《飼料中喹烯酮的測(cè)定高效液相色譜法》

1、Q/HMS HMS 022002安徽省市場(chǎng)監(jiān)督管理局 發(fā)布2022-XX-01實(shí)施實(shí)施2022-XX-01發(fā)布飼料中喹烯酮的測(cè)定 高效液相色譜法Determination of Quinocetone in feed High performance liquid chromatography method（征求意見(jiàn)稿）DB 34/T 1363-2022 代替DB 34/T 1363-2011 DB34安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)ICS備案號(hào)：1前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照 GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本標(biāo)準(zhǔn)的某些內(nèi)容可能涉及專利。本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)

2、識(shí)別專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)代替DB34/T 1363-2011飼料中喹烯酮的測(cè)定-高效液相色譜法，除編輯性修改外主要技術(shù)變化如下：修改了標(biāo)準(zhǔn)名稱，刪除了標(biāo)準(zhǔn)名稱中的連接符“-”；增加方法檢出限、定量限為；修改了原理（見(jiàn)第3章）；修改了試劑和材料內(nèi)容（見(jiàn)第4章）；增加了儀器設(shè)備（見(jiàn)第5章）；修改“色譜條件”優(yōu)化了樣品制備（見(jiàn)第7章）；修改了結(jié)果計(jì)算與表述（見(jiàn)第7.4章）；修改結(jié)果確認(rèn)方法表述（見(jiàn)第8章）；本標(biāo)準(zhǔn)由安徽省獸藥飼料監(jiān)察所提出。本標(biāo)準(zhǔn)由安徽省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：安徽省獸藥飼料監(jiān)察所。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：劉發(fā)全。本標(biāo)準(zhǔn)2011年3月發(fā)布，本次為第一次修訂。 II飼料中喹烯酮的測(cè)定 高效

3、液相色譜法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中喹烯酮含量測(cè)定的高效液相色譜法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于配合飼料、濃縮飼料和預(yù)混合飼料中喹烯酮的測(cè)定。本方法檢出限為0.5mg/kg，定量限為1.0mg/kg。2 規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T14699.1飼料采樣GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備3 原理試樣中的喹烯酮用流動(dòng)相溶液超聲提取后，經(jīng)離心、過(guò)濾后的試樣溶液注入高效液相色譜系統(tǒng)中進(jìn)行分離，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法計(jì)算喹烯

4、酮的含量。4 試劑和材料4.1 除特殊說(shuō)明外，本方法所用試劑均為分析純，水為蒸餾水，色譜用水為去離子水，符合GB/T6682中一級(jí)用水規(guī)定。4.2 甲醇：色譜純。4.3 乙腈：色譜純。4.4 二甲基甲酰胺。4.5 磷酸溶液：0.025mol/L。4.6 流動(dòng)相：乙腈-甲醇-磷酸溶液（0.025mol/L）25:20:55（v/v）。4.7 喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)品：CAS號(hào): 81810-66-4，純度98.0。4.8 喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備4.7.1喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液貯備液：精密稱取喹烯酮對(duì)照品50mg于100ml棕色容量瓶，用10ml二甲基甲酰胺溶解，加入甲醇至刻度，溶解成500µgmL的儲(chǔ)備液。

5、置于4冰箱中保存，有效期60天。4.7.2喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別吸取貯備液（4.7.1）1mL、2mL、5mL、10mL、20mL于100mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶液（4.5）定容，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列濃度分別為5g/mL、10g/mL、25g/mL、50g/mL、100g/mL。5 儀器和設(shè)備5.1 高效液相色譜儀(配紫外檢測(cè)器)。5.2 分析天平：感量0.1mg、0.01mg。5.3 Ph酸度計(jì)。5.4 離心機(jī)：8000r/min。5.5 超聲波儀。5.6 分析篩：孔徑0.42mm。5.7 粉碎機(jī)。5.8 微孔濾膜：孔徑0.45m尼龍濾膜。6 試樣的制備按GB/T14699.1規(guī)定采樣，選取有

