移植的神經(jīng)干細(xì)胞在腦損傷區(qū)殼聚糖載體中的存活與分化

1、移植的神經(jīng)干細(xì)胞在腦損傷區(qū)殼聚糖載體中的存活與分化                作者：衣昕，毛偉峰，田美玲，秦建兵，金國華   【摘要】  目的：探討移植的NSCs在大鼠腦損傷區(qū)殼聚糖載體中的存活、分化情況及其對TBI大鼠認(rèn)知功能的影響。方法：低溫冷凍干燥法制備殼聚糖多孔支架。將從鼠胚前腦中分離的NSCs擴(kuò)增、標(biāo)記BrdU。Feeney法制備SD大鼠TBI模型，隨機(jī)分為3組：損傷對照組清創(chuàng)后不做移植；NSCs+支架移植組行殼

2、聚糖作載體的NSCs移植；NSCs+支架+ NGF移植組行殼聚糖作載體的NSCs移植，并在其中加入NGF。術(shù)后1、2、3個月行避暗回避和跳臺試驗(yàn)。腦切片行Nissl染色、BrdU與NF-200免疫熒光雙標(biāo)染色。結(jié)果：兩移植組的認(rèn)知功能在術(shù)后1、2、3個月較損傷對照組明顯改善，含NGF的移植組改善更加顯著。兩移植組術(shù)后1、2、3個月在移植區(qū)均可見BrdU與NF-200免疫熒光雙標(biāo)細(xì)胞，含NGF移植組中的雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)量多、胞體大、突起多且長。結(jié)論：大鼠TBI后移植的外源性NSCs可以在腦損傷區(qū)殼聚糖載體中長期存活并向神經(jīng)元分化，可以改善大鼠的認(rèn)知功能；NGF對其具有促進(jìn)作用。 【關(guān)鍵詞】 

3、 創(chuàng)傷性腦損傷；殼聚糖； 神經(jīng)干細(xì)胞； 移植；神經(jīng)元；神經(jīng)生長因子   Abstract   Objective: To explore the survival and differentiation of transplanted NSCs in the chitosan porous scaffold within the cerebral cortex lesion of rats and the influence on the cognitive function of rats with TBI. Methods:  The po

4、rous chitosan scaffold was made by Freezing-drying technique. The NSCs coming from rat fetal forebrain were labeled with BrdU. Sprague-Dawley(SD) rats TBI models were made by Feeneys method. The TBI rats were randomly divided into injury-control group, NSCs+scaffold group and NSCs+scaffold+NGF group

5、. The rats were immediately debrided after injury, then NSCs combined with the chitosan porous scaffold were transplanted into injured cerebral cortex in NSCs+ scaffold group, NSCs combined with the chitosan porous scaffold and NGF were transplanted into injured cerebral cortex in NSCs+ scaffold +NG

6、F group. Rats were tested for cognitive function using step-through and step-down test at 1, 2 and 3 months postop. Nissl staining and NF-200/BrdU double immunofluorescence were used for brain sections. Results:  Significant improvement in cognitive function was observed after transplantation i

7、n two transplanting groups, and the cognitive function improvement of rats in NSCs+scaffold+NGF group was more obvious than that of rats in NSCs+scaffold group. NF-200 and BrdU double-labeled cells were detected in the transplantation zone of two transplanting groups at 1, 2 and 3 months postop. The

8、 number of BrdU and NF-200 double-labeled cells with more and longer processes in NSCs+scaffold+NGF group was more than that in NSCs+scaffold group. Conclusions:  Transplanted NSCs can survive for long time and differentiate into neurons in the chitosan porous scaffold within the cerebral corte

9、x lesion of rats with TBI, which can improve the cognitive function of rats. Ectogenic NGF can accelerate all these changes.   Key Words   Traumatic brain injury; Chitosan; Neural stem cells; Transplantation; Neuron; Nerve growth factor   創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury,

10、TBI）是以細(xì)胞丟失為主要特征的進(jìn)行性退行性病變1，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system, CNS）損傷后的再生一直是困擾人類的難題。神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）因具有自我更新、多分化潛能等特性，為移植NSCs治療TBI提供了廣闊的應(yīng)用前景。本文通過Feeney法（1981）建立大鼠TBI模型，清創(chuàng)后行殼聚糖作載體的NSCs移植治療，檢測NSCs在大鼠腦損傷區(qū)殼聚糖載體中的存活及和移植NSCs對TBI大鼠后認(rèn)知功能的影響，為應(yīng)用NSCs移植治療TBI提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。   1   材料與方法 

