植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用

1、植物組織培養(yǎng)技術(shù)的開展與應(yīng)用摘要 植物組織培養(yǎng)技術(shù)是一種新興的科研手段，近些年來開展迅速。本文從植物組織培養(yǎng)的原理、組織培養(yǎng)的方法入手，簡單介紹植物組織培養(yǎng)技術(shù)的開展與應(yīng)用。關(guān)鍵詞 植物組織培養(yǎng) 愈傷組織 原生質(zhì)體 1. 植物組織培養(yǎng)的概念、原理、方法及特點1.1 植物組織培養(yǎng)的概念植物組織培養(yǎng)技術(shù)簡稱組培是20世紀(jì)中葉開始開展，如今已經(jīng)非常成熟的一種現(xiàn)代科研手段，其概念是：在無菌條件下，將離體的植物 器官(根尖、莖尖等)、組織(形成層、花藥組織等)、細(xì)胞(體細(xì)胞、生殖細(xì)胞等)、胚胎(成熟或未成熟的胚)、原生質(zhì)體等在人工配制的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘發(fā)其產(chǎn)生愈傷組織或潛伏芽或長成完

2、整的植株的技術(shù)。1.2 植物組織培養(yǎng)的原理植物組織細(xì)胞培養(yǎng)的依據(jù)是植物細(xì)胞“全能性及植物的“再生作用。1902年，德國著名植物學(xué)家GHaberlanelt根據(jù)細(xì)胞學(xué)理論，大膽地提出了高等植物的器官和組織可以不斷分割，直到單個細(xì)胞，即植物體細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)臈l件下，具有不斷分裂和繁殖，發(fā)育成完整植株的潛力的觀點。19世紀(jì)30年代，德國植物學(xué)家施萊登和德國動物學(xué)家施旺創(chuàng)立了細(xì)胞學(xué)說，根據(jù)這一學(xué)說，如果給細(xì)胞提供和生物體內(nèi)一樣的條件，每個細(xì)胞都應(yīng)該能夠獨立生活。1958年，美國植物學(xué)家斯蒂瓦特等人，用胡蘿卜韌皮部的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，終于得到了完整植株，并且這一植株能夠開花結(jié)果，證實了GHaberlanelt

3、在五十多年前關(guān)于細(xì)胞全能的預(yù)言。根據(jù)植物細(xì)胞具有全能性這個理論，近幾十年來開展起來的一項無性繁殖的新技術(shù)植物的組織培養(yǎng)技術(shù)。1.3 植物組織培養(yǎng)的方法1.3.1 非試管微組織快繁非試管微組織快繁技術(shù)是將外植體一般要求帶一葉一芽放置在室內(nèi)外普通沙子培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，利用植物腋芽自然倍增到達(dá)快速繁殖的目的。一般植物715天可以生長出根系。此技術(shù)投資低，操作環(huán)節(jié)少。1.3.2 試管組織培養(yǎng)試管組織培養(yǎng)是將外植體即離體組織、器官或細(xì)胞放置在試管等器皿中在無菌的條件下進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得試管苗。1.4 植物組織培養(yǎng)的分類1.4.1 胚胎培養(yǎng)指以從胚珠中別離出來的成熟或未成熟胚為外植體的離體無菌培養(yǎng)。1.4.

4、2 器官培養(yǎng)指以植物的根、莖、葉、花、果等器官為外植體的離體無菌培養(yǎng)，如根的根尖和切段，莖的莖尖、莖節(jié)和切段，葉的葉原基、葉片、葉柄、葉鞘和子葉，花器的花瓣、雄蕊花藥、花絲、胚珠、子房、果實等的離體無菌培養(yǎng)。1.4.3 組織培養(yǎng)指以別離出植物各部位的組織如分生組織、形成層、木質(zhì)部、韌皮部、表皮、皮層、胚乳組織、薄壁組織、髓部等，或已誘導(dǎo)的愈傷組織為外植體的離體無菌培養(yǎng)。這是狹義的植物組織培養(yǎng)。1.4.4 細(xì)胞培養(yǎng)指以單個游離細(xì)胞如用果酸酶從組織中別離的體細(xì)胞，或花粉細(xì)胞，卵細(xì)胞為接種體的離體無菌培養(yǎng)。1.4.5 原生質(zhì)體培養(yǎng)。指以除去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體為外植體的離體無菌培養(yǎng)。1.5 植物組織培養(yǎng)

