基因工程基本操作程序

1、基因工程基本操作程序復習復習:基因工程的基本操作步驟基因工程的基本操作步驟提取目的基因提取目的基因目的基因與運載體結(jié)合目的基因與運載體結(jié)合將目的基因?qū)胧荏w細胞將目的基因?qū)胧荏w細胞目的基因的表達和檢測目的基因的表達和檢測 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序提取目的基因提取目的基因目的基因與運載體目的基因與運載體 結(jié)合結(jié)合將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)?受體細胞受體細胞目的基因的表達目的基因的表達 和檢測和檢測一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取2 2、獲取目的基因的常用方法有哪些、獲取目的基因的常用方法有哪些? ?（1 1）從基因文庫中獲?。幕?/p>

2、文庫中獲取( (目的基因序列未知目的基因序列未知) )（2 2）利用）利用PCRPCR技術(shù)擴增技術(shù)擴增( (目的基因序列已知目的基因序列已知) )（3 3）人工合成）人工合成( (基因比較小，序列又已知基因比較小，序列又已知) )基因文庫基因文庫 基因組文庫基因組文庫（某物種全部基因某物種全部基因 ）部分基因文庫部分基因文庫（如（如:cDNA文庫）文庫）什么叫基因文庫？什么叫基因文庫？基因文庫的構(gòu)建模式圖基因文庫的構(gòu)建模式圖通過對通過對受體菌受體菌的培養(yǎng)而的培養(yǎng)而儲存基因儲存基因基因組基因組文庫與文庫與部分基部分基因文庫因文庫的關(guān)系的關(guān)系 (2)表達：只有編碼區(qū)能轉(zhuǎn)錄生成表達：只有編碼區(qū)能轉(zhuǎn)錄

3、生成RNA，且內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的，且內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的部分要剪切掉，即轉(zhuǎn)錄生成的部分要剪切掉，即轉(zhuǎn)錄生成的mRNA只有外顯子對應部分。因只有外顯子對應部分。因此，以此，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的目的基因中沒有內(nèi)含子、為模板，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的目的基因中沒有內(nèi)含子、啟動子和終止子。啟動子和終止子。1提取目的基因方法的比較提取目的基因方法的比較方方法法基因文庫的構(gòu)建基因文庫的構(gòu)建PCR技術(shù)技術(shù)擴增擴增人工合成人工合成基因組文庫基因組文庫部分基因文庫部分基因文庫(如如cDNA文庫文庫)過過程程供體細胞中的供體細胞中的DNA 限制酶限制酶許多許多DNA片段片段 連接連接表達載體表達載體 導入導入受體細胞受體細胞 外

4、源外源DNA擴增，產(chǎn)生擴增，產(chǎn)生特定性狀特定性狀 分離分離目的基因目的基因目的基因的目的基因的mRNA 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄單鏈單鏈DNA 合成合成雙鏈雙鏈DNA 插入插入載體載體 導入導入受體菌群受體菌群(cDNA文庫文庫) 分離分離目的基因目的基因目的基因目的基因DNA 高溫高溫 解鏈解鏈單鏈單鏈DNA 與引與引 物結(jié)合物結(jié)合 、DNADNA 聚合聚合 酶酶大量目大量目的基因的基因蛋白質(zhì)的氨蛋白質(zhì)的氨基酸序列基酸序列 推測推測mRNA的核的核苷酸序列苷酸序列 推測推測基因的核基因的核苷酸序列苷酸序列 化學化學 合成合成目的基因目的基因依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。 如：根據(jù)基

5、因的核苷酸序列如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色體上的位置基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。(1)(1)從基因文庫中獲取目的基因從基因文庫中獲取目的基因是一項在生物體外復制特是一項在生物體外復制特定定DNA片段的核酸合成片段的核酸合成技術(shù)技術(shù)方式：以方式：以_形式擴增，即形式擴增，即_（n n為擴增循為擴增循 環(huán)的次數(shù)）環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：結(jié)果：使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增指數(shù)指數(shù)2 2n nPCRPCR技術(shù)原理技術(shù)原理 及反應過程及反應過程

6、1.加熱加熱至至909095 95 目的基因目的基因DNA解鏈解鏈2.冷卻冷卻至至555560 60 ，引物結(jié)合到互補引物結(jié)合到互補DNADNA鏈鏈3.3.加熱至加熱至707075 75 ，熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶從聚合酶從從引物起始互補鏈的從引物起始互補鏈的合成合成 過程：過程：a a、DNADNA變性（變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下，_斷裂，形成斷裂，形成_b b、退火（、退火（復性復性55-6055-60）：系統(tǒng)溫度降低，引）：系統(tǒng)溫度降低，引 物與物與DNADNA模板結(jié)合，形成局部模板結(jié)合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸

