血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測定

1、賴氏法測定血清谷丙賴氏法測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)氨酶活性活性(ALT)【目的要求目的要求】n1.掌握血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定的基本原理。n2.熟悉血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定的具體操作方法。n3.了解血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定的臨床意義。【實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理】 ALT催化丙氨酸與-酮戊二酸之間的氨基轉(zhuǎn)移,生成丙酮酸和谷氨酸,在37, pH7.4,經(jīng)30min反應(yīng)之后，加入2,4-二硝基苯肼終止反應(yīng),并與反應(yīng)中的二種-酮酸生成2,4-二硝基苯腙,在堿性條件下顯紅棕色,于波長505nm處讀取A值。 兩種苯腙的吸收光譜曲線在500520nm處差異最大,丙酮酸苯腙的呈色強(qiáng)度是-酮戊二酸苯腙的3倍,據(jù)此可以計(jì)算出丙酮酸的

2、生成量,后者與血清中的ALT的活性濃度成正比?！緦?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理】n丙氨酸丙氨酸+-酮戊二酸酮戊二酸丙酮酸丙酮酸+谷氨酸谷氨酸ALT2,4-二硝基苯肼二硝基苯肼-酮戊酮戊二酸二酸-2,4-二硝基苯腙二硝基苯腙丙丙酮酸酮酸-2,4-二硝基苯腙二硝基苯腙 0. 4mol/LNaOH紅棕色紅棕色紅棕色紅棕色（三倍）（三倍）卡門單位卡門單位:1ml血清血清在在25,340nm,體積為體積為3ml,光徑為光徑為1cm每分鐘每分鐘光光密度密度下降下降0.001的酶量。的酶量。1 1、主要器具、主要器具微量移液器微量移液器 【實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器】可見分光光度計(jì)可見分光光度計(jì)【實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑】n10.1mol

3、/L磷酸鹽緩沖液（磷酸鹽緩沖液（pH7.4） n2基質(zhì)緩沖液基質(zhì)緩沖液 精確稱取D-L-丙氨酸1.79g,-酮戊二酸29.2mg,先溶于0.1mol/L磷酸鹽緩沖液約50ml中,用1mol/L NaOH調(diào)pH至7.4,再加磷酸鹽緩沖液至100ml,每升底物緩沖液中可加氯仿防腐,4保存。n31.0mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液n40.4mol/L NaOH溶液溶液 n52.0mmol/L丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液n6待測標(biāo)本待測標(biāo)本: 病人血清或質(zhì)控血清。病人血清或質(zhì)控血清?！静僮鞑襟E操作步驟】n（1）待測血清的測定加入物加入物(ml)對(duì)照管對(duì)照管測定管測定管血清血清0.10.

4、1基質(zhì)緩沖液基質(zhì)緩沖液0.5 混勻，混勻，37水浴水浴30min2，4-二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液0.50.5基質(zhì)緩沖液基質(zhì)緩沖液0.5混勻，混勻，37保溫保溫20min0.4mol/L NaOH溶液溶液5.05.0混勻，室溫放置混勻，室溫放置5min，在波長為，在波長為505nm處比色，蒸餾水調(diào)處比色，蒸餾水調(diào)“0”【操作步驟操作步驟】n（2）校正曲線的制備加入物加入物(ml)012340.1mol/L磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液0.10.10.10.10.12.0mmol/L丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液00.050.100.150.20基質(zhì)緩沖液基質(zhì)緩沖液0.500.450.400.350.30

5、1.0mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液0.50.50.50.50.5混勻，混勻，37保溫保溫20min0.4mol/L NaOH溶液溶液5.05.05.05.05.0卡門單位卡門單位0285797150混勻，室溫放置混勻，室溫放置5min，在波長為，在波長為505nm處比色，蒸餾水調(diào)處比色，蒸餾水調(diào)“0”取取7支試管，按下表操作支試管，按下表操作卡門單位卡門單位0285797150加入物加入物(ml)對(duì)照管對(duì)照管測定管測定管01234血清血清0.10.1基質(zhì)緩沖液基質(zhì)緩沖液0.5混勻，混勻，37水浴水浴30min0.1mol/L磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液0.10.10.10.1

6、0.12.0mmol/L丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液00.050.100.150.20基質(zhì)緩沖液基質(zhì)緩沖液0.500.450.400.350.301.0mmol/L 2，4-二硝基苯二硝基苯肼溶液肼溶液0.50.50.50.50.50.50.5基質(zhì)緩沖液基質(zhì)緩沖液0.5混勻，混勻，37保溫保溫20min0.4mol/L NaOH溶液溶液5.05.05.05.05.05.05.0混勻，室溫放置混勻，室溫放置5min，在波長為，在波長為505nm處比色，蒸餾水調(diào)處比色，蒸餾水調(diào)“0”【實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果】1.校正曲線的制備 以標(biāo)準(zhǔn)管各管的A值-“0”號(hào)管的A值,所得差值與對(duì)應(yīng)酶卡門氏單位作圖,即成校正曲

7、線。2.測定管 測定管A值-對(duì)照管A值,根據(jù)所得差值，從校正曲線查得標(biāo)本中ALT的卡門氏單位。參考值范圍：參考值范圍：5-255-25卡門單位卡門單位【注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)】n1.血清和底物應(yīng)于37水浴后操作,最好置37水浴箱中操作。以一定時(shí)間加入，各管即時(shí)混勻,以第一管開始計(jì)時(shí),準(zhǔn)確反應(yīng)30分鐘,各管加入時(shí)間間隔一致,保證每管反應(yīng)時(shí)間均為30分鐘。n2.加入2,4-二硝基苯肼溶液后,應(yīng)充分混勻,使反應(yīng)完全。n3.加入NaOH溶液的方法和速度要一致,如液體混合不完全或加入速度不同均會(huì)導(dǎo)致吸光度的差異。n4.底物和顯色劑均為呈色物質(zhì),稱量必須很準(zhǔn)確。n5.呈色的深淺與NaOH的濃度也有關(guān)系,其濃度越

8、大呈色越深,但其濃度0.25M時(shí),吸光度下降變陡,因此濃度要準(zhǔn)確?！痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)【方法學(xué)評(píng)價(jià) 】n1.重復(fù)性差重復(fù)性差n1) 由于限制了-酮戊二酸的用量。使生成量與酶活性不能呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。n2) 2,4-二硝基苯肼在堿性條件下也能顯色,為了降低試劑空白的吸光度而不得不使用低濃度的2,4-二硝基苯肼,此種水平的苯肼僅能與反應(yīng)體系中的兩種酮酸的一半反應(yīng)。n3) 產(chǎn)物旁路效應(yīng)：丙酮酸在LDH的催化作用下的消耗?！痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)【方法學(xué)評(píng)價(jià) 】2.準(zhǔn)確性差準(zhǔn)確性差：線性范圍狹窄,盡管標(biāo)本采用稀釋后測定,但偏差仍較大。3.試劑穩(wěn)定性差試劑穩(wěn)定性差4.操作簡單操作簡單【臨床意義】【臨床意義】n 肝細(xì)胞中含ALT最豐富，因此當(dāng)肝臟疾病致肝細(xì)胞受損傷時(shí)，ALT即大量釋放入血液，致使血清中ALT活性增高。測定測定ALTALT是是