié)合位點(diǎn)，提高真核基因表達(dá)效率。避免產(chǎn)物降解：分泌/融合表達(dá)；（融合蛋白表達(dá)后再去除原核肽段）（ 2）選擇合適宿主（如 Lac 啟動(dòng)子 LacI 菌；PL/PR CI857 溶源菌 ）（ 3）調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞代謝為保持宿主正常生長(zhǎng)速度及重組轉(zhuǎn)化體穩(wěn)定性，維持產(chǎn)物的高效表達(dá)，必需采用適當(dāng)方法，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝。目前，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝方法很多。如營(yíng)養(yǎng)物濃度控制、產(chǎn)物誘導(dǎo)表達(dá)、載體誘導(dǎo)復(fù)制及促進(jìn)產(chǎn)物分泌等。15 、什么是基因診斷？基因診斷中常用的方法有哪些？試簡(jiǎn)述其中一種方法的原理。基因診斷是指用分子生物學(xué)的技術(shù)對(duì)引起疾病的原因 遺傳基因、致病

33、微生物和寄生蟲(chóng) , 以及某些惡性腫瘤在基因水平上進(jìn)行病原學(xué)和細(xì)胞遺傳基因的檢測(cè)和分析?；蛟\斷中常用的方法有核酸分子雜交、PCR 、 DNA 芯片技術(shù)、限制酶酶譜分析和DNA 序列測(cè)定等。核酸分子雜交是基因診斷的最基本的方法之一。它的基本原理是：互補(bǔ)的核酸單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈，即能夠進(jìn)行雜交。它不僅能在DNA 和 DNA 之間進(jìn)行，也能在DNA 和 RNA 之間進(jìn)行。因此， 當(dāng)用一段已知基因的核酸序列作探針，與變性后的單鏈基因組 DNA 接觸時(shí)，如果兩者的堿基完全配對(duì)，它們即互補(bǔ)地結(jié)合成雙鏈，從而表明被測(cè)基因 組 DNA 中含有已知的基因序列。16 、名詞解釋：基因探針基因芯片蛋白質(zhì)

34、工程基因探針 （ probe） ： 就是一段與目的基因DNA 互補(bǔ)的帶有能檢測(cè)標(biāo)記物的特異核苷酸序列，它可以包括整個(gè)基因，也可以僅僅是基因的一部分；可以是DNA 本身，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來(lái)的 RNA。基因芯片（gene chip）： 又稱 DNA 芯片，是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段有規(guī)律地排列固定于支持物上，樣品DNA/ RNA 通過(guò) PCR 擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子， 然后按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交，再通過(guò)熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的熒光信號(hào)作出比較和檢測(cè)，從而迅速得出所要的信息。蛋白質(zhì)工程：是指在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)上，借助

35、計(jì)算機(jī)等輔助設(shè)計(jì)來(lái)確定某一蛋白質(zhì)分子的改造方案。然后通過(guò)基因改造和基因工程技術(shù)獲得新的蛋白質(zhì)分子。17、簡(jiǎn)述包含體形成的原因和包含體蛋白復(fù)性的主要步驟。重組蛋白在細(xì)菌中表達(dá)時(shí)， 尤其當(dāng)表達(dá)目的蛋白量超過(guò)細(xì)菌體總蛋白量10%時(shí)，會(huì)在細(xì)胞內(nèi)與細(xì)菌雜蛋白、核酸等成分聚集成沒(méi)有生物活性的直徑0.1-0.3科m的固體顆粒，這種不溶性聚合體即包含體（inclusion body ）。生成包含體的原因可能有是蛋白質(zhì)合成速度太快，多肽鏈相互纏繞，影響了多肽鏈的正確折疊，導(dǎo)致疏水基團(tuán)外露等。（包含體的形成有利于防止蛋白酶對(duì)表達(dá)蛋白的降解，并且非常有利于分離表達(dá)產(chǎn)物。但包含體形成后，表達(dá)蛋白不具有生物活性，因此必

36、須溶解包含體并對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行復(fù)性。）包含體復(fù)性即從伸展態(tài)一中間體一后期中間體一天然態(tài)的過(guò)程，操作步驟一般為用超聲波、勻漿等使菌體破碎后，離心得到包含體加入強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑如68mol/L鹽酸月瓜或910mol/L尿素溶解包含體-用透析、 稀釋和超濾復(fù)性法等等方法使之正確折 疊。18、列表比較大腸桿菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)。比較指標(biāo)表 達(dá) 系 統(tǒng)大腸桿菌酵母菌哺乳動(dòng)物細(xì)胞昆蟲(chóng)細(xì)胞1.外源基因表 達(dá)水平高比較高不高不高（家蠶除外）2.培養(yǎng)條件易易難較難3.表達(dá)產(chǎn)物的 形式多數(shù)不能分泌，胞內(nèi)形成包含體多數(shù)能分泌， 少數(shù)在胞內(nèi)形 成包含體，有 時(shí)產(chǎn)物不均一一般都能分泌一般都能分泌

37、4.表達(dá)產(chǎn)物的 糖基化不能糖基化能糖基化，但 糖基化程度與 天然產(chǎn)物有差胞內(nèi)表達(dá)破壁 困難；分泌物 純化工藝簡(jiǎn)單糖基化好，近 似天然產(chǎn)物能糖基化，但糖 基化程度與天然 產(chǎn)物有差別5.產(chǎn)物純化工 藝細(xì)胞破壁容易， 多數(shù)產(chǎn)物需復(fù) 性”，工藝較復(fù)純化簡(jiǎn)單純化較簡(jiǎn)單（家蠶 除外）6.生產(chǎn)成本高，主要化費(fèi)在 純化方面低高，主要花費(fèi) 在培養(yǎng)條件方 面高，主要花費(fèi)在 培養(yǎng)條件方面（家 蠶除外）7.穩(wěn)定性差較好好較好8.難點(diǎn)復(fù)性破壁培養(yǎng)培養(yǎng).以下為某同學(xué)作業(yè)答案，供參考表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(1)對(duì)大腸桿菌的背景知識(shí)，特別是 基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理有深刻了解；(2)是一種安全的基因，程實(shí)驗(yàn)體系， 擁

