熒光共聚焦 激光掃描共聚焦

1、 激光掃描共聚焦熒光顯微鏡激光掃描共聚焦熒光顯微鏡(laser scanning confocal microscopy,LSCM)(laser scanning confocal microscopy,LSCM)2應(yīng)用原理02目錄0101原理原理4熒光，又作熒光，又作“螢光螢光”，是指一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現(xiàn)象。，是指一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長的入射光（通常是紫外線或當(dāng)某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長的入射光（通常是紫外線或X X射射線）照射，吸收光能后進入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)線）照射，吸收光能后進入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的的波長長的出射光（通常波長在可見光波

2、出比入射光的的波長長的出射光（通常波長在可見光波段）；很多熒光物質(zhì)一旦停止入射光，發(fā)光現(xiàn)象也隨之立段）；很多熒光物質(zhì)一旦停止入射光，發(fā)光現(xiàn)象也隨之立即消失。具有這種性質(zhì)的出射光就被稱之為熒光。即消失。具有這種性質(zhì)的出射光就被稱之為熒光。熒光顯微鏡熒光顯微鏡 利用一定波長的光使樣品受到激發(fā)，產(chǎn)生不同顏色的熒光，以用來觀察和分利用一定波長的光使樣品受到激發(fā)，產(chǎn)生不同顏色的熒光，以用來觀察和分辨樣品中某些化學(xué)成分和細胞組分的一種顯微鏡。辨樣品中某些化學(xué)成分和細胞組分的一種顯微鏡。 自發(fā)熒光：組織，細胞不經(jīng)熒光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所呈自發(fā)熒光：組織，細胞不經(jīng)熒光色素染色，在紫外光照射下，

3、某些成分所呈現(xiàn)的熒光?，F(xiàn)的熒光。 繼發(fā)性熒光：組織，細胞經(jīng)熒光色素染色，由于熒光色素和組織細胞內(nèi)的某繼發(fā)性熒光：組織，細胞經(jīng)熒光色素染色，由于熒光色素和組織細胞內(nèi)的某種成分結(jié)合后而呈現(xiàn)的熒光。種成分結(jié)合后而呈現(xiàn)的熒光。 使用油鏡物鏡，應(yīng)用無熒光浸油，物鏡的內(nèi)裝可變光闌應(yīng)適當(dāng)縮小，以增大使用油鏡物鏡，應(yīng)用無熒光浸油，物鏡的內(nèi)裝可變光闌應(yīng)適當(dāng)縮小，以增大影像反差和清晰度。影像反差和清晰度。 視場光闌（視場光闌（F F）和孔徑光闌（）和孔徑光闌（A A）的開度，在觀察樣品時應(yīng)朝）的開度，在觀察樣品時應(yīng)朝minmin相轉(zhuǎn)動，使相轉(zhuǎn)動，使其適當(dāng)縮小。其適當(dāng)縮小。 最好采用螢石玻璃制成的載玻片，蓋玻片最好

4、采用螢石玻璃制成的載玻片，蓋玻片 按下啟動鈕，汞燈點亮，經(jīng)按下啟動鈕，汞燈點亮，經(jīng)2-3min2-3min電弧趨于穩(wěn)定，點亮電弧趨于穩(wěn)定，點亮15min15min內(nèi)，勿切斷電內(nèi)，勿切斷電源，一旦汞燈熄滅，在源，一旦汞燈熄滅，在5min5min或稍長時間內(nèi)，不許重新點亮，待其冷卻，再點或稍長時間內(nèi)，不許重新點亮，待其冷卻，再點亮。亮。 開啟光閥，開放孔徑光闌和視場光闌至最大開度，即開啟光閥，開放孔徑光闌和視場光闌至最大開度，即min-maxmin-max。 載物臺放一白紙，讓汞燈電弧投在其上。載物臺放一白紙，讓汞燈電弧投在其上。 用燈室外的聚焦桿，使電弧像在白紙上聚焦，并調(diào)中螺釘，調(diào)中汞燈。用燈

