根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

1、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展摘要：根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)因具有操作簡便，轉(zhuǎn)化效率高，容易得到單拷貝隨機(jī)插入的轉(zhuǎn)化子，并且轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定等特點(diǎn)而成為近年來絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的主要研究手段之一，也使該系統(tǒng)有可能成為絲狀真菌基因組研究的有力工具。本文就根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化絲狀真菌原理、過程、種類、影響轉(zhuǎn)化效率的因素及其應(yīng)用等方面進(jìn)行了綜述。 關(guān)鍵詞 根癌農(nóng)桿菌；絲狀真菌；遺傳轉(zhuǎn)化絲狀真菌(（filamentous fungi) 是真菌中一個很大類群，通常指那些菌絲體比較發(fā)達(dá)而又不產(chǎn)生大型子實體的真菌。其在自然條件下常引起食物、工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的霉變和植物的真菌病害,，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥及基礎(chǔ)生物學(xué)研

2、究中具有重要作用。絲狀真菌中很多種具有重要的經(jīng)濟(jì)價值,，還有一些是昆蟲、植物、動物和人類的重要致病菌,，如綠僵菌(（Metarhizium anisopliae)、稻瘟菌(（Magnaporthe grisea)和煙曲霉(（Aspergillus fumigatus)等.。而構(gòu)巢曲霉(（Aspergillus nidulans)和粗糙脈孢霉(（Neurospora crassa)由于結(jié)構(gòu)簡單,，通常被作為真核微生物的“模式”種用于基礎(chǔ)研究11.。由于絲狀真菌在經(jīng)濟(jì)上和科學(xué)中的重要性,，多年來一直被廣泛地研究.。 近年來發(fā)展了很多轉(zhuǎn)化的方法,，但并非所有方法都適用于絲狀真菌.。 以往絲狀真菌的常

3、規(guī)轉(zhuǎn)化方法有PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，限制酶介導(dǎo)的插入突變(（Restriction enzyme-mediated insertional,， REMI)等,，但是這些轉(zhuǎn)化技術(shù)或需要制備原生質(zhì)體、或轉(zhuǎn)化效率低阻礙了它們在研究絲狀真菌功能基因中的應(yīng)用。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系(（Agrobacterium tumefaciens mediated transformation,，ATMT)克服了這些缺點(diǎn)為絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化和功能基因研究提供了有力的工具，現(xiàn)已被廣泛地運(yùn)用于絲狀真菌的遺傳操作目前已經(jīng)實現(xiàn)了對泡盛曲霉(（Aspergilus awamori)、粗糙脈孢菌(（Neurospora c

4、rassa)、尖孢鐮刀菌(（Fusarium oxysporum)和瓜類炭疽(（Colletotrichum lagenarium)等6600多種真菌的遺傳轉(zhuǎn)化22。11、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的絲狀真菌的原理和種類根癌農(nóng)桿菌是革蘭氏陰性土壤桿菌自然情況下它可通過傷口侵入植物導(dǎo)致受傷部位產(chǎn)生癭瘤，并將其T-DNA序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞并整合到植物染色體上 531利用這一原理得到第一批能表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因植物。根癌農(nóng)桿菌正被廣泛地應(yīng)用到植物的遺傳轉(zhuǎn)化中。在大腸桿菌與酵母菌能夠通過接合的方式將前者的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到后者4和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物等現(xiàn)象的啟下，Bundock 等人嘗試用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)酵母菌的遺傳轉(zhuǎn)化，

5、發(fā)現(xiàn)根癌農(nóng)桿菌可以轉(zhuǎn)化釀酒酵母(（Saccharomyces cerevisiae)651，顯示了根癌農(nóng)桿菌能夠轉(zhuǎn)化除植物以外的其他物種。許多科研工作者也紛紛投入到利用該方法對其他真菌的遺傳轉(zhuǎn)化的工作中，拓寬了根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化范圍。 與根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化相似，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化真菌時，同樣需要vir(（virulence)基因的活化，即T-DNA(（transferred DNA)轉(zhuǎn)移至真菌同植物一樣是依賴于毒性系統(tǒng)的。Michieise等利用一系列毒性蛋白基因缺失的農(nóng)桿菌突變體轉(zhuǎn)化Aspergillus awamori，以闡明不同毒性蛋白在T-DNA轉(zhuǎn)移至Aawamori的作用。研究結(jié)果顯示