5、的特點1、培養(yǎng)條件可以人為控制組織培養(yǎng)采用的植物材料完全是在人為提供的培養(yǎng)基和小氣候環(huán)境條件下進(jìn)行生長，擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災(zāi)害性氣候的不利影響，且條件均一，對植物生長極為有利，便于穩(wěn)定地進(jìn)行周年培養(yǎng)生產(chǎn)。2、生長周期短，繁殖率高植物組織培養(yǎng)是由于人為控制培養(yǎng)條件，根據(jù)不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培養(yǎng)條件，因此生長較快。另外，植株也比較小，往往20-30天為一個周期。所以，雖然植物組織培養(yǎng)需要一定設(shè)備及能源消耗，但由于植物材料能按幾何級數(shù)繁殖生產(chǎn)，故總體來說本錢低廉，且能及時提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫病毒種苗。3、管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動化控制植物組織培養(yǎng)是在一定

6、的場所和環(huán)境下，人為提供一定的溫度、光照、濕度、營養(yǎng)、激素等條件，極利于高度集約化和高密度工廠化生產(chǎn)，也利于自動化控制生產(chǎn)。它是未來農(nóng)業(yè)工廠化育苗的開展方向。它與盆栽、田間栽培等相比省去了中耕除草、澆水施肥、防治病蟲等一系列繁雜勞動，可以大大節(jié)省人力、物力及田間種植所需要的土地。 2 植物組織培養(yǎng)的實驗過程2.1 植物組織培養(yǎng)的條件2.1.1 培養(yǎng)基植物組織培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基有：MT、MS、SH、N6、White等。不同植物所需要的生長條件不同，所用的培養(yǎng)基也有所不同。在組織培養(yǎng)中，2.1.2 外源激素愈傷組織和胚狀體能否形成是培育出新植株的關(guān)鍵。通過在根底培養(yǎng)基里添加一定濃度的外源激素，可以

7、誘導(dǎo)出愈傷組織、胚狀體、不定芽、根等器官，最終獲得再生植株或次生物質(zhì)。用于植物組織培養(yǎng)的材料稱為外植體，其主要形式有器官、胚胎、單細(xì)胞、原生質(zhì)體等。根據(jù)外植體的不同，所需要的培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)條件、外源激素的種類及比例等均不同。植物組織培養(yǎng)中，影響培養(yǎng)力的因素是多方面的，誘導(dǎo)愈傷組織成敗的關(guān)鍵在于培養(yǎng)條件，植物激素是誘導(dǎo)愈傷組織和綠苗分化的關(guān)鍵因素。最常用的誘導(dǎo)愈傷組織的生長素是IAA、NAA 和2,4-D，所需濃度為0.0110 mgL。最常用的細(xì)胞分裂素是KT和ABA，使用濃度為0.110mgL。KT的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞分裂和愈傷組織分化。ABA對植物體細(xì)胞胚的發(fā)生與發(fā)育具有重要作用。各類植

8、物激素的生理作用雖有相對專一性，但是植物的各種生理效應(yīng)是不同種類激素之間相互作用的綜合表現(xiàn)。2.2 植物組織培養(yǎng)的步驟2.2.1 選擇和配制培養(yǎng)基培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中的“血液，血液的成分及其供應(yīng)狀況直接關(guān)系到培養(yǎng)物的生長與分化，因此了解培養(yǎng)基的成分、特點及其配制至關(guān)重要。2.2.2 滅茵滅菌是組織培養(yǎng)中的重要工作之一，通常采用物理的或化學(xué)的滅菌方法。培養(yǎng)基用常壓 或高壓蒸煮等濕熱滅菌、器械采用灼燒滅菌、玻璃器皿及耐熱用具采用干熱滅菌、不耐熱的物質(zhì)采用過濾滅菌、植物材料外表用消毒劑滅菌、物體外表用藥劑噴霧滅菌、接種室等空間采用紫外線或熏蒸滅菌。2.2.3 接種將已消毒好的根、莖、葉等離體器官，

9、經(jīng)切割或剪裁成小段或小塊放入培養(yǎng)基，整個接種過程要在無菌條件下進(jìn)行。2.2.4 培養(yǎng)把培養(yǎng)材料放在有一定光照和溫度等條件的培養(yǎng)室里，使之生長、分裂和分化，形成愈 傷組織或進(jìn)一步分化成再生植株。2.2.5 試管苗馴化移栽試管苗是在特殊環(huán)境條件下生長的幼苗，與自然生長的幼苗有很大差異，只有通過馴化，使之適應(yīng)自然環(huán)境后才能移栽。 3. 植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用3.1 植物快速繁殖和無病毒種苗生產(chǎn)植物快速繁殖技術(shù)始于20世紀(jì)60年代，法國的Morel用莖尖培養(yǎng)的方法大量繁殖蘭花獲得成功，從此揭開了植物快速繁殖技術(shù)研究和應(yīng)用的序幕。目前，通過離體培養(yǎng)獲得小植株并且具有快速繁殖潛力的植物已有100多科1000種

