菊花的組織培養(yǎng)(第二課時)

1、菊花的組織培養(yǎng)菊花的組織培養(yǎng)制備制備MS固固體培養(yǎng)基體培養(yǎng)基外植體消毒外植體消毒接種接種培養(yǎng)培養(yǎng)栽培栽培實驗具體操作過程實驗具體操作過程移栽移栽實驗具體操作過程實驗具體操作過程（一）制備（一）制備MS固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基 MS培養(yǎng)基包括培養(yǎng)基包括20多種多種營養(yǎng)成分，實驗營養(yǎng)成分，實驗室一般使用室一般使用4。C保存配制好的培養(yǎng)基母液來保存配制好的培養(yǎng)基母液來制備。制備。1 1、配置各種母液、配置各種母液無機物中大量元素濃縮無機物中大量元素濃縮1010倍，微量元素濃倍，微量元素濃縮縮100100倍，常溫保存倍，常溫保存激素類、維生素類以及用量較小的有機物激素類、維生素類以及用量較小的有機物一般可

2、按一般可按1mg/ml1mg/ml的質量濃度單獨配制成母液的質量濃度單獨配制成母液用母液配制培養(yǎng)基時，需要根據各種母液用母液配制培養(yǎng)基時，需要根據各種母液的濃縮倍數(shù)，計算用量的濃縮倍數(shù)，計算用量實驗具體操作過程實驗具體操作過程2 2、配置培養(yǎng)基、配置培養(yǎng)基定容定容調調PHPH培養(yǎng)基的分裝培養(yǎng)基的分裝 實驗具體操作過程實驗具體操作過程實驗具體操作過程實驗具體操作過程3 3、滅菌、滅菌 分裝好的培養(yǎng)基連同其他器械一起進行分裝好的培養(yǎng)基連同其他器械一起進行高壓高壓蒸汽滅菌蒸汽滅菌。注意：注意：溫度為溫度為121時，維持時，維持15-20分鐘。若滅菌時分鐘。若滅菌時間過長，會使培養(yǎng)基中的某些成分變性失

3、效。間過長，會使培養(yǎng)基中的某些成分變性失效。某些生長調節(jié)劑如赤霉素等以及某些維生素某些生長調節(jié)劑如赤霉素等以及某些維生素遇熱是不穩(wěn)定的，不能同培養(yǎng)基一起高壓滅菌，遇熱是不穩(wěn)定的，不能同培養(yǎng)基一起高壓滅菌，而需要進行而需要進行過濾滅菌過濾滅菌。 實驗具體操作過程實驗具體操作過程1 1、選材：、選材：菊花莖段，取生長旺盛的嫩枝菊花莖段，取生長旺盛的嫩枝（二）外植體消毒（二）外植體消毒考慮的因素考慮的因素 說說 明明外植體的年齡外植體的年齡選擇選擇幼嫩的組織或器官幼嫩的組織或器官作為外植體作為外植體外植體的大小外植體的大小選擇選擇大小適中大小適中的作為外植體的作為外植體外植體所在部位外植體所在部位

4、選擇選擇芽尖、根尖或幼嫩的莖芽尖、根尖或幼嫩的莖作為外植體作為外植體外植體外觀形態(tài)外植體外觀形態(tài) 選擇選擇表面相對光滑易消毒表面相對光滑易消毒的作為外植體的作為外植體2 2、表面消毒、表面消毒流水沖洗流水沖洗菊花莖段用流水沖洗后可加少許洗衣粉，用軟刷輕輕菊花莖段用流水沖洗后可加少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在流水下沖洗刷洗，刷洗后在流水下沖洗20min20min左右左右 酒精處理酒精處理無菌水沖洗無菌水沖洗用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分數(shù)用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分數(shù)為為7070的酒精中搖動的酒精中搖動2 23 3次，持續(xù)次，持續(xù)6 67s7s，立即將外，立即