11、;  1.1   動物與分組   220240 g SD大鼠54只（本校實(shí)驗(yàn)動物中心提供），雌雄不拘，隨機(jī)分為損傷對照組、NSCs+支架移植組和NSCs+支架+NGF移植組各18只，每組又分為術(shù)后1個月、2個月、3個月 3個時相點(diǎn)，每組各時相點(diǎn)均為6只。   1.3   TBI模型制備   參照Feeney TBI模型法，動物經(jīng)腹腔注射復(fù)合麻醉劑Chlorpent（0.2 ml/100g）麻醉后，將頭部固定于立體定位儀，顱頂剃毛、消毒，切開頭皮直至顱骨外骨膜，以前囟后方3.5 mm 、

12、左側(cè)2.5 mm 為中心，用手術(shù)刀切除一邊長為5 mm的正方形骨瓣形成骨窗，保持硬腦膜完整。在骨窗上方垂直固定Feeneys模型打擊裝置，致傷高度25 cm，致傷物重20 g，致傷力度為500 g·cm。   1.4   損傷對照組處理   損傷對照組致傷后，立即切開硬腦膜，進(jìn)行清創(chuàng)處理，消毒生理鹽水沖洗后，縫合切口，青霉素10萬U肌肉注射，動物清醒后按性別分籠飼養(yǎng)。   1.5   NSCs移植   1.6   行為學(xué)檢測  

13、; 測試儀器和方法同金國華等報(bào)道。制備TBI模型前經(jīng)避暗回避試驗(yàn)檢測，3組大鼠的行為學(xué)無差異。術(shù)后1、2、3個月進(jìn)行（1）避暗回避試驗(yàn)：記錄3組大鼠第3 d的探索次數(shù)和第6 d的滯留時間；（2）跳臺試驗(yàn)：避暗回避試驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行，記錄第7 d的主動和總回避陽性率。   1.7   腦組織切片的制備   行為學(xué)檢測完畢，大鼠經(jīng)上述方法麻醉后，開胸經(jīng)心先后灌注生理鹽水100 ml及含有4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS 400 ml，取腦后固定6 h。再分別經(jīng)20%、30%蔗糖平衡，行冠狀位冰凍連續(xù)切片，片厚20 m。共收集2套切片，

14、均貼于涂有多聚賴氨酸的載玻片上待染色。   1.8   切片染色     1.9   圖像處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法   將NSCs+支架移植組、NSCs+支架+ NGF移植組攝取的熒光照片導(dǎo)入計(jì)算機(jī)中，利用捷達(dá)801系列形態(tài)學(xué)分析軟件計(jì)數(shù)移植區(qū)200倍視野內(nèi)BrdU與NF-200免疫熒光雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)、胞體面積和細(xì)胞（包括突起）周長。每只大鼠均取4張切片相應(yīng)部位的平均值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。   采用Stata7.0統(tǒng)計(jì)軟件，對3組大鼠避暗回避試驗(yàn)的探索次數(shù)和滯留時間以及

15、跳臺試驗(yàn)的主動和總回避陽性率行方差分析；對兩個不同移植組BrdU與NF-200免疫熒光雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)、胞體面積和細(xì)胞周長行t檢驗(yàn)。            2   結(jié)   果   2.1   行為學(xué)檢測     2.2   Nissl染色   損傷對照組創(chuàng)傷區(qū)可見到燒杯狀缺損，創(chuàng)傷側(cè)海馬嚴(yán)重萎縮變形，見海馬CA3區(qū)及齒狀回細(xì)胞排列紊亂、丟失

16、。兩移植組創(chuàng)傷區(qū)有移植物填充，移植物中均可見到許多尼氏陽性細(xì)胞，術(shù)后3個月時移植物均已經(jīng)與宿主整合，殼聚糖支架已經(jīng)部分降解，創(chuàng)傷側(cè)海馬CA3區(qū)及齒狀回的細(xì)胞雖有排列紊亂和丟失，但萎縮變形不明顯。   2.3   BrdU與NF-200免疫熒光雙標(biāo)記   損傷對照組結(jié)果為陰性。兩移植組中BrdU的標(biāo)記呈紅色，NF-200的標(biāo)記呈綠色。相同視野不同激發(fā)光和吸收光波長下所攝取的照片經(jīng)軟件重疊處理可見移植區(qū)中BrdU與NF-200雙標(biāo)細(xì)胞的胞核呈紅色，胞漿及突起呈綠色。NF-200陽性細(xì)胞BrdU絕大多數(shù)也為陽性。   術(shù)