10、以上，有的已經(jīng)開展成為工業(yè)化生產(chǎn)的商品。世界上80%85%的蘭花是通過組織培養(yǎng)進(jìn)行脫毒和快速繁殖的。培養(yǎng)的植物種類也由欣賞植物逐漸開展到園藝植物、大田作物、經(jīng)濟植物和藥用植物等。在我國，同類的研究始于20世紀(jì)70年代。馬鈴薯無毒種薯和甘蔗種苗已在生產(chǎn)上大面積種植，30余種植物已進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)或中間試驗 利用組織培養(yǎng)進(jìn)行植物快速繁殖及無病毒種苗生產(chǎn)，不僅能夠挽救珍惜瀕危物種，而且能夠解決植物野生資源缺乏的問題。3.2 植物花藥培養(yǎng)和單倍體育種將植物花藥培養(yǎng)成單倍體植株，再經(jīng)過染色體加倍，能很快得到純合的二倍體，這樣將大大縮短育種年限。到目前為止，世界上通過花粉和花藥培養(yǎng)已獲得了幾百種植物的單倍體

11、植株。韓國先后育成了5個優(yōu)質(zhì)、抗病、抗倒伏的水稻品種。我國自20世紀(jì)70年代開始該領(lǐng)域的研究已經(jīng)培育了40余種由花粉或花藥發(fā)育成的單倍體植株，其中有10余種為我國首創(chuàng)。玉米獲得了100多個純合的自交系；橡膠獲得了二倍體和三倍體植株。僅“九五期間就育成高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆、抗病的農(nóng)作物新品種44個，種植面積超過660萬。3.3 植物胚胎培養(yǎng)雜交育種中，雜種胚常常敗育，因此將早期生長的胚取出，應(yīng)用組織培養(yǎng)方法，就有可能培育出雜交植物。已經(jīng)有100篇以上幼胚培養(yǎng)成為植株的報道。國內(nèi)外科學(xué)家應(yīng)用植物胚胎培養(yǎng)技術(shù)獲得了多種遠(yuǎn)緣雜交的重組體、栽培種和雜交品種。3.4 植物愈傷組織或細(xì)胞懸浮培養(yǎng)利用植物愈傷組織

12、或細(xì)胞懸浮培養(yǎng)可以生產(chǎn)用于預(yù)防和治療疾病的植物次生代謝產(chǎn)物。近年來，這一領(lǐng)域的開展極為迅速，已經(jīng)研究了400多種植物，從培養(yǎng)細(xì)胞中別離到600多種次級代謝產(chǎn)物，其中60多種在含量上超過或等于原植物，20種以上重超過原植物的1 %。例如，從薯芋愈傷組織和懸浮細(xì)胞生產(chǎn)的diosgenin用于合成甾體藥物。最近抗癌藥物紫杉醇一紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)物，可用75t發(fā)酵罐培養(yǎng)，已到達(dá)商業(yè)化生產(chǎn)水平。另外， 到達(dá)商品化水平的還有紫草、人參、黃連、老鸛草等；長春花、毛地黃、煙草等已實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；牙簽草、紅花等20多種植物正在向商品化過渡。3.5 細(xì)胞融合與原生質(zhì)體培養(yǎng)自1960年英國學(xué)者Cocking首次利用纖維

13、素酶從番茄幼苗的根別離原生質(zhì)體獲得成功以來，到1990年已有100種以上植物的原生質(zhì)體能再生植株。我國獲得了30余個品種的原生質(zhì)體再生植株，其中包括難度較大的重要糧食作物和經(jīng)濟作物，如大豆、水稻、玉米、小麥、谷子、高粱、棉花等。在木本植物、藥用植物、蔬菜和真菌原生質(zhì)體培養(yǎng)方面的進(jìn)展也十分迅速。國外已先后獲得了種內(nèi)及種間的體細(xì)胞雜種植株。植物原生質(zhì)體培養(yǎng)還可應(yīng)用于外源基因轉(zhuǎn)移、無性系變異及突變體篩選等研究，因而越來越受到人們的重視。3.6 植物細(xì)胞突變體篩選植物細(xì)胞突變體的篩選最早始于1959年，GMelchers在金魚草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中獲得了溫度突變體。1970年，PSCarlson，HBind