6、代表性飼料樣品500以上，四分法縮減至100；按GB/T20195的規(guī)定制備樣品，磨碎，全部通過(guò)分析篩(5.5)，混勻，裝入磨口瓶中備用。7 分析步驟7.1 試樣的提取7.1.1稱取試樣適量（配合飼料5.0g、濃縮飼料3.0g、預(yù)混合飼料1.0g），精確至0.001g，置于50mL三角燒瓶中，準(zhǔn)確加入流動(dòng)相（4.6）50mL，置于超聲波儀（5.5）超聲提取30min。7.1.2移取將試樣提取液（7.1.1）10mL至離心管，8000r/min，離心10min，取離心上清液1mL用0.45m尼龍濾膜過(guò)濾，濾液作為試樣溶液上機(jī)測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行兩份平行試驗(yàn)。7.2 參考色譜條件色譜柱：C18型柱，長(zhǎng)2

7、50mm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑5m，或相當(dāng)性能C18柱；檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-磷酸溶液（0.025mol/L）25:20:55（v/v）；流速：1.0mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣體積：10L。7.3 測(cè)定喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(4.7.2)和試液（7.1.2）分別進(jìn)樣，得到色譜峰面積響應(yīng)值，在線性范圍內(nèi)，用外標(biāo)法校正，測(cè)定，以保留時(shí)間定性，峰面積定量。喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)色譜圖參見(jiàn)附錄A中圖A.1。7.4 結(jié)果的計(jì)算與表述7.4.1計(jì)算公式結(jié)果按式(1)計(jì)算：X=C×V×f(1)m式中：X-試樣中喹烯酮含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；C-試液色譜峰對(duì)應(yīng)的喹烯酮

8、濃度，單位為微克每毫升（g/mL）；m-試樣質(zhì)量，單位為克（g）；V-定容體積，單位為毫升（mL）f-稀釋倍數(shù)。7.4.1 結(jié)果表示平行測(cè)定2次結(jié)果用算術(shù)平均值表示，計(jì)算結(jié)果保留3位有效數(shù)字。8 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。附 錄 A（資料性附錄）喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的圖譜0123456789mAU010203040506070 4.815 - ?圖A.1喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖 3飼料中喹烯酮的測(cè)定高效液相色譜法編制說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)名稱飼料中喹烯酮的測(cè)定高效液相色譜法任務(wù)來(lái)源（項(xiàng)目計(jì)劃號(hào)）安徽省市場(chǎng)監(jiān)督管理局關(guān)于下達(dá)安徽省市場(chǎng)監(jiān)督管理局關(guān)于下達(dá)城市再生

9、水管網(wǎng)工程技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)等66 項(xiàng)地方標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃的通知（皖市監(jiān)函2021225 號(hào)），計(jì)劃編號(hào)為2021-1-62項(xiàng)。負(fù)責(zé)起草單位（蓋章）安徽省獸藥飼料監(jiān)察所單位地址合肥市包河區(qū)濱湖新區(qū)洞庭湖路3355號(hào)參與起草單位標(biāo)準(zhǔn)起草人（全部起草人，應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)文本前言中起草人排序一致）序號(hào)姓名單位職務(wù)職稱電話1劉發(fā)全安徽省獸藥飼料監(jiān)察所2編制情況1、編制過(guò)程簡(jiǎn)介標(biāo)準(zhǔn)起草過(guò)程：2021年6月15日安徽省市場(chǎng)監(jiān)督管理局關(guān)于下達(dá)安徽省市場(chǎng)監(jiān)督管理局關(guān)于下達(dá)城市再生水管網(wǎng)工程技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)等66 項(xiàng)地方標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃的通知（皖市監(jiān)函2021225 號(hào)），本標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)劃編號(hào)為計(jì)劃編號(hào)為2021-1-62項(xiàng)，標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)后，隨即成立標(biāo)準(zhǔn)編制課

