RNA干擾技術的原理與應用

1、RNA干擾技術的原理與應用 RNA干擾( RNAinterference , RNAi )是通過小干擾 RNA ( small interference RNA, siRNA ) 造成目的mRNA特異性降解, 從而使基因轉(zhuǎn)錄后沉默的一種現(xiàn)象。這一現(xiàn)象廣泛存在于自然界, 是生物體進化過程中抵御外來基因侵害的一種機制, 為穩(wěn)定基因組發(fā)揮了重要作用。由于 RNAi可以作為一種簡單、 有效的代替基因剔除的遺傳工具,正在功能基因組學領域掀起一場真正的革命, 并將加快這個領域的研究步伐。1 RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展1995年, Guo等用反義 RNA阻斷秀麗新小桿線蟲的 part 1基因的實驗中發(fā)現(xiàn), 正

2、義和反義 RNA都阻斷了該基因的表達,這與傳統(tǒng)上對反義 RNA技術的解釋相反。1998年 2月卡耐基研究院的 F i re等將雙鏈 RNA ( doublestranded RNA, ds RNA)轉(zhuǎn)入細胞內(nèi),發(fā)現(xiàn)靶基因的 mRNA發(fā)生了降解,證實高度純化的 ds RNA 可以高效特異的阻斷相應的基因表達,而且效率比單鏈 RNA至少高 2個數(shù)量級,首次揭示了 Guo等遇到的現(xiàn)象,即為 RNAi。隨后研究發(fā)現(xiàn), RNAi現(xiàn)象廣泛存在于各種生物中,是一種古老的重要保護機制, RNAi技術作為一種重要的研究手段大大加速了基因組學的研究進程,現(xiàn)已成為基因功能研究和基因治療研究的熱點。在短短幾年中,對

3、RNAi的研究取得了突飛猛進的發(fā)展, 許多令人振奮的報道相繼出現(xiàn), 2001年首次報道了在哺乳動物細胞培養(yǎng)中成功應用 RNAi技術抑制基因表達, 開創(chuàng)了 RNAi技術應用于高等生物基因功能研究的先河; 2002年, K ay研究小組首次報道了應用 RNAi技術在哺乳動物整體水平進行基因表達沉默的實驗研究;2004年哺乳動物全基因組范圍 RNAi研究也取得了重要進展,先后報道了用酶法構建全基因組 siRNA文庫新技術和應用基因組 siRNA文庫,從全基因組水平對高等動物基因功能進行高通量 RNAi研究。這些研究成果愈來愈表明, 生物體基因轉(zhuǎn)化的最終產(chǎn)物不僅僅是蛋白質(zhì),還包括相當一部分 RNA。2

4、 RNAi的作用機制細胞中 ds RNA 的存在是 RNAi形成的先決條件。ds RNA可以通過多種途徑在細胞核或細胞質(zhì)中產(chǎn)生。通過對 RNAi所進行的遺傳學和生物化學的研究,現(xiàn)已初步闡明了其作用機制。RNAi的作用機制可分為三個階段:起始階段、 效應階段和級聯(lián)放大階段。 起始階段:由 RNA 病毒入侵,轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄,基因組中反向重復序列轉(zhuǎn)錄等所產(chǎn)生的 ds RNA分子在細胞內(nèi)被一雙鏈 RNA酶!型內(nèi)切酶也叫 Dicer酶或 Dicer核酸酶同源物剪成 21 23 nt siRNA, 3 端帶有 2個堿基突出的黏性末端, 5 為磷酸基團,此結(jié)構對于 siRNA行使其功能非常關鍵。剪切位點一般在U

5、處, 具特異性。效應階段: RNAi特異性的核酸外切酶、 核酸內(nèi)切酶、 解旋酶、 輔助識別同源序列蛋白和其他一些蛋白與 siRNA結(jié)合成 RNA誘導沉默復合體R I SC ( RNAinducing silence complex , R I SC)識別靶 mRNA,其中的反義鏈與靶 mRNA互補結(jié)合,正義鏈則被置換出來。繼而, R I SC復合物中的RNase(可能是 Dicer)在靶 mRNA與 siRNA結(jié)合區(qū)域的中間將其切斷。級聯(lián)放大: 在 RNA 依賴性RNA聚合酶的作用下,以 mRNA為模板, siRNA為引物,擴增產(chǎn)生足夠數(shù)量的 dsRNA 作為底物提供給Dicer酶,產(chǎn)生更多的

6、 siRNA, 從而使效應階段反復發(fā)生,一個完整的 mRNA被降解成多個 21 23 nt的小片段, 從而導致相應的基因表達沉默。在這一過程中的多個步驟都需要 ATP , 如 R I SC復合體的形成、siRNA與靶 mRNA的配對、 靶 mRNA的切割。另外,在 dsRNA復制過程中,兩條鏈的分離可能也需要一個依賴 ATP的 RNA解旋酶。dsRNA可通過細胞微管在細胞間傳遞, 實現(xiàn)dsRNA在整個個體中的散布。RNAi在植物、 線蟲、果蠅等低等模式生物中,都可由 dsRNA誘導,在哺乳動物細胞中, > 30 bp的 dsRNA會引起干擾素效應和非特異性基因抑制, 導致 mRNA非特異