6、，任何一個調(diào)節(jié)蛋白(（VirA，VirG)，或者是轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白(（virB)，或是T鏈復(fù)合物形成蛋白(（VirD，VirC，VirE22)的失活都會嚴(yán)重的降低轉(zhuǎn)化效率。這一結(jié)果表明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)Aawamori的高效轉(zhuǎn)化需要一個完整的T-DNA轉(zhuǎn)移機(jī)制。這些都證明農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化高等和低等真核生物的機(jī)理具有一定的保守性。然而，Michielse等的研究也顯示，VirE33， VirH，VirF毒性蛋白，在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化Aawamori的過程中并不是必需的。另有研究表明控制農(nóng)桿菌向植物細(xì)胞附著的chvA，chvB及exoC基因在酵母的轉(zhuǎn)化中也并非必不可少。因此，根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化真菌的機(jī)理還需要由更多相關(guān)的試驗

7、研究來闡明。22、絲狀真菌ATMT轉(zhuǎn)化大致過程絲狀真菌ATMT遺傳轉(zhuǎn)化過程比較簡單,， 不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備,， 且基本相同，依次為構(gòu)建二元載體、活化根癌農(nóng)桿菌、準(zhǔn)備真菌分生孢子和共轉(zhuǎn)化，大致如下:： 根據(jù)實驗?zāi)康臉?gòu)建二元載體，挑取攜有雙元載體的根癌農(nóng)桿菌單菌落到含有相應(yīng)抗生素的基本培養(yǎng)(（minimalmedium,，MM)中培養(yǎng)過夜;；收集菌體用誘導(dǎo)培養(yǎng)液 (（inductionmedium,， IM)洗滌并稀釋至一定的濃度后待用或在含有乙酰丁香酮(（AS,， acetosyringone)的誘導(dǎo)培養(yǎng)液中培養(yǎng)后再使用;；取前述農(nóng)桿菌液與等量新鮮的真菌受體混合,，并涂布于固體共培養(yǎng)基(（co

8、-cultivationmedium,，CM)承載的濾膜上(（或以液體形式混合振蕩培養(yǎng)),，恒溫培養(yǎng)一段時間;；洗脫(（或吸取)共培養(yǎng)物,，涂布選擇性平板,，培養(yǎng)至菌落形成后挑取轉(zhuǎn)化子，將抗性菌落轉(zhuǎn)移至新鮮含有適宜抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，收集菌絲體提取抗性菌落的基因組DNA， 通過Southern雜交來鑒定陽性轉(zhuǎn)化子和確定插入T-DNA 的拷貝數(shù)，以及通過TAIL-PCR(（thermal asvmmetric interlaced PCR)技術(shù)來獲取T-DNA 的側(cè)翼序列。33、 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)通過基因插入失活獲得能覆蓋整個基因組的突變體庫是功能基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)性工作

9、，但是建立真菌突變體庫的傳統(tǒng)方法都存在缺點(diǎn)如轉(zhuǎn)座子法的插入位點(diǎn)不完全隨機(jī)，而且傾向于插入非編碼位點(diǎn)；REMI導(dǎo)致較高比例的非質(zhì)粒插入突變體，而且易產(chǎn)生多拷貝插入，這給突變體分析帶來很多麻煩。相對于轉(zhuǎn)座子和REMI技術(shù)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌轉(zhuǎn)化具有以下四個特點(diǎn)：33.11多種類型轉(zhuǎn)化受體很多真菌在DNA 轉(zhuǎn)化時仍然需要制備原生質(zhì)體6。不同真菌原生質(zhì)體制備的條件差異很大，因此往往碰到原生質(zhì)體制備率或再生率低5等問題。而ATMT轉(zhuǎn)化的受體材料可以是多種類型的，既可以用原生質(zhì)體，也可以用分生孢子、菌絲甚至真菌組織體6。33.22轉(zhuǎn)化效率高同傳統(tǒng)的真菌轉(zhuǎn)化方法，如PEGCaCI22法相比，ATMT方法的轉(zhuǎn)化