5、室外的聚焦桿，使電弧像在白紙上聚焦，并調(diào)中螺釘，調(diào)中汞燈。 樣品放于載物臺，先用溴鎢燈投射照明，用低倍物鏡聚焦，待尋找到最佳影樣品放于載物臺，先用溴鎢燈投射照明，用低倍物鏡聚焦，待尋找到最佳影像后，熄滅溴鎢燈改用汞燈像后，熄滅溴鎢燈改用汞燈熒光顯微鏡熒光顯微鏡 1 1 采用采用激光束激光束作光源，激光束經(jīng)作光源，激光束經(jīng)照明針孔照明針孔，經(jīng)由，經(jīng)由分光鏡分光鏡反射至反射至物鏡，并聚焦于樣品上，對標(biāo)本焦平面上每一點進行掃描。物鏡，并聚焦于樣品上，對標(biāo)本焦平面上每一點進行掃描。 組織樣品中如果有可被激發(fā)的熒光物質(zhì)，受到激發(fā)后發(fā)出的熒組織樣品中如果有可被激發(fā)的熒光物質(zhì)，受到激發(fā)后發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射

6、光路直接反向回到分光鏡，通過探測針孔時先聚光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測針孔時先聚焦，聚焦后的光被焦，聚焦后的光被光電倍增管光電倍增管（PMTPMT）探測收集，并將信號輸）探測收集，并將信號輸送到計算機，處理后在計算機顯示器上顯示圖像送到計算機，處理后在計算機顯示器上顯示圖像 。2 2 在這個光路中，只有在焦平面的光才能穿過探測針孔，焦平在這個光路中，只有在焦平面的光才能穿過探測針孔，焦平面以外區(qū)域射來的光線在探測小孔平面是離焦的，不能通過小面以外區(qū)域射來的光線在探測小孔平面是離焦的，不能通過小孔。因此，非觀察點的背景呈黑色，反差增加，孔。因此，非觀察點的背景呈黑色，反差增加，成

7、像清晰成像清晰。由。由于于照明針孔照明針孔與與探測針孔探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦于照明針孔與探測針孔，焦平面以外的點不會在的點同時聚焦于照明針孔與探測針孔，焦平面以外的點不會在探測針孔處成像，即探測針孔處成像，即共聚焦共聚焦。 以激光作光源并對樣品進行掃以激光作光源并對樣品進行掃描，在此過程中兩次聚焦，故稱為描，在此過程中兩次聚焦，故稱為激光掃描共聚焦顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡。88只要載物臺沿著只要載物臺沿著Z Z軸上下移動，將樣品新的一個層面移動軸上下移動，將樣品新的一個層面移動到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯色器上。到共焦

8、平面上，樣品的新層面又成像在顯色器上。分辨率：分辨率：0.18m0.18m點照明，具有照明點和探測點，具有掃描系統(tǒng)，逐點掃描點照明，具有照明點和探測點，具有掃描系統(tǒng)，逐點掃描成像成像具有四個熒光通道，可同時探測多個被標(biāo)記物，一個透射具有四個熒光通道，可同時探測多個被標(biāo)記物，一個透射光道，同時采集透射光圖像（非共焦圖像）光道，同時采集透射光圖像（非共焦圖像）弧燈膜孔目鏡02應(yīng)用應(yīng)用 12PhePyr與GC-MS檢測濃度相符紅樹植物秋茄13黑麥草洋蔥北京化工大學(xué)151617(a) Preparation process for HCPTZIF-8 hollow nanospheres. (b,c)

9、 CLSM of HCPTZIF-8 hollow nanospheres (scale bar 1 m). (d,e) SEM of HCPTZIF-8 hollow nanospheres (scale bar 1 m; scale bar 100 nm).A surfactant template-assisted strategy for synthesis of ZIF-8 hollow nanospheres181818Conversion of azide to primary amine via Staudinger Conversion of azide to primary

10、 amine via Staudinger reaction in metal-organic frameworksreaction in metal-organic frameworksFacile conversion of azide to primary amine in metal-Facile conversion of azide to primary amine in metal-organic frameworks (MOFs) was accomplished by Staudinger organic frameworks (MOFs) was accomplished

11、by Staudinger reduction. After the reaction, MOFs retained high reduction. After the reaction, MOFs retained high crystallinity confirmed by X-ray diffraction patterns, crystallinity confirmed by X-ray diffraction patterns, meaning a high usability of this method for post-meaning a high usability of

12、 this method for post-synthetic modification of MOFs. Bulky phosphine groups synthetic modification of MOFs. Bulky phosphine groups provided surface-selective modification of MOFs via a provided surface-selective modification of MOFs via a reaction between resulting amine groups of MOF and reaction between resulting amine groups of MOF and activated ester with fluorescein, illustrated by activated ester with fluorescein, illustrated by confocal confocal laser scanning microscope (CLSM)laser scanning microscope (CLSM) observation. This method observati