7、性降解,是醫(yī)療上應用 RNAi的一大障礙,隨后發(fā)現(xiàn)合成雙鏈的只有 19 21 nt的 siRNA卻可以避免這種效應, 特異性發(fā)揮 RNAi作用, 并發(fā)現(xiàn)在哺乳動物細胞中轉(zhuǎn)入雙鏈 RNA ( dsRNA )后導致轉(zhuǎn)錄后基因沉默比用核酶或反義 RNA更徹底、 更有效。E lbash i r等通過瞬時轉(zhuǎn)染體外合成的 21 nt雙鏈 siRNA成功誘導出了哺乳動物細胞的 RNA , i且避免了 ds RNA引起的非特異性反應,這為 RNAi技術在基因治療領域的研究鋪平了道路。3 RNAi的作用特點3 . 1 高特異性 RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制,有高度的序列特異性, 19 nt的 dsRNA幾

8、乎可以完全抑制基因的表達,而其中的 1 n t突變后, 它對基因的抑整理用就消失了, 這種高度的序列特異性能夠使 ds RNA非常特異地誘導與之序列同源的 mRNA降解, 避免降解與目的 mRNA同家族的其他 mRNA,從而實現(xiàn)對目的基因的精確沉默。因此, RNAi具有重大的醫(yī)學價值。3 . 2 高效性 RNAi存在級聯(lián)放大效應, 由于 Dicer酶切產(chǎn)生的 siRNA 與同源 mRNA 的結(jié)合并降解后者,產(chǎn)生新的 siRNA;新產(chǎn)生的 siRNA可再次與 Dicer酶形成 RISC復合體,介導新一輪的同源 mRNA降解的多次利用,如此循環(huán),使相對很少量的 dsRNA分子 (數(shù)量遠遠少于內(nèi)源

9、mRNA的數(shù)量 )就能產(chǎn)生強烈的RNAi效應 (每個細胞僅需幾分子 siRNA就可產(chǎn)生RNAi效應) ,并可達到缺失突變體表型的程度。相比普通的 siRNA, 具有短發(fā)卡結(jié)構的雙鏈 RNA產(chǎn)生的 RNAi效應更強。3 . 3 高穩(wěn)定性 ds RNA 可被細胞內(nèi)的特異性核糖核酸酶家族成員 Dicer酶切割為 21 23 nt的 siRNA。切割后的 siRNA由于 3端懸垂 TT或 UU 堿基, 化學性質(zhì)穩(wěn)定,使其不再需要進行任何的修飾就能避免細胞內(nèi)核酸酶類降解而較穩(wěn)定的存在。3 . 4 濃度時間依賴性 RNAi效應存在時間、 濃度雙重依賴性: 干擾效應常出現(xiàn)注射 ds RNA的 6 h后,在注

10、入 ds RNA的 2 3 d后的作用最強,可持續(xù)效應72 h以上; 而其干擾強度則隨著濃度的增高而增強。只有連續(xù)注入 ds RNA, 沉默效應才能持續(xù)下去, 否則將產(chǎn)生短暫的沉默效應, 而且這種效應的強度與初始 dsRNA的濃度有關。另外, RNAi還具有對靶 mRNA的切割位點確定性高、 對細胞調(diào)控系統(tǒng)無影響、 作用快速、 穿透性高及操作簡便等優(yōu)點。3 . 5 可傳播性 Fire等觀察到將 dsRNA注射入線蟲體內(nèi),這些 ds RNA可以從注射處的細胞擴散到體內(nèi)其他細胞, 引起其他細胞的基因沉默, 表明了RNAi作用的可擴散性。3 . 6 可遺傳性 siRNA介導的 RNAi具有一定的可遺

11、傳性。Fi re等將 dsRNA注射入秀麗新線蟲的性腺后,在其第 1代中也誘導出了同樣的基因抑制現(xiàn)象, 即證明了它的遺傳性。3 . 7 靶基因位點的高選擇性 外源性 dsRNA的傳入只對成熟 mRNA產(chǎn)生作用,對 mRNA前體沒有或很少具有影響,以內(nèi)含子或啟動子構成的外源ds RNA無法引起 RNAi效應。4 RNAi的應用4 . 1 基因功能的研究 人類已經(jīng)進入后基因組時代, 需要大規(guī)模高通量的研究基因的功能, RNAi技術具有高效特異阻斷基因的表達等特征, 也就責無旁貸地成為研究基因功能的強大工具, 已有若干實驗室運用 RNAi技術進行大規(guī)模的基因組篩選。其基本原理就是針對一基因組不同的部