14、ing和YMHeimer等分別別離出煙草營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞、矮牽牛抗鏈霉素細(xì)胞系及煙草抗蘇氨酸細(xì)胞系。迄今為止，已經(jīng)在不少于15個科45個種的植物細(xì)胞培養(yǎng)中篩選出100個以上的植物細(xì)胞突變體或變異體。其中包括抗病細(xì)胞突變體，如玉米抗小斑病突變體和小麥抗赤霉病、根腐病突變體；抗氨基酸及其類似物細(xì)胞突變體，如甘藍(lán)型湖菜抗HYP突變體釘；抗逆境脅迫細(xì)胞突變體，如水稻耐鹽突變體和小麥抗鹽突變體；抗除草劑細(xì)胞突變體及營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞突變體，如玉米抗除草劑變異體；株高突變體的篩選，如水稻矮稈變異體。3.7 植物體細(xì)胞胚胎和人工種子1958年，Reinert在胡蘿卜的組織培養(yǎng)中最先發(fā)現(xiàn)了體細(xì)胞胚胎(胚狀體)。據(jù)不

15、完全統(tǒng)計，能大量產(chǎn)生胚狀體的植物有43科92屬100多種 一些重要作物如水稻、小麥、玉米、珍珠谷等，也能通過離體培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體。這些胚狀體用褐藻酸鈉等包埋，再加上人工種皮，就形成了人工種子。人工種子的優(yōu)點是：繁殖快速，成苗率極高；不受氣候影響，四季皆可工廠化生產(chǎn)。上世紀(jì)80年代初，美、日、法等國家相繼開展了人工種子的研究，我國也于“七五期間開展了此項研究，并于1987年列入了國家“863高技術(shù)研究開展方案。3.8 植物組織細(xì)胞培養(yǎng)物的超低溫保存與種質(zhì)庫建立 植物細(xì)胞全能性的發(fā)現(xiàn)和證實，為植物種質(zhì)資源的長期保存開辟了一條新途徑。采用液氮超低溫保存技術(shù)，能保持很高的存活率，并且能再生出新植株和保持

16、原來的遺傳特性。如建立莖尖分生組織培養(yǎng)物的超低溫保存種質(zhì)庫，不僅可以防止種質(zhì)的遺傳變異和退化，而且可以長期保存無病毒的原種。3.9 植物組織培養(yǎng)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用我國第一個T-DNA插入突變體庫的構(gòu)建和研究為我國水稻功能基因組學(xué)研究奠定了良好的技術(shù)和材料根底，為確保我國擁有一批有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因資源做出了積極奉獻(xiàn)。由中國水稻研究所農(nóng)業(yè)部水稻生物學(xué)重點開放實驗室和中科院上海植物生理研究所合作，通過建立大規(guī)模、高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，將玉米轉(zhuǎn)座子Ac-Ds等外源基因?qū)胨疚闯墒炫吆头N子誘導(dǎo)的愈傷組織，獲得了1.2萬個獨立的T-DNA插入株系，并構(gòu)建了水稻突變體的數(shù)據(jù)庫。 4. 植物組

17、織培養(yǎng)的前景展望植物組織培養(yǎng)研究與應(yīng)用是20世紀(jì)科技進(jìn)步的重大成果之一，為研究植物生長發(fā)育、抗性生理、激素及器官發(fā)生與胚胎發(fā)生等提供了許多良好的實驗材料和有效途徑。植物組織培養(yǎng)方法不斷提高的同時，也相應(yīng)拓寬了其應(yīng)用范圍，現(xiàn)已為人們廣泛的應(yīng)用在各個領(lǐng)域。由于組織培養(yǎng)在人工控制的條件下進(jìn)行，容易掌握花芽分化和開花成因；通過胚胎培養(yǎng)，能夠得到雜種或自交種；通過別離單倍體細(xì)胞，能培育純合的二倍體優(yōu)良品系；提高育種多樣性的同時縮短了育種時間；通過突變體篩選，提高植物的品質(zhì)，增強抗逆境脅迫能力，擴大植物的生長范圍；將體細(xì)胞冷藏在低溫下，建立基因庫，到達(dá)保存物種的目的；獲得藥用價值高和工業(yè)生產(chǎn)所需要的次生產(chǎn)物，加快藥物生產(chǎn)的時間并且減少了單純依靠天然植物的被動性。植物組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)滲透到科研、生產(chǎn)和生活各個領(lǐng)域，必將日臻完善。但是長期來，組織培養(yǎng)多數(shù)還停留在試驗研究上，在應(yīng)用生產(chǎn)方面還有一定缺乏因此今后需要有一套可行的措施，將研究成果轉(zhuǎn)化為有經(jīng)濟價值的大規(guī)模生產(chǎn)實踐。 參考文獻(xiàn)1 王文靜，袁道強，高松沽