7、（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用酶的作用下，從引物的下，從引物的55端端33端延伸，合成與端延伸，合成與模板互補的模板互補的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈1提取目的基因方法的比較提取目的基因方法的比較方方法法基因文庫的構(gòu)建基因文庫的構(gòu)建PCR技術(shù)技術(shù)擴增擴增人工合成人工合成基因組文庫基因組文庫部分基因文庫部分基因文庫(如如cDNA文庫文庫)過過程程供體細胞中的供體細胞中的DNA 限制酶限制酶許多許多DNA片段片段 連接連接表達載體表達載體 導入導入受體細胞受體細胞 外源外源DNA擴增，產(chǎn)生擴增，產(chǎn)生特定性狀特定性狀 分離分離目的基因目的基因目的

8、基因的目的基因的mRNA 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄單鏈單鏈DNA 合成合成雙鏈雙鏈DNA 插入插入載體載體 導入導入受體菌群受體菌群(cDNA文庫文庫) 分離分離目的基因目的基因目的基因目的基因DNA 高溫高溫 解鏈解鏈單鏈單鏈DNA 與引與引 物結(jié)合物結(jié)合 、DNADNA 聚合聚合 酶酶大量目大量目的基因的基因蛋白質(zhì)的氨蛋白質(zhì)的氨基酸序列基酸序列 推測推測mRNA的核的核苷酸序列苷酸序列 推測推測基因的核基因的核苷酸序列苷酸序列 化學化學 合成合成目的基因目的基因方方法法基因文庫的構(gòu)建基因文庫的構(gòu)建PCR技術(shù)技術(shù)擴增擴增人工合成人工合成基因組文庫基因組文庫部分基因文部分基因文庫庫(如如cDNA文庫文庫)

9、優(yōu)優(yōu)點點操作簡單操作簡單專一性強專一性強可在短時可在短時間內(nèi)大量間內(nèi)大量擴增目的擴增目的基因基因?qū)Ｒ恍詮姡瑢Ｒ恍詮?，可產(chǎn)生自然可產(chǎn)生自然界中不存在界中不存在的新基因的新基因缺缺點點工作量大、工作量大、盲目性大、盲目性大、專一性差專一性差操作過程較麻操作過程較麻煩，技術(shù)要求煩，技術(shù)要求過高過高需要嚴格需要嚴格控制溫度，控制溫度，技術(shù)要求技術(shù)要求高高適用范圍小適用范圍小2PCR技術(shù)與生物體內(nèi)技術(shù)與生物體內(nèi)DNA復制的比較復制的比較DNA復制復制PCR技術(shù)技術(shù)區(qū)區(qū)別別解旋解旋方式方式解旋酶催化解旋酶催化DNA在高溫作用下變性解旋在高溫作用下變性解旋場所場所細胞內(nèi)細胞內(nèi)(主要在細胞核內(nèi)主要在細胞核內(nèi))

10、細胞外細胞外(主要在主要在PCR擴增儀內(nèi)擴增儀內(nèi))酶酶DNA解旋酶、普通的解旋酶、普通的DNA聚合聚合酶等酶等耐熱的耐熱的DNA聚合酶聚合酶(Taq聚合酶聚合酶)溫度溫度條件條件細胞內(nèi)溫和條件細胞內(nèi)溫和條件需控制溫度，在較高溫度下進行需控制溫度，在較高溫度下進行合成合成的對的對象象形成整個形成整個DNA分子分子短時間內(nèi)形成大量短時間內(nèi)形成大量DNA片段或基因片段或基因聯(lián)系聯(lián)系模板：均需要脫氧核苷酸鏈作為模板進行物質(zhì)合成模板：均需要脫氧核苷酸鏈作為模板進行物質(zhì)合成原料：均為四種脫氧核苷酸原料：均為四種脫氧核苷酸酶：均需要酶：均需要DNA聚合酶進行催化聚合酶進行催化引物：均需要引物，使引物：均需要

11、引物，使DNA聚合酶從引物的聚合酶從引物的3端開始連接脫氧核端開始連接脫氧核苷酸苷酸 特別提醒特別提醒 (1)基因工程操作中，只有使用受體生物自身基因的啟基因工程操作中，只有使用受體生物自身基因的啟動子才比較有利于基因的表達。動子才比較有利于基因的表達。 (2)通過通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體細胞中無法轉(zhuǎn)錄。編碼序列導入受體細胞中無法轉(zhuǎn)錄。 (3)熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNA聚合酶聚合酶(Taq聚合酶聚合酶)能在高溫下保持其能在高溫下保持其活性，是活性，是PCR技術(shù)關(guān)鍵的工具之一。技術(shù)關(guān)鍵的工具之一。質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA分子分子一個切口