12、分設計對應的 ds RNA,構建 dsRNA文庫,分別導入不同個體細胞內(nèi), 通過蛋白表達的改變來篩選基因并確定基因功能。有研究利用離體和活體 RNAi方法來沉默根節(jié)線蟲的編碼一種保守的 RKN (根節(jié)線蟲)分泌肽基16D10 ,并且證實這種寄生基因在根節(jié)線蟲的植物寄生過程中起到關鍵作用。目前, 哺乳動物中非特異性 RNAi效應的克服和新型表達載體的問世,為哺乳動物基因功能的研究提供了一種高效的途徑, 其與基因芯片等技術結(jié)合,可高通量分析各基因的功能。4 . 2 基因表達調(diào)控 在基因組學的研究中, 基因表達調(diào)控是研究基因功能的一個重要部分, 而基因功能缺失策略在基因表達調(diào)控中具有特殊重要地位。R

13、NAi技術對于建立基因剔除動物模型具有相當大的應用前景。K i m等將 siRNA運用于鼠卵母細胞和植入前胚胎中, 利用針對內(nèi)源性的 Oct3 /4和 cmos基因的 siRNA, 成功地清除了內(nèi)源性的 O ct3 /4和Mos產(chǎn)物, 結(jié)果產(chǎn)生了與 Oct3 /4和 cmos基因剔除相類似的表型,證明了 siRNA對小鼠早期發(fā)育的分子生物學研究是一個非常有用的工具。Dubouzet等在 2005年報道了用 RNAi技術抑制黃連中異喹啉生物合成途徑中金黃紫堿甲基轉(zhuǎn)移酶基因,使該酶的表達水平明顯降低。A llen 等用RNAi技術一次性抑制罌粟中可待因酮還原酶基因家族中所有基因的表達,結(jié)果也產(chǎn)生了

14、預期的效果。RNAi轉(zhuǎn)基因小鼠的出現(xiàn),使得在哺乳動物整體水平研究基因的剔除成為可能。4 . 3 基因治療 siRNA的特異性有效保證了哺乳動物細胞中 RNAi效應的特異性,結(jié)合已有的高效基因?qū)胂到y(tǒng),使得 RNAi在那些由于基因表達異常增高而引起的疾病(如腫瘤、 病毒感染)中的作用優(yōu)于目前以抑制基因表達為目的而采用的反義技術和核酶等方法。人們正在探索利用 siRNA 來治療腫瘤、 病毒感染核免疫缺陷等重大疾病, 并且取得了一定成果。Z immermann等針對為獼猴的阿樸蛋白 B編碼的基因施用 siRNA, 成功降低阿樸蛋白 B、 血清膽固醇和低密度脂蛋白的水平。這是首次在非人類靈長類動物中有

15、關 RNAi的全身用藥, 是 RNAi在藥物治療方法上重要進展。研究人員首次通過利用siRNA能夠有選擇地抑制 PI 3K路徑的成分并抑制實驗動物中移植的人類結(jié)腸癌細胞的擴散。RNAi可以特異性的抑制基因表達,所以可用于基因病, 病毒感染、 癌癥的治療。同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列, 設計針對這一區(qū)段序列的 ds RNA 分子引發(fā) RNAi，那么只注射一種 dsRNA即可以產(chǎn)生多個基因同時剔除的表現(xiàn), 也可以同時注射多種 ds RNA而將多個序列不相關的基因同時剔除。Turner等針對人類免疫缺陷病毒 1基因組的 LTR ( long ter m i nal repeat

16、e , LTR )、v i f和 nef設計了 siRNA,將 siRNA轉(zhuǎn)染進人類免疫缺陷病毒后,這些基因的水平降低了 95 %。運用 RNAi方法對比觀察了低氧誘導因子 1和低氧誘導因子 2 ,均有一定程度的調(diào)節(jié)血管生成基因的作用。4 . 4 藥物篩選 RNAi還應用于鑒定藥物靶位和篩選藥物方面。RNAi的應用明顯地縮短了從鑒定到認識藥物靶基因功能的時間, 有助于藥物開發(fā)過程中對已知靶基因功能的高通量分析。利用 RNAi技術使丘腦下部一種豚鼠相關肽的表達量減少了 50 %。豚鼠相關肽使代謝率提高而不減少攝食量,從而減輕肥胖,為肥胖的治療提供了一個靶點。5 結(jié) 語雖然人們對 RNAi的研究只有短短的十幾年時間,但進展卻極為迅速。可以認為 RNAi是個以小分子 RNA為中心的真核細胞基因表達調(diào)控系統(tǒng),它可以在多個層面調(diào)節(jié)基因表達和細胞的增殖分化,通過對 RNAi的研究將會使人們對生命現(xiàn)象的認識更加深入。但 siRNA技術也存在一定的缺陷, 如對靶 mRNA以外同源序列的非特異性抑制, 各種載體和 siRNA本身所誘導的免疫反應。此外, 過量導入siRNA可能干擾細胞內(nèi)其他正常 RNAi介導途徑,甚至誘導體內(nèi)原癌基因異常表達, 導致腫瘤發(fā)生。目前 si