實(shí)驗(yàn)五 培養(yǎng)基的制作及滅菌

1、實(shí)驗(yàn)五 培養(yǎng)基的制作及滅菌 一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1 學(xué)習(xí)培養(yǎng)基的配制原理和一般方法步驟 2 掌握高壓蒸汽滅菌的原理方法 3 了解干熱滅菌的原理方法二 實(shí)驗(yàn)原理1 培養(yǎng)基的原理培養(yǎng)基（medium）是用人工的辦法將多種營養(yǎng)物質(zhì)按微生物生長代謝的需要配制成的一種營養(yǎng)基質(zhì)。由于微生物種類繁多，對營養(yǎng)物質(zhì)的要求各異，加之實(shí)驗(yàn)和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基在組成成分上也各有差異。但是，不同種類或不同組成的培養(yǎng)基中，均應(yīng)含有滿足微生物生長發(fā)育且比例合適的水分、碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因素以及某些特需的微量元素等。配制培養(yǎng)基時(shí)不僅需要考慮滿足這些營養(yǎng)成分的需求，而且應(yīng)該注意各營養(yǎng)成分之問的協(xié)調(diào)。 按照配制培養(yǎng)基的營

2、養(yǎng)物質(zhì)來源，可將培養(yǎng)基分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基三類 .按培養(yǎng)基外觀的物理狀態(tài)可將培養(yǎng)基分成三類，即液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基 .按照培養(yǎng)基的功能和用途，可將其分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基等 .牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是細(xì)菌學(xué)研究最常用的天然培養(yǎng)基。在配方中不加瓊脂時(shí)稱之為肉湯培養(yǎng)基。加入瓊脂配制的固體培養(yǎng)基一般用于細(xì)菌的分離、培養(yǎng)和計(jì)數(shù)等. 2 滅菌的原理 1) 干熱滅菌 用干燥熱空氣殺死微生物的方法稱為干熱滅菌。通常將滅菌物品置于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，在160170加熱12h。滅菌時(shí)間可根據(jù)滅菌物品性質(zhì)與體積作適當(dāng)調(diào)整，以達(dá)到滅菌日的。玻璃器皿（如吸管、培養(yǎng)

3、皿等）、金屬用具等凡不適于用其他方法滅菌而又能耐高溫的物品都可用此法滅菌；但是，培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品等不能使用干熱滅菌。 注意事項(xiàng)： 1）滅菌的玻璃器皿切不可有水。有水的玻璃器皿在干熱滅菌中容易炸裂。 2）滅菌物品不能堆得太滿、太緊，以免影響溫度均勻上升。 3）滅菌物品不能直接放在電烘箱底板上。以防止包裝紙或棉花被烤焦。 4）滅菌溫度恒定在160170為宜。溫度超過180棉花、報(bào)紙會(huì)燒焦甚至燃燒。 5）降溫時(shí)，需待溫度自然降至60以下才能打開箱門取出物品，以免因溫度過高而驟然降溫導(dǎo)致玻璃器皿炸裂。 2 濕熱滅菌 濕熱滅菌法比干熱滅菌法更有效。濕熱滅菌是利用熱蒸汽滅菌。在相同溫度下，濕熱的

4、效力比干熱滅菌好的原因是：1）熱蒸汽對細(xì)胞成分的破壞作用更強(qiáng)。水分子的存在有助于破壞維持蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的氫鍵和其他相互作用弱鍵，更易使蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)含水量與其凝固溫度成反比；2）熱蒸汽比熱空氣穿透力強(qiáng)，能更加有效地殺滅微生物；3）蒸汽存在潛熱，當(dāng)氣體轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w時(shí)可放出大量熱量，故可迅速提高滅菌物體的溫度。 分為常壓蒸汽滅菌和高壓蒸汽滅菌.高壓蒸汽滅菌 滅菌原理 高壓蒸汽滅菌是在密閉的高壓蒸汽滅菌器（鍋）中進(jìn)行的。其原理是：將待滅菌的物體放置在盛有適量水的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)。把鍋內(nèi)的水加熱煮沸，并把其中原有的冷空氣徹底驅(qū)盡后將鍋密閉。再繼續(xù)加熱就會(huì)使鍋內(nèi)的蒸汽壓逐漸上升，從而溫度也隨之上升到1