10、效率有明顯提高。研究表明農(nóng)桿菌介導(dǎo)絲狀真菌的轉(zhuǎn)化效率一般在33000077220000個轉(zhuǎn)化子每110077個細(xì)胞 比一般真菌轉(zhuǎn)化方法高11000011000000倍661。333.3隨機(jī)插入單拷貝ATMT的非同源轉(zhuǎn)化，大部分轉(zhuǎn)化子為單拷貝的T-DNA 插入。轉(zhuǎn)化子基因組中T-DNA插入比例高，且多為單拷貝插入。 REMI方法轉(zhuǎn)化的突變體2200110000都不是由DNA插入引起的l5】，而農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的突變體有9900以上都是由DNA插入引起的7【21。33.44轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化體系可以利用各種形式的受體因此當(dāng)采用具有單核的分生孢子為轉(zhuǎn)化受體時可以得到后代不分離的轉(zhuǎn)化子，

11、避免了真菌菌絲多核所造成的轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定的難題。而轉(zhuǎn)座子法和REMI等轉(zhuǎn)化方法都需要采用多核的菌絲為原料置備原生質(zhì)體，產(chǎn)生不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化后代。44 、影響根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素轉(zhuǎn)化效率高低是衡量一個轉(zhuǎn)化系統(tǒng)好壞的重要指標(biāo)研究表明轉(zhuǎn)化條件對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化效率有明顯的影響。影響轉(zhuǎn)化效率的因素包括農(nóng)桿菌菌株的類型、真菌受體類型、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的濃度、已酰丁香酮的用量、共培養(yǎng)時間和溫度等。4.14.1 農(nóng)桿菌菌株對轉(zhuǎn)化效率的影響能夠轉(zhuǎn)化絲狀真菌的農(nóng)桿菌有很多種，目前比較不同菌株對轉(zhuǎn)化效率影響的實驗還很少，因此不能判斷哪個是最有效的轉(zhuǎn)化菌株2。但是可以肯定菌株類型對轉(zhuǎn)化效率是有影響的，而

12、一些菌株根本不能用于特定真菌的轉(zhuǎn)化。44.22真菌受體對轉(zhuǎn)化效率的影響選擇合適的受體組織對于實現(xiàn)絲狀真菌高效快捷的轉(zhuǎn)化非常重要。大多數(shù)絲狀真菌很容易培養(yǎng)產(chǎn)生大量的分生孢子,，因此采用孢子或剛萌發(fā)的孢子作為受體通常是真菌轉(zhuǎn)化中最方便高效的選擇38。對于產(chǎn)孢子能力差甚至于不產(chǎn)孢的菌株,，可以直接以菌絲體組織為受體進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作。采用不同受體組織,，轉(zhuǎn)化效率往往會受到影響。44.33 乙酰丁香酮對轉(zhuǎn)化效率的影響Michielse等研究表明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的原理相同,，都需要一系列Vir蛋白的參與其中VirF、VirH和VirE33是絲狀真菌轉(zhuǎn)化不可缺少1891。乙酰丁香酮(（AS

13、)在轉(zhuǎn)化中的作用是誘導(dǎo)Vir毒蛋白的產(chǎn)生.。研究表明AS是轉(zhuǎn)化成功與否的決定性因素對Beauveria bassiana、 Fusarium oxysporum 和Trichode viride等真菌的轉(zhuǎn)化條件研究表明在誘導(dǎo)過程中不加入AS會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率的降低1910】。而共培養(yǎng)過程中缺少AS會導(dǎo)致無轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)生611】 另外乙酰丁香酮在誘導(dǎo)和共轉(zhuǎn)化過程中的濃度也影響轉(zhuǎn)化效率。44.44 菌體濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響轉(zhuǎn)化受體的細(xì)胞濃度和農(nóng)桿菌的濃度都影響轉(zhuǎn)化效率。較高的受體孢子濃度轉(zhuǎn)化率相對較高。同樣使用較高濃度的農(nóng)桿菌也可以提高轉(zhuǎn)化效率。但是對這兩個因素來說其最高使用濃度都有一定的界限12當(dāng)受體