5、將外植體取出，在無菌水中清洗植體取出，在無菌水中清洗 氯化汞（升汞）氯化汞（升汞）無菌水沖洗無菌水沖洗取出后用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入質取出后用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入質量分數(shù)為量分數(shù)為0.10.1的氯化汞溶液中的氯化汞溶液中1 12min2min，取出后在無，取出后在無菌水中至少清洗菌水中至少清洗3 3次，漂凈次，漂凈消毒液消毒液實驗具體操作過程實驗具體操作過程流水沖洗流水沖洗實驗具體操作過程實驗具體操作過程實驗具體操作過程實驗具體操作過程（三）接種（三）接種1 1、接種室消毒、接種室消毒 污染的主要來源是空氣中的細菌和孢子，污染的主要來源是空氣中的細菌和孢子，接種室

6、消毒是至關重要的。用接種室消毒是至關重要的。用7070的酒精的酒精噴噴霧使空氣消毒，酒精擦洗工作臺并用紫外線霧使空氣消毒，酒精擦洗工作臺并用紫外線照射照射2020分鐘。分鐘。2 2、無菌操作要求、無菌操作要求 操作要在操作要在酒精燈火焰旁酒精燈火焰旁完成，每次使完成，每次使用器械后，都需要用用器械后，都需要用火焰灼燒滅菌火焰灼燒滅菌，接種，接種后立即蓋好瓶蓋。后立即蓋好瓶蓋。實驗具體操作過程實驗具體操作過程 插入時應注意方向，插入時應注意方向，不要倒插不要倒插，莖段、莖，莖段、莖尖基部插入培養(yǎng)基利于吸收水分和養(yǎng)分。尖基部插入培養(yǎng)基利于吸收水分和養(yǎng)分。3 3、材料的切取和接種、材料的切取和接種實

7、驗具體操作過程實驗具體操作過程進行外植體的接種進行外植體的接種 接種前用體積分數(shù)為接種前用體積分數(shù)為70%的酒精將工的酒精將工作臺擦拭一遍，打開紫外燈照射作臺擦拭一遍，打開紫外燈照射20分鐘。分鐘。工作臺消毒后，首先點燃酒精燈。工作臺消毒后，首先點燃酒精燈。酒精搖動酒精搖動傾倒酒精傾倒酒精無菌水沖洗無菌水沖洗升汞消毒升汞消毒傾倒升汞傾倒升汞無菌水沖洗無菌水沖洗特別提醒：特別提醒：接種過程必須始終在酒精燈旁進接種過程必須始終在酒精燈旁進行，每次使用器械后，都需要用火焰灼燒滅行，每次使用器械后，都需要用火焰灼燒滅菌，操作過程中避免雙手從培養(yǎng)皿上方移動。菌，操作過程中避免雙手從培養(yǎng)皿上方移動。特別提

8、醒：特別提醒：每瓶內接種材料不宜過多（建議每瓶內接種材料不宜過多（建議4-5個），彼此之間留出一定空間，從而避個），彼此之間留出一定空間，從而避免互相污染。免互相污染。思考：你打算做幾組重復？你打算設置對照實思考：你打算做幾組重復？你打算設置對照實驗嗎？驗嗎？ 每種材料或配方至少要做一組以上的重復。每種材料或配方至少要做一組以上的重復。設置對照實驗可以取用一個經過滅菌的裝有培設置對照實驗可以取用一個經過滅菌的裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，與接種操作后的錐形瓶一同培養(yǎng)基的錐形瓶，與接種操作后的錐形瓶一同培養(yǎng)，用以說明培養(yǎng)基制作合格，沒有被雜菌污養(yǎng)，用以說明培養(yǎng)基制作合格，沒有被雜菌污染。染。實驗具體操作過

