腸功能恢復湯對腸缺血-再灌注損傷大鼠腸黏膜屏障的影響

1、腸功能恢復湯對腸缺血-再灌注損傷大鼠腸黏膜屏障的影響         11-01-09 15:53:00     作者：王春榮，程永剛，祁翔    編輯：studa20【摘要】  目的 觀察腸功能恢復湯對腸缺血-再灌注損傷大鼠腸黏膜屏障的影響，探索多器官功能障礙綜合征的新的防治途徑。方法 SD大鼠45只，隨機分為3組：正常對照組、腸缺血-再灌注損傷模型組、腸功能恢復湯治療組，分別檢測各組血清中二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸含量

2、，收集小腸灌洗液并測定灌洗液中的溶菌酶含量，同時取腸系膜靜脈血、腸系膜淋巴結、肝及脾組織進行細菌培養(yǎng)，觀察細菌移位情況，取回腸組織制成石蠟切片，HE染色光鏡下觀察，測量小腸黏膜厚度、絨毛高度和隱窩深度，取回腸組織制成電鏡標本，透射電鏡觀察。結果 腸功能恢復湯組與模型組相比，血清中DAO和D-乳酸含量均顯著降低(P<0.01)，小腸灌洗液中溶菌酶含量顯著升高(P<0.01)，細菌移位率顯著降低(P<0.01)。腸功能恢復湯組小腸黏膜的病理形態(tài)明顯好于模型組。結論 腸功能恢復湯對腸缺血-再灌注損傷大鼠的腸黏膜屏障具有保護作用。 【關鍵詞】  腸功能恢復湯 腸缺血-再灌注

3、損傷 腸黏膜屏障ABSTRACT: Objective  To investigate the effect of the decoction to help recover intestinal function on the intestinal mucosal barrier of rats with gut ischemia-reperfusion injury. Methods  Forty-five SD rats were divided into three groups randomly: control group, gut ischemia-reper

4、fusion injury group and decoction group. We detected the content of DAO and D-lactate in serum and lysozyme in perfusate of intestine in each group. We observed the bacteria translocation, the change of ileum mucous membrane in pathomorphology and intestinal villi. Results  Compared with those

5、in gut ischemia-reperfusion injury group, the contents of DAO and D-lactate and bacteria translocation ratio were all lower in decoction group (P<0.01), but the content of lysozyme in perfusate was higher (P<0.01). The ileum mucous membranes in decoction group were better than in gut ischemia-

6、reperfusion injury group in pathomorphology. Conclusion  The decoction to help recover intestinal function can protect the intestinal mucosal barrier of rats with gut ischemia-reperfusion injury from damage.KEY WORDS: decoction to help recover intestinal function; gut ischemia-reperfusion injur

7、y; intestinal mucosal barrier大量研究顯示腸道活躍參與創(chuàng)傷、燒傷和感染后的各種應激反應，是多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)發(fā)生的始動器官1-2。腸缺血-再灌注損傷是腸黏膜屏障破壞的基本因素之一。腸功能恢復湯由大黃、丹參等10余味中藥組成，具有促進腸蠕動，促進術后腸功能恢復及腸道營養(yǎng)吸收等作用，其對腸道黏膜屏障是否具有保護作用，目前尚未見相關報道。本實驗通過觀察腸功能恢復湯對腸缺血-再灌注損傷大鼠腸黏膜屏障的影響，探索MODS新的防治途徑。1  材料與方法1.1  材料

8、60;SD大鼠45只，SPF級，雌雄不限，體重(248.3±16.3)g，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。T6型新世紀紫外光分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；超速離心機(北京醫(yī)用離心機廠)；RM2025型組織切片機(德國LEICA公司)；Olympus光學顯微鏡(日本)；H-600型透射電鏡(日本日立公司)；VIDAS-21型自動圖像分析儀(德國OPTON)；DAO標準品、鄰聯(lián)二茵香胺購自美國Sigma公司；D-乳酸標準品、D-乳酸脫氫酶購自南京凱基生物發(fā)展有限公司；溶菌酶購自中科院生物物理所生化廠，溶壁微球菌由西安交通大學醫(yī)學院免疫學與病原生物學系提供。腸功能恢復湯