14、真菌的細(xì)胞濃度過高時則導(dǎo)致真菌的過量生長而不能挑出轉(zhuǎn)化子,，使轉(zhuǎn)化效率降低.。I2O131同樣原因,，當(dāng)農(nóng)桿菌濃度過高時由于農(nóng)桿菌過度生長引起嚴(yán)重污染,，也會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率下降。44.55 轉(zhuǎn)化時間對轉(zhuǎn)化效率的影響轉(zhuǎn)化時間是影響轉(zhuǎn)化效率的另一因素一些研究也證明4488h為最佳共培養(yǎng)時間14，隨著共培養(yǎng)時間的延長，抗性轉(zhuǎn)化子的數(shù)目也隨之增多。但是對于不同的絲狀真菌來說所采用的共培養(yǎng)時間差異很大15。44.66轉(zhuǎn)化溫度對轉(zhuǎn)化效率的影響共轉(zhuǎn)化溫度也是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素研究者對22003377這一溫度范圍農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行了研究認(rèn)為22222255是最適的轉(zhuǎn)化溫度16.。過高的轉(zhuǎn)化溫度會使農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)

15、化功能喪失,，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率降低。55 、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)真菌遺傳轉(zhuǎn)化的應(yīng)用55.11利用基因敲除研究基因功能利用基因敲除方法可為研究基因功能提供最直接最有力的證據(jù)17。當(dāng)T-DNA中含有與宿主基因組同源的序列時，T-DNA就會以同源重組的方式整合進(jìn)基因組，并且雙交換同源重組占相當(dāng)比例18。因此，將目標(biāo)基因的部分序列克隆至T-DNA 兩個邊界之間，構(gòu)建目標(biāo)基因的打靶載體，然后利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，就可以實現(xiàn)目標(biāo)基因的敲除，進(jìn)而根據(jù)表型變化來研究該基因的功能。55.22利用基因插入突變標(biāo)記、克隆相關(guān)基因插入突變是另一個反向遺傳學(xué)的研究方法19。當(dāng)T-DNA中不存在與受體染色體同源序列時， T-

16、DNA主要以異源重組形式整合進(jìn)染色體基因組中。因此,，可利用T-_DNA 標(biāo)簽法產(chǎn)生插入突變從而分離克隆真菌相關(guān)基因20。66、前景及展望真菌的遺傳轉(zhuǎn)化的效率極大的影響著真菌功能基因組學(xué)研究的開展和深入。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌的轉(zhuǎn)化，克服了絲狀真菌用常規(guī)轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化率低、操作繁雜等缺點(diǎn)。也正由于這一轉(zhuǎn)化系統(tǒng)具有操作簡便、轉(zhuǎn)化高效穩(wěn)定、T-DNA在真菌染色體基因組中的隨機(jī)插入以單位點(diǎn)為主、位點(diǎn)整合精確且可轉(zhuǎn)移大片段DNA等優(yōu)點(diǎn)，非常適合于構(gòu)建各種真菌的隨機(jī)插入突變體庫,，有利于新基因的標(biāo)記和快速克隆21，使該系統(tǒng)成為絲狀真菌基因組研究的有力工具，并顯示出了良好的發(fā)展?jié)摿Γ哂袕V闊的應(yīng)用前景22

17、。相信隨著對農(nóng)桿菌介導(dǎo)真菌遺傳轉(zhuǎn)化各個因素的進(jìn)一步深入研究和探討， 更多的真菌將會利用該方法成功地實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。參考文獻(xiàn)1Yan PS (閆培生), Luo XC (羅信昌), Zhou Q (周啟). Advanceand prospectof filamentous fungi gene engineering.ProgBiotech(生物工程進(jìn)展), 1999,19: 36412 Michielse CB,Hoykaas PJ,v&n den Hondel CA,et 01Agrobacterium-mediated transformation as tool for func

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