12、一個切口兩個黏性末端兩個黏性末端兩個切口兩個切口獲得目的基因獲得目的基因DNA DNA 連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）同一種同一種 限制酶限制酶基因表達載體的組成基因表達載體的組成思考：作為基因工程表達載體，只需含有思考：作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎？為什么？目的基因就可以完成任務嗎？為什么？ 啟動子：位于基因的首端的一段特殊啟動子：位于基因的首端的一段特殊的的DNA片斷，它是片斷，它是RNA聚合酶識別和聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)。，最終獲得蛋白質(zhì)。RN

13、A聚合酶聚合酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶 酶酶 酶酶 RNA聚合酶聚合酶啟動子啟動子結(jié)構(gòu)蛋白基因結(jié)構(gòu)蛋白基因RNA聚合酶聚合酶終止子：位于基因的尾端的一段特終止子：位于基因的尾端的一段特殊的殊的DNA片斷，能終止片斷，能終止mRNA的的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄標記基因的作用是為了鑒別受體細胞標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來基因的細胞篩選出來 (1)切割目的基因和運載體時并非只能用一種酶，但無論用切割目的基因和運載體時并非只能用一種酶，但無論用幾種酶，一般都用相同種類的酶切割目的基因和運載體。幾種酶，一般都用相同種類的酶切割目的基因和運

14、載體。 (2)啟動子啟動子起始密碼，終止子起始密碼，終止子終止密碼。終止密碼。啟動子和終止子位于基因結(jié)構(gòu)的非編碼區(qū)，起始密碼和終止密啟動子和終止子位于基因結(jié)構(gòu)的非編碼區(qū)，起始密碼和終止密碼位于碼位于mRNA上。上。 (2)表達：只有編碼區(qū)能轉(zhuǎn)錄生成表達：只有編碼區(qū)能轉(zhuǎn)錄生成RNA，且內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的，且內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的部分要剪切掉，即轉(zhuǎn)錄生成的部分要剪切掉，即轉(zhuǎn)錄生成的mRNA只有外顯子對應部分。因只有外顯子對應部分。因此，以此，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的目的基因中沒有內(nèi)含子、為模板，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的目的基因中沒有內(nèi)含子、啟動子和終止子。啟動子和終止子。它們的作用是？它們的作用是？2將目的基因?qū)胧荏w

15、細胞的方法比較將目的基因?qū)胧荏w細胞的方法比較受體受體細胞細胞植物細胞植物細胞動物細胞動物細胞微生物細胞微生物細胞常用常用方法方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法法、花粉管通道法顯微注射技術(shù)顯微注射技術(shù)感受態(tài)細胞法感受態(tài)細胞法受體受體細胞細胞體細胞體細胞受精卵受精卵原核細胞原核細胞轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化過程過程以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法為例：以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法為例：將目的基因插入將目的基因插入Ti質(zhì)粒質(zhì)粒的的TDNA上上轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中導入植物細胞導入植物細胞整合到受體細胞的整合到受體細胞的DNA上上提純含目的基提純含目的基因的表達載體因的表達載體顯微注射顯微注射受精卵發(fā)育受精卵發(fā)育具有新性

16、具有新性狀的個體狀的個體Ca2處理細胞處理細胞感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞基因表達載體與基因表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞吸收吸收DNA分子分子 特別提醒特別提醒 (1)完成基因表達載體的構(gòu)建，需要限制性核酸內(nèi)切酶和完成基因表達載體的構(gòu)建，需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶，連接產(chǎn)物有目的基因連接酶，連接產(chǎn)物有目的基因目的基因，目的基因目的基因，目的基因運運載體和運載體載體和運載體運載體三種。運載體三種。 (2)將基因表達載體將基因表達載體(重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒)導入農(nóng)桿菌的常用方法是導入農(nóng)桿菌的常用方法是Ca2處理法。處理法。Ca2(或或CaCl2溶液溶液)對微生物細胞的作用是增加對微生物細胞的作用是增加細胞壁的通透性。細胞壁的通透性。(個體生物學水平個體生物學水平)（分子）（分子） 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2.微生物作受體細胞原因：微生物作受體細胞原因：將目的基因?qū)胛⑸锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎?.轉(zhuǎn)化方法：轉(zhuǎn)化方法：大腸桿菌大腸桿菌繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少處理細胞細胞重組表達載體DNA分子與感受態(tài)細胞混合（