9、：大黃20 g(后下)、丹參12 g、黨參15 g、白術15 g、陳皮15 g、木香12 g、桃仁12 g、赤芍15 g、火麻仁30 g、枳實12 g等組成，由西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院中藥制劑科提供，濃縮煎制成濃度為11藥液(含生藥1 g/mL)，滅菌處理后4 冰箱內保存。1.2  腸缺血-再灌注損傷動物模型3的建立 大鼠于造模前24 h禁食，自由飲水。稱重后給予腹腔注射100 mL/L水合氯醛(30 mg/100 g)麻醉，實驗臺上仰臥固定，腹部脫毛后常規(guī)消毒鋪無菌巾，取腹部正中切口進腹，暴露腸系膜上動脈(superior mesenteric artery, SM

10、A)，各組分別用無創(chuàng)夾夾閉其根部45 min，松夾即為再灌注。1.3  動物分組 45只大鼠隨機分為3組，正常對照組(control group)15只：正常大鼠生理鹽水灌胃；腸缺血-再灌注損傷模型組(I/R group)15只：造模后 ，生理鹽水灌胃；腸功能恢復湯治療組(decoction group)15只：造模后即給予腸功能恢復湯灌胃；均為1 mL/100 g，2次/日，連續(xù)2日。1.4  血清二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸含量的測定各組動物于造模成功48 h后，用100 mL/L水合氯醛(30 mg/100 g)麻醉，嚴格無菌操作下采取門靜脈血，采用黎君友

11、等4的分光光度法測定血清DAO活性；采用Brandt等5的分光光度法測定血清D-乳酸含量，均嚴格按說明書操作。1.5  小腸灌洗液中溶菌酶含量的測定 麻醉后立即剖腹切取從屈氏韌帶到距回盲部5 cm處的腸管，用生理鹽水洗去漿膜上的污物，然后以100 mL/L乙酸50 mL灌洗小腸，將小腸灌洗液在4 ，5 000 r/min，離心30 min，收集上清液裝入透析袋，透析18 h除去乙酸以及其他小分子物質，然后冷凍干燥，得到小腸灌洗液乙酸溶解物，用瓊脂平板擴散法測其溶菌酶的含量。1.6  細菌培養(yǎng) 麻醉后，無菌條件下打開腹腔，分別取腸系膜淋巴結(mesente

12、ric lymph node, MLN)、肝及脾組織各0.5 g，加入生理鹽水1 mL制成勻漿，取勻漿液0.5 mL，接種于直徑10 cm中國蘭培養(yǎng)基平皿內，同時取腸系膜上靜脈血0.5 mL加入血培養(yǎng)基中作細菌培養(yǎng)，37 條件下孵育48 h，如果培養(yǎng)基平皿菌落數(shù)多于100個/g組織記為細菌培養(yǎng)陽性，細菌移位率按細菌培養(yǎng)的陽性臟器數(shù)/培養(yǎng)臟器總數(shù)計算。1.7  小腸黏膜病理形態(tài)學觀察和小腸絨毛高度的測量 麻醉后于距盲腸5 cm處取回腸組織，100 mL/L甲醛固定，石蠟包埋切片，行HE染色，光鏡觀察。每只動物選取一張石蠟切片，在病理圖像分析儀上進行黏膜厚度、絨毛高度、隱窩深度

13、的測量。于距盲腸5 cm處取回腸組織約0.5 cm，用生理鹽水沖洗管腔，將腸管縱向剪開，漿膜面向下鋪于無水濾紙上，將組織切成1 mm×3 mm之組織塊，置于3 mL/L戊二醛溶液中固定24 h，10 g/L四氧化鋨固定，梯度乙醇及丙酮脫水，Epon802樹脂包埋，超薄切片包埋、切片，醋酸鈾，枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察。1.8  統(tǒng)計學處理 試驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差( ±s)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，兩組間進行均數(shù)差別比較的t檢驗，細菌移位率采用Fisher確切概率法進行檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2  結果2.1  各組