谷氨酸生產(chǎn)菌的選育

1、谷氨酸生產(chǎn)菌的選育 生化121 22號(hào)n谷氨酸生產(chǎn)菌的選育方法，主要是采用常規(guī)的誘變育種及遺傳工程技術(shù)構(gòu)建工程菌株。誘變育種n利用各種誘變劑處理微生物細(xì)胞，提高基因的隨即突變頻率，擴(kuò)大變異幅度，通過一定的篩選方法，獲取所需要優(yōu)良菌株的過程，稱為誘變育種。n誘變育種包括誘變和篩選兩個(gè)部分：首先，以合適的誘變劑處理大量而均勻分散的微生物細(xì)胞懸浮液，在引起絕大多數(shù)細(xì)胞致死的同時(shí)，使存活個(gè)體中DNA結(jié)構(gòu)用適宜的方法淘汰負(fù)效應(yīng)變異株，選出極少數(shù)性能優(yōu)良的正變異株，以達(dá)到培育優(yōu)良菌株的目的。誘變育種的基本流程n合適的出發(fā)菌株制備待處理的菌懸液誘變處理篩選保藏和擴(kuò)大試驗(yàn)谷氨酸生產(chǎn)菌的誘變育種流程n以菌株AS

2、L299為出發(fā)菌株，采用復(fù)合誘變劑進(jìn)行誘變n在誘變育種實(shí)踐中，為了獲得協(xié)同效應(yīng)，常常采取誘變劑進(jìn)行復(fù)合處理，可以是兩種或多種誘變劑的先后使用，或是同一種誘變劑的重復(fù)使用，或是兩種或多種誘變劑的同時(shí)使用。n出發(fā)菌株ASL299菌懸液制備硫酸二乙酯誘變單氟乙酸平板篩選高糖平板篩選高谷氨酸平板篩選搖瓶篩選DES突變株原生質(zhì)體制備紫外線誘變原生質(zhì)體再生香豆素和氯化鋰平板篩選谷氨酸為唯一碳源平板篩選搖瓶篩選UV突變株穩(wěn)定性試驗(yàn)生產(chǎn)條件試驗(yàn)谷氨酸菌誘變選育操作步驟n（1）菌懸液的制備 將出發(fā)菌株AS1.299斜面菌接入一級(jí)種子培養(yǎng)集中，32攝氏度振蕩培養(yǎng)8h，離心去清夜，加入7.0緩沖液稀釋菌體泥制菌懸液

3、。n（2）硫酸二乙酯誘變 在菌懸液中加入硫酸二乙酯，使硫酸二乙酯濃度為1%（體積分?jǐn)?shù)），在電磁攪拌下處理2030分鐘，處理后加入硫代硫酸鈉終止反應(yīng)。n（3）單氟乙酸平板篩選 將誘變的菌懸液涂布在含0.5%單氟乙酸的平板上，在32攝氏度的條件下避光培養(yǎng)3648h,挑取生長良好的菌落。n（4）高糖平板篩選與高谷氨酸平板篩選 將抗單氟乙酸的菌株涂在含25%葡萄糖的平板上，培養(yǎng)48h后，挑取生長良好的菌落，可得到耐高糖菌株。然后，將耐高糖菌株涂在含20%谷氨酸的平板上，培養(yǎng)48h后，挑取生長良好的菌株，即得到耐高谷氨酸菌株。n（5）搖瓶篩選 將突變株接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)集中，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，比較菌株的谷氨酸

4、產(chǎn)量，選出谷氨酸高產(chǎn)菌株。n(6)原生質(zhì)體制備 將DES突變株的斜面菌接入一級(jí)種子培養(yǎng)集中，32攝氏度振蕩培養(yǎng)5h，加入青霉素G，使青霉素G的濃度為0.6U/ml，繼續(xù)培養(yǎng)3h，離心棄去上清液，用高滲穩(wěn)定液洗滌2次，將菌體與高滲穩(wěn)定液混合，于裝有玻璃珠的無菌三角瓶充分振蕩，制成菌體的高滲懸液，調(diào)節(jié)菌體濃度為（1-3） 個(gè)/ml。然后，加入溶菌酶，使其濃度為200-800U/ml，恒溫32攝氏度振蕩處理，鏡檢觀察原生質(zhì)體的形成情況，當(dāng)95%以上的細(xì)胞變?yōu)樵|(zhì)體時(shí)，離心棄去上清液，用高滲穩(wěn)定液洗滌2次，最后制成原生質(zhì)體的高滲懸液。取1ml原生質(zhì)體懸液，用無菌水稀釋后涂布于完全培養(yǎng)基上恒溫28攝氏

5、度培養(yǎng)72h，以霉檢前的菌懸液為對(duì)照，根據(jù)在平板上形成的菌落數(shù)計(jì)算原生質(zhì)體形成率，計(jì)算公式如下：原生質(zhì)體形成率=酶解前的菌落數(shù)霉解后的菌落數(shù)酶解前的菌落數(shù)n(7)原生質(zhì)體的紫外線誘變 取5ml原生質(zhì)體懸液放入已滅菌的9cm的培養(yǎng)皿中，采用15W，波長為253.7nm左右的紫外線燈進(jìn)行照射，照射距離為30cm，照射時(shí)間為20-40h。照射過程采用電磁攪拌以使照射均勻。n(8)原生質(zhì)體再生 紫外線誘變后，用高滲穩(wěn)定液對(duì)原生質(zhì)體懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，吸取0.1ml涂布于下層固定體再生培養(yǎng)基上，再加入上層固體再生培養(yǎng)基，輕微搖勻，雙層平板法于28攝氏度培養(yǎng)72h。取1ml原生質(zhì)體懸液，用高滲穩(wěn)定液稀釋后涂布于下層固體再生培養(yǎng)基上恒溫28攝氏度培養(yǎng)72h。更具在平板上形成的菌落數(shù)計(jì)算原生質(zhì)體再生率，原生質(zhì)體再生率=%100酶解后的菌落數(shù)酶解前的菌落數(shù)酶解后的菌落數(shù)再生的菌落數(shù)n（9）香豆素和氯化鋰平板篩選 挑取再生菌落涂在0.15%香豆素和0.5氯化鋰的平板上，在32攝氏度的條件下培養(yǎng)48h后，挑取生長良好的菌落。n（10）谷氨酸唯一碳源平板篩選 用牙簽法將抗維生素P類衍生物菌株接到以谷氨酸為唯一碳源平板上，在32攝氏度的條件下培養(yǎng)48h后，挑取省長微弱或不聲張的菌株，即為不利用谷氨酸的菌落。n（11）搖瓶篩選與穩(wěn)定性試驗(yàn) 經(jīng)谷氨酸為唯一碳源平板篩選后，