10、題組，成員有劉發(fā)全、許世富等15人，確定專人負(fù)責(zé)，明確分工，在2021年10月-2022年1月期間，項(xiàng)目組主要對(duì)前期研究的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行總結(jié)、查閱相關(guān)資料，包括國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)以及相關(guān)的研究論文。在此基礎(chǔ)上，對(duì)資料進(jìn)行總結(jié)分析和整理，在廣泛征求意見(jiàn)后，確定了本標(biāo)準(zhǔn)的提綱，起草形成送審稿。本規(guī)程按GB/T1.1-2020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則給出的規(guī)則起草。在制定過(guò)程中，得到了行業(yè)專家的大力支持，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)提出了很多具體意見(jiàn)，使標(biāo)準(zhǔn)逐漸完善、科學(xué)和更具有可操作性。2、制定標(biāo)準(zhǔn)的必要性和意義喹烯酮屬于喹噁啉類為合成抗菌藥，對(duì)革蘭氏陰性菌有很強(qiáng)的殺菌力，特別對(duì)致

11、病性溶血性大腸桿菌敏感性最高，對(duì)密螺旋體也有抑制作用，添加在飼料中具有明顯的抗菌和促生長(zhǎng)作用，可促進(jìn)蛋白質(zhì)同化，提高飼料轉(zhuǎn)化率與瘦肉率，因其效果好，價(jià)格便宜，但研究發(fā)現(xiàn)具有蓄積毒性和致突變性，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2018年發(fā)文禁止在飼料中添加喹烯酮，對(duì)于飼料中喹烯酮的測(cè)定，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2086號(hào)公告采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法采用儀器價(jià)格昂貴，一般檢測(cè)機(jī)構(gòu)普及率不高，并且這類物質(zhì)為達(dá)到促生長(zhǎng)、提高瘦肉率的效果，其在飼料中的添加量高于5 mgkg；安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)飼料中喹烯酮的測(cè)定-高效液相色譜法（DB34/T 1363-2011），有些地方不完善，比如方法中試樣的制備，不能滿足當(dāng)前新型飼料中喹烯酮檢測(cè)

12、，為了加強(qiáng)對(duì)飼料監(jiān)管，本次參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，重新修訂了飼料中喹烯酮的測(cè)定-高效液相色譜法（DB34/T 1363-2011），以滿足當(dāng)前規(guī)范化檢測(cè)，對(duì)推動(dòng)我省飼料工業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。3、制定標(biāo)準(zhǔn)的原則和依據(jù)，與現(xiàn)行法律法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系。本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)飼料中喹烯酮的測(cè)定的實(shí)際需要，編制遵循“前沿性、科學(xué)性、實(shí)用性、規(guī)范性”的原則，按照中華人民共和國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化法和安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)管理辦法等有關(guān)法律、法規(guī)修訂。4、主要條款的說(shuō)明，主要技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)、試驗(yàn)驗(yàn)證的論述（詳細(xì)說(shuō)明）1 儀器與試劑1.1儀器Agilent 1260高效液相色譜儀，配紫外檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱；Waters Symmetry

13、C18 ( 4.6 ×250mm 5m) 色譜柱；UV-2501PC紫外分光光度計(jì)； BS21S天平：感量0.01mg，Bs224s天平：感量0.1mg；BP100s酸度計(jì)： pH（1-14）；CR22G離心機(jī)；KQ-300DE超聲波清洗機(jī)。1.2試劑喹烯酮對(duì)照品（批號(hào)：H200806， 含量99.4%），購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；飼料，來(lái)自安徽某飼料生產(chǎn)企業(yè)；乙腈、甲醇均為色譜純， FISHER Chemical公司，二甲基甲酰胺、磷酸均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，水：水質(zhì)符合實(shí)驗(yàn)室一級(jí)用水的規(guī)定。2方法與結(jié)果2.1溶液配制2.1.1流動(dòng)相的配制 流動(dòng)相：乙腈-甲醇-水(25