38、后各類適用的寄主菌株和不同類型 的載體；(3)許多克隆的真核基因都可以在大 腸桿菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效、高水平的表 達(dá)；(4)大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡(jiǎn)單、 成本低廉，易用于批量生產(chǎn)。(1)缺之轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制，只能表 達(dá)克隆的cDNA,不宜表達(dá)真核基因 組 DNA ;(2)缺乏翻譯后加工機(jī)制，許多真 核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn) 譯后的加工修飾(正確折疊和組 裝)，而大多數(shù)的這類修飾作用在細(xì) 菌細(xì)胞中并不存在；(3)表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包 含體，需作復(fù)性處理；(4)難于表達(dá)大量可溶性蛋白。酵母表達(dá)系統(tǒng)(1)基因背景了解清楚，上游操作簡(jiǎn) 單，生長(zhǎng)迅速，非常適于大規(guī)模發(fā)酵。(2)具有一定的加工及修飾

39、能力：如 一硫鍵的正確形成，前體蛋白的水解加 工。表達(dá)產(chǎn)物與天然蛋白相同或類似。(3)可將異源蛋白基因與 N-末端前導(dǎo) 肽等信號(hào)肽融合，指導(dǎo)新生肽的分泌， 在分泌中可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行糖基化 修飾，但其修飾糖鏈與高等真核細(xì)胞并 不相同。(4)可移去起始甲硫氨酸，避免了作 為藥物使用可能引起的免疫反應(yīng)問(wèn)題。(1)廣糖量過(guò)多因血損壞蛋白質(zhì)的 生物活性、安全性等；(2)糖基化修飾與高等真核細(xì)胞并 不相同。昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(1)表達(dá)效率高。重組蛋白的表達(dá)水 平最局可達(dá)到細(xì)胞總蛋白的 50%。(2)屬于真核表達(dá)系統(tǒng)。有糖基化作 用、脂肪酸?；饔谩?氨基末端乙酰 化作用以及磷酸化，有利于表達(dá)產(chǎn)物形 成天

40、然的高級(jí)結(jié)構(gòu)，保持原有的生物活 性與功能。(3)桿狀病毒能容納較大的外源基因 而不影響其本身的增殖。(4)桿狀病是屬于昆蟲(chóng)病是。具有局 度特異的宿主范圍，對(duì)脊椎動(dòng)物和植物 均無(wú)致病性。病毒重組因失去多角體保 護(hù)，在自然界的生存能力很弱，因此比較安全。(5)應(yīng)用晚期多角體蛋白基因啟動(dòng)子 表達(dá)外源基因可表達(dá)是性蛋白。(6)桿狀病毒表達(dá)載體通用性廣。可 表達(dá)來(lái)自病毒、細(xì)菌; 真菌; 植物和動(dòng)(1)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)慢、培養(yǎng)基昂貴、 含有免疫宿主蛋白、桿狀病毒感染會(huì)導(dǎo)致宿主死亡、因此每一 輪蛋白合成均需重新感染。(2)昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)的糖基化方式與脊 椎動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的糖基化方式有， 的差異，其糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)多為

41、簡(jiǎn)單的不分支結(jié)構(gòu)。物幾乎所有的蛋白，并且能表達(dá)帶有內(nèi) 含子的外源基因。(7)重組桿狀病毒除在體外昆蟲(chóng)培養(yǎng) 細(xì)胞表達(dá)外源基因外，還能感染昆蟲(chóng)活 體，在體內(nèi)圖效表達(dá)外源蛋白。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá) 系統(tǒng)(1)產(chǎn)物的抗原性、免疫原性和功能 與天然蛋白質(zhì)最接近，糖基化等后加工 最精確。(2) 一般會(huì)產(chǎn)生正確加工的、有活性 的蛋白。該表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)水平較低、培養(yǎng) 基昂貴、生長(zhǎng)緩慢、含有過(guò)敏物質(zhì) 等缺點(diǎn)在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中較難避 免。19、利用基因工程菌生產(chǎn)有哪些特點(diǎn)？有什么優(yōu)勢(shì)？常用的宿主菌有哪些？基因工程菌帶有外源基因，這些基因可能不穩(wěn)定。丟失外源基因的菌往往比未丟失的菌生長(zhǎng)快得多，這樣就會(huì)大大降低產(chǎn)物的表達(dá)。為了抑制基因丟失的菌的生長(zhǎng)，一般在培養(yǎng)中加入選擇壓力，如抗生素。基因工程菌的培養(yǎng)一般分兩段。前期是菌體生長(zhǎng)，生長(zhǎng)到某一階段，加入誘導(dǎo)因子，誘發(fā)產(chǎn)物表達(dá)。利用基因工程菌生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在目的產(chǎn)物產(chǎn)量高，表達(dá)調(diào)控性好，可根據(jù)目的產(chǎn)物特點(diǎn)構(gòu)建各種表達(dá)系統(tǒng)，等等。常用宿主菌有大腸桿菌(如BL21(DE3)plysS 菌株)、酵母菌(如 Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae 等)、 枯草芽抱桿菌等。20、在基因工程菌培養(yǎng)過(guò)程中為什么質(zhì)粒會(huì)丟失？(1)分離的不穩(wěn)定性：細(xì)胞分裂過(guò)程中