17、后1、2、3月兩移植組BrdU與NF-200免疫熒光雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)、胞體面積、細(xì)胞周長以及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表3。   3   討   論   以往TBI的治療側(cè)重于藥物治療以減輕急性期的繼發(fā)性腦損傷和提高慢性進(jìn)展期存活腦組織的功能，而應(yīng)用NSCs治療TBI只在最近才開始被研究。雖然NSCs存在于多個腦區(qū)，但自體NSCs應(yīng)對腦損傷產(chǎn)生新神經(jīng)細(xì)胞的能力有限，而且誘導(dǎo)腦區(qū)自體NSCs定向遷移與分化的研究尚未取得突破性的進(jìn)展。因此移植外源性細(xì)胞治療腦損傷成為主要的研究方向之一?？晒┮浦驳募?xì)胞種類很多，如永生化祖細(xì)胞、NSCs、胚

18、胎神經(jīng)組織、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、臍血細(xì)胞、有絲分裂后神經(jīng)元等，由于NSCs具有多向分化潛能、低免疫原性、取材容易、來源廣泛等特點(diǎn)，因此在細(xì)胞移植治療方面，無論從臨床應(yīng)用，還是倫理角度都顯示出了更大的優(yōu)勢。   外源性NSCs在移植部位微環(huán)境中的存活是遷移、分化的前提條件。移植物的存活可能與移植細(xì)胞組織類型、移植途徑、移植時間及部位等因素有關(guān)。為了更好地模擬臨床治療，避免造成二次損傷，本實(shí)驗(yàn)在創(chuàng)傷急性期即在損傷區(qū)行殼聚糖作載體的NSCs移植。在腦損傷急性期創(chuàng)傷側(cè)的皮質(zhì)、海馬等結(jié)構(gòu)中有許多引起繼發(fā)性腦損傷的細(xì)胞因子或毒素的釋放，但這些微環(huán)境表達(dá)的蛋白如nestin和cyclinD1等

19、為損傷區(qū)提供了類似于胚胎期的微環(huán)境，從而使得NSCs能夠存活58，本實(shí)驗(yàn)中術(shù)后1、2、3個月均檢測到BrdU標(biāo)記的陽性細(xì)胞也證實(shí)了這一點(diǎn)。移植物的長期存活是移植成功與否的關(guān)鍵，本實(shí)驗(yàn)在移植術(shù)后3個月仍能檢測到較多BrdU標(biāo)記的陽性細(xì)胞，這可能與殼聚糖支架的應(yīng)用不無關(guān)系，體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)殼聚糖具有良好的生物相容性，腦損傷區(qū)殼聚糖多孔三維支架為移植的細(xì)胞提供了獲取營養(yǎng)、氣體交換、排泄廢物和生長代謝的場所，為形成新的具有形態(tài)和功能的組織提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。同時，移植的NSCs可表達(dá)一些神經(jīng)遞質(zhì)受體，CNS中的神經(jīng)遞質(zhì)可促進(jìn)NSCs的存活和增殖10。NSCs具有低免疫原性，腦又是相對的免疫豁免器官，從而有利

20、于移植細(xì)胞的長期存活。   研究認(rèn)為外源性NSCs的分化是由局部微環(huán)境所決定的。NSCs能對周圍的信號做出反應(yīng)，如腦損傷后局部表達(dá)的白介素(interleukin, IL)能促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元方向分化；堿性成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor-basic，bFGF)、白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor , LIF)等能促進(jìn)NSCs增殖；神經(jīng)生長因子家族均有促進(jìn)NSCs分化的作用11。而損傷局部神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生、腦局部組織間液類似血清的成份、神經(jīng)營養(yǎng)因子減少或消失等各種綜合環(huán)境均可誘導(dǎo)存活的NSCs

21、60; 1 Joost W , Schouten, Carl T， et al. A review and rationale for the use of cellular transplantation as a therapeutic strategy for traumatic brain injuryJ. Neurotrauma, 2004, 21(11):1501-1538.譚雪鋒, 金國華, 田美玲,等. 人胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的分離、克隆和分化J. 神經(jīng)解剖學(xué)雜志, 2004,20(3):262-266.黃 鎮(zhèn), 金國華, 張新化等.提高成年大鼠神經(jīng)干細(xì)胞單克隆形成率的方法J. 解剖學(xué)報(bào),2002,33(6):594-598.金國華, 毛偉峰, 秦建兵,等. 神經(jīng)生長因子對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的保護(hù)作用J. 中國臨床康復(fù), 2005, 9(16):103-105.Galli R, Gritti A, Bonfanti L, et al. Neura