5、00以上。為達(dá)到良好的滅菌效果，一般要求溫度應(yīng)達(dá)到121（壓力為0.1MPa），時(shí)間維持1530min。也可采用在較低的溫度(115，即0.075Mpa)下維持30min的方法。 臥式滅菌鍋手提式滅菌鍋手提式滅菌鍋使用要點(diǎn) （1）加水 使用前在鍋內(nèi)加入適量的水，加水不可過少，以防將滅菌鍋燒干，引起炸裂事放。加水過多有可能引起滅菌物積水。（2）裝鍋 將滅菌物品放在滅菌桶中，不要裝得過滿。蓋好鍋蓋，按對稱方法旋緊四周固定螺旋，打開排氣筏。（3）加熱排汽 加熱后待鍋內(nèi)沸騰并有大量蒸汽自排氣閥冒出時(shí)，維待2一3min以排除冷空氣。如滅菌物品較大或不易透氣。應(yīng)適當(dāng)延長排氣時(shí)間，務(wù)必使空氣充分排除，然后將

6、排氣間關(guān)閉。（4） 保溫保壓 當(dāng)壓力升至 0.1MPa時(shí)，溫度達(dá) 121，此時(shí)應(yīng)控制熱源。保持壓力，維持20min后，切斷熱源。（5）出鍋 當(dāng)壓力表降至“0”處，稍停，使溫度繼續(xù)降至100以下后，打開排氣閥，旋開固定螺旋，開蓋取出滅菌物。注意。切勿在鍋內(nèi)壓力尚在“0” 點(diǎn)以上，溫度也在100以上時(shí)開啟排氣閥，否則會(huì)因壓力驟然降低，而造成培養(yǎng)基劇烈沸騰沖出管口或瓶口，污染棉塞，以后培養(yǎng)時(shí)引起雜菌污染。（6） 保養(yǎng) 滅菌完畢取出物品后，將鍋內(nèi)余水倒出，以保持內(nèi)壁及內(nèi)膽干燥，蓋好鍋蓋。三 實(shí)驗(yàn)器材 1 藥品和試劑：牛肉膏、蛋白胨、NaCl 、 1NHCl、1NNaOH溶液。 2 器材：小燒杯、100

7、0mL不銹鋼杯、電爐、天平、牛角匙、玻棒、pH試紙、試管、分裝漏斗、棉塞、三角瓶、橡皮圈。 3 高壓滅菌鍋四 實(shí)驗(yàn)方法1 在1000mL不銹鋼燒杯中加入500mL水,用玻棒標(biāo)記液面(定容用),將水倒掉.2 在100mL 小燒杯中稱取牛肉膏2.5g、蛋白胨 5.0g，加 25mL自來水，置電爐攪拌加熱至牛肉膏、蛋白胨完全溶解。3 向不銹鋼杯中加人250mL自來水，將溶解的牛肉膏、蛋白胨倒入不銹鋼杯中并用自來水洗23次。加入2.5gNaCl，在電爐上邊加熱邊攪拌。4 藥品完全溶解后, 加入自來水定容至500mL,用玻棒沾少許液體，測定pH值。用NaOH或HCI調(diào)至pH7.4. 5 用量筒將培養(yǎng)基分

8、成400mL 和100mL兩部分. 6 將8g瓊脂粉加入到400mL培養(yǎng)基中，攪拌，加熱至瓊脂完全熔化 將培養(yǎng)基趁熱用注射器分裝于18mmX 180mm試管中，每組分裝只。蓋上試管帽，牛皮紙包扎，待滅菌參見課本第37頁(二)1(5)(6)(7). 將剩余培養(yǎng)基裝入 00mL的三角燒瓶中，蓋上合適的棉塞，報(bào)紙包扎待滅菌 剩余的100mL培養(yǎng)基單數(shù)組同學(xué)配制液體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基在燒杯中煮沸分鐘，過濾, 補(bǔ)足水，分裝1mmX 10mm試管只，蓋上試管帽，牛皮紙包扎，待滅菌參見課本第37頁(二)3(4)(6)(7). 10 雙數(shù)組同學(xué)將0.5g瓊脂加入到100mL培養(yǎng)基中,攪拌，加熱至瓊脂完全熔化分裝

9、1mmX 10mm試管只，蓋上試管帽，牛皮紙包扎，待滅菌參見課本第37頁(二)2(3)(5)(6).11 配制150mL生理鹽水(0.85% NaCl水溶液), 用量筒量取100mL裝于250mL的三角燒瓶中,再用移液管取出1mL, 加棉塞,用報(bào)紙包扎, 制成99mL稀釋水1瓶; 用移液管移取9mL生理鹽水,分裝于18mmX 180mm試管中, 分裝四只.12 將培養(yǎng)基和稀釋水(99ml一瓶,9ml4只)及槍頭等標(biāo)記好進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，在121滅菌20min.13 滅菌后擺放斜面,其余培養(yǎng)基及儀器放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)存放。注: 試管分裝量, 液體-試管高的1/4到1/3; 固體-試管高的1/5; 半固體-試管高的1/3; 三角瓶-瓶高1/2左右.五 思考題 1 見課本第38頁第1題. 2 見課本第38頁第