9、程實驗具體操作過程實驗具體操作過程實驗具體操作過程（四）培養(yǎng)（四）培養(yǎng)無菌箱中培養(yǎng)，定期消毒，保持適宜的溫度，無菌箱中培養(yǎng)，定期消毒，保持適宜的溫度，光照光照接種后的錐形瓶放在培接種后的錐形瓶放在培 養(yǎng)箱或培養(yǎng)室中培養(yǎng)。養(yǎng)箱或培養(yǎng)室中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)條件：18-22， 每日光照每日光照12小時小時。實驗結果實驗結果5-7天，外植體膨脹、生長，顏色變淺，天，外植體膨脹、生長，顏色變淺，若出現(xiàn)染菌，及時轉瓶。若出現(xiàn)染菌，及時轉瓶。實驗結果實驗結果2-3周，愈傷組織開始形成。周，愈傷組織開始形成。染菌染菌5-75-7天后天后染菌染菌1-21-2周后周后實驗結果實驗結果3-5周之后，誘導出的新葉片

10、和芽。周之后，誘導出的新葉片和芽。實驗具體操作過程實驗具體操作過程（五）移栽（五）移栽移栽生根的菊花試管苗之前，應先打開培養(yǎng)移栽生根的菊花試管苗之前，應先打開培養(yǎng)瓶的封口膜，讓試管苗在培養(yǎng)間生長幾日瓶的封口膜，讓試管苗在培養(yǎng)間生長幾日1 1、打開封口膜、打開封口膜2 2、清洗轉移、清洗轉移用流水清洗根部的培養(yǎng)基，用流水清洗根部的培養(yǎng)基，將幼苗移植到消過將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境下毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境下生活一段時間生活一段時間實驗具體操作過程實驗具體操作過程珍珠巖：珍珠巖：固體基質型，含水量高、蓄水性強、透性固體基質型，含水量高、蓄水性強、透性 好，適合栽培。好，適合栽培。蛭石蛭石

11、是一種天然、無毒的礦物質，在高溫作用下會膨是一種天然、無毒的礦物質，在高溫作用下會膨脹的礦物。它是一種比較少見的礦物，屬于硅酸鹽。脹的礦物。它是一種比較少見的礦物，屬于硅酸鹽。其晶體結構為單斜晶系，從外形上它看上去像云母。其晶體結構為單斜晶系，從外形上它看上去像云母。蛭石是一定的花崗巖水合時產生的。它一般與石棉同蛭石是一定的花崗巖水合時產生的。它一般與石棉同時產生。由于蛭石有離子交換的能力，它對土壤的營時產生。由于蛭石有離子交換的能力，它對土壤的營養(yǎng)有極大的作用。養(yǎng)有極大的作用。 蛭石的化學式為（蛭石的化學式為（Mg，Ca）0.7（Mg，F(xiàn)e，Al）6.0（Al，Si）8.0（OH4.8H2O

12、）。）。實驗具體操作過程實驗具體操作過程（六）栽培（六）栽培幼苗移栽后，每天觀察并記錄幼苗的生長情幼苗移栽后，每天觀察并記錄幼苗的生長情況，適時澆水、施肥，直至開花況，適時澆水、施肥，直至開花幼苗的移栽和栽培幼苗的移栽和栽培無菌條件如何保證？無菌條件如何保證？需要保證無菌需要保證無菌條件步驟條件步驟關鍵操作關鍵操作培養(yǎng)基及實驗培養(yǎng)基及實驗器材的滅菌器材的滅菌高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌滅菌干燥后直接拿到無菌操作臺中滅菌干燥后直接拿到無菌操作臺中外植體的消毒外植體的消毒酒精、酒精、升升汞汞、無菌水徹底清洗無菌水徹底清洗接種的接種的無菌操作無菌操作始終在酒精燈旁進行始終在酒精燈旁進行每次使用器械后，都需要浸泡在每次使用器械后，都需要浸泡在95%的酒精中的酒精中每次使用器械前，都需要用火焰灼燒滅菌每次使用器械前，都需要用火焰灼燒滅菌操作過程中避免雙手從培養(yǎng)皿上方移動操作過程中避免雙手從培養(yǎng)皿上方移動每瓶內接種材料不宜過多每瓶內接種材料不宜過多培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱中的培中的培養(yǎng)養(yǎng)觀察時不打開封口膜觀察時不打開封口膜手持錐形瓶錐形瓶觀察時正握手持錐形瓶錐形瓶觀察時正握發(fā)現(xiàn)染菌外植體，