14、:20:55)體積比配制，用磷酸(0.25mol/L)調(diào)pH=3.0混勻；2.1.2喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液： 精密稱取喹烯酮對(duì)照品50mg于100ml棕色容量瓶，用10ml二甲基甲酰胺溶解，加入甲醇至刻度，溶解成500µgmL的儲(chǔ)備液。2.1.3工作液的配置 臨用前精密量取喹烯酮儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相稀釋成濃度為2、5、10、20、40、100µgmL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。2.1.4供試品溶液的制備 取飼料樣品約500，四分法縮減至100，磨碎，全部通過(guò)0.42孔徑分析篩，充分混勻，精確稱取飼料飼料2g置于50mL離心管中，準(zhǔn)確加入流動(dòng)相25mL，振搖混勻，超聲提取30min后，以8000 r

15、/min離心10 min，取離心上清液用0.45 m尼龍濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。2.2高效液相色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18 ( 4.6 ×250mm 5m) 色譜柱，流動(dòng)相：乙腈-甲醇-水(25:20:55)體積比（V:V）pH=3.0,流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)260nm,柱溫：室溫，進(jìn)樣量：10L，在上述色譜條件下，喹烯酮對(duì)照品溶液的典型色譜圖見(jiàn)圖1。0123456789mAU010203040506070 4.815 - ?圖1喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖2.3線性關(guān)系考察依次吸取喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液2、5、10、20、40、100

16、81;gmL繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及回歸方程，以喹烯酮溶液濃度（µgmL）X與其所得峰面積（Arear）Y作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，線性范圍為1100（µgmL）回歸方程為y=52.510*x+30.544，相關(guān)系數(shù)R=0.9993，在此范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可以用于準(zhǔn)確定量。2.4精密度試驗(yàn)取對(duì)照品工作液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定喹烯酮對(duì)照品工作液峰面積，RSD為0.34%，表明分析方法符合精密度的要求。2.5回收率試驗(yàn)按“2.1.4”方法操作，測(cè)定樣品中喹烯酮的含量，結(jié)果見(jiàn)表1，回收率在80110%之間，表明回收率較好，該方法符合要求。圖2喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)曲線表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table1

17、 Results of recovery tests (n=6)樣品添加濃度（mg/Kg）實(shí)測(cè)濃度（mg/Kg）回收率（）平均回收率（）相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（） RSD 喹烯酮21.73786.984.99.23543.9887.9108.46184.62017.13185.75042.18584.410079.1979.22.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液，在室溫下放置1、6、12、24、48h后，測(cè)定試樣中喹烯酮的峰面積，RSD為0.86%（n=5）。2.7樣品測(cè)定取飼料樣品，每批按“2.1.4”方法制備3份平行樣，按2.2色譜條件注入HPLC，測(cè)定樣品中喹烯酮的峰面積，外標(biāo)法計(jì)算樣品含量，結(jié)果喹烯酮含量

18、為51.4（mg/kg）。3討論與結(jié)論3.1測(cè)定波長(zhǎng)的選擇取喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用流動(dòng)相稀釋成5µgmL工作溶液,以流動(dòng)相為空白,在220-360nm波長(zhǎng),用紫外分光光度計(jì)作雙波長(zhǎng)掃描,找其最大特征吸收峰,喹烯酮在260nm波長(zhǎng)最大吸收峰，因此選擇260nm為測(cè)定波長(zhǎng)。圖3喹烯酮紫外掃描光譜3.2 流動(dòng)相流速的優(yōu)化考察了流動(dòng)相流速的分析效果，分別為： 0.8mLmin、1.0mLmin、1.2mLmin，結(jié)果表明流速為1.0mLmin分離度大于1.5，分離效果最好，因此選擇流動(dòng)相流速為1.0mLmin。3.3 3.3流動(dòng)相的選擇與優(yōu)化通過(guò)對(duì)不同流動(dòng)相以及不同比例進(jìn)行試驗(yàn)，以甲醇、水為流動(dòng)相，改變甲醇的比例對(duì)樣品進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，流動(dòng)相中甲醇含量減小，其對(duì)溶質(zhì)與固定相之間氫鍵作用的競(jìng)爭(zhēng)能力減弱，溶質(zhì)在固定相上的保留逐漸增強(qiáng)，分離度逐漸增大。但由于溶質(zhì)保留太強(qiáng)