核黃素微生物發(fā)酵工藝

1、核黃素微生物發(fā)酵工藝動醫(yī)104班 17110417 國夢婕摘要：本文簡介了核黃素的理化特性，概述了其在動物生長、飼料、疾病防治等方面的作用，重點介紹了微生物發(fā)酵產(chǎn)核黃素生產(chǎn)工藝的特點，工藝過程，設(shè)備，質(zhì)量檢測等內(nèi)容，并展望了其發(fā)展。關(guān)鍵詞：核黃素；生產(chǎn)工藝；微生物；發(fā)酵核黃素又稱維生素B2（VB2）、維生素G或乳黃素，屬于水溶性B族維生素，1920 年被第一次發(fā)現(xiàn)，1931 年第一次從卵蛋白中分離出來，1935 年核黃素的化學結(jié)構(gòu)被鑒定1。其輔酶形式是黃素單核苷酸和黃素腺嘌呤二核苷酸。核黃素是自然界中存在廣泛的一種氨基酸，是哺乳動物必需的一種營養(yǎng)物質(zhì)。與其它的B族維生素相同，核黃素在動物體內(nèi)的

2、儲存是有限的，因此，需要每日由飲食提供。1核黃素的分子結(jié)構(gòu)及理化特性1.1核黃素的分子結(jié)構(gòu)核黃素的分子式是C17H20O6N4，分子量為376.36。系統(tǒng)命名為7,8-二甲基-10-（1'-D-核糖基）-異咯嗪。1.2核黃素的理化特性核黃素是一種黃色到橙黃色細針狀晶體，微臭，微苦，是一個核糖醇側(cè)鏈的異咯嗪的衍生物。其在常溫下穩(wěn)定，在278282 熔融并且分解（約在240 時變色），并且不受氧氣影響。核黃素微溶于水，在27.5 下，溶解度為12 mg/100mL，核黃素水溶液呈黃色并有綠色熒光。其稍溶于乙醇、環(huán)已醇、苯甲醇、乙酸，不溶于乙醚、氯仿、丙酮和苯，可溶于氯化鈉溶液，易溶于稀的氫

3、氧化鈉溶液，在堿性溶液中容易溶解，在強酸溶液中穩(wěn)定。耐熱、耐氧化。光照及紫外照射引起不可逆的分解。2核黃素的生物作用核黃素是機體必需微量營養(yǎng)素之一，具有廣泛的生理機能，被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為評價人體生長發(fā)育和營養(yǎng)狀況的六大指標之一。在生物體內(nèi)，核黃素以黃素單核苷酸和黃素腺嘌呤二核苷酸的形式存在，直接參與碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪的生物氧化作用，在生物體內(nèi)具有多種生理功能。因而核黃素在食品、飼料、醫(yī)藥工業(yè)等方面具有廣泛的應(yīng)用前景2-4。如果機體缺乏核黃素就會影響生物體正常的氧化作用, 引起物質(zhì)代謝紊亂, 出現(xiàn)一系列的病癥, 嚴重的將會導(dǎo)致死亡。如雞的核黃素缺乏，就會導(dǎo)致其消化機能衰退，眼與皮

4、膚抗抵力下降，從而使小雞易患曲爪病，種雞則會影響種蛋的孵化率。豬的核黃素缺乏，就會導(dǎo)致其生長遲緩，四肢僵硬，皮膚破裂，慢性腹瀉，眼睛發(fā)炎等。因此，對于集約化養(yǎng)殖來說，核黃素是一種不可缺少的飼料營養(yǎng)成分。在飼料中適當添加核黃素，不僅能夠滿足畜禽生長和生產(chǎn)的需要，還能在一定程度上降低疾病的發(fā)病率。3核黃素生產(chǎn)工藝核黃素較早就實現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)。目前，國際生產(chǎn)核黃素的工藝方法主要有4種：植物抽提法、化學合成法、微生物發(fā)酵法以及半微生物發(fā)酵半化學合成法4。其中，微生物發(fā)酵法是近年來發(fā)展起來的一種經(jīng)濟有效的方法，其生產(chǎn)核黃素具有設(shè)備簡單、對環(huán)境無污染、成本低、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)品純度較高等優(yōu)點，已經(jīng)成為國內(nèi)外

5、工業(yè)生產(chǎn)核黃素的發(fā)展趨勢。以下將對微生物發(fā)酵工藝進行介紹。3.1微生物菌種自然界中，可以代謝產(chǎn)生核黃素的微生物有很多，包括真菌（如酵母菌），細菌等，而應(yīng)用于核黃素工業(yè)生產(chǎn)的菌種非常少。在微生物發(fā)酵法中，要提高核黃素產(chǎn)量和經(jīng)濟效益的，優(yōu)良的菌種是必要條件之一5。常用的有棉病阿舒囊霉（Ashbya gossypii）、枯草芽孢桿菌（Bcillus subtilis）和阿舒假囊酵母（Eremothecium ashbyii）等（表1）4。表1 核黃素工業(yè)生產(chǎn)中常用菌種菌種名稱學名分類地位阿舒假囊酵母Eremothecium ashbyii酵母Candida flareri酵母Saccharomyce

6、s cerevisiae酵母棉病阿舒囊霉Ashbya gossypii霉菌枯草芽孢桿菌Bcillus subtilis細菌3.2生產(chǎn)過程微生物發(fā)酵法生產(chǎn)核黃素，采用三級發(fā)酵法。將在25培養(yǎng)成熟的核黃素產(chǎn)生菌的斜面孢子用無菌水制成孢子懸浮液，然后接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)（30，3040小時），最后將二級發(fā)酵液移種至三級發(fā)酵罐發(fā)酵（30，160小時），得到核黃素發(fā)酵液。培養(yǎng)菌種發(fā)酵提純干燥檢驗包裝成品圖1 核黃素發(fā)酵生產(chǎn)主要工藝流程3.2.1菌種的選取 隨著分子生物技術(shù)、基因工程技術(shù)等的發(fā)展，核黃素生產(chǎn)菌將具備產(chǎn)量高、耗能低、產(chǎn)品純度低等優(yōu)點。姜小山等以阿舒假囊酵母為出發(fā)菌株，在合成培養(yǎng)基上誘變篩選

7、得到了數(shù)株抗嘌呤拮抗物8-AG的突變株，進行傳代和搖瓶發(fā)酵試驗，發(fā)現(xiàn)核黃素的產(chǎn)量比出發(fā)菌株最高提高15.5%6。由此可見，利用基因工程等手段選取優(yōu)良菌種，是非常必要且有效的。菌種茄子瓶斜面289d茄子瓶斜面283-4d孢子懸浮液種子罐29-3034-36h發(fā)酵罐29-30170d滅菌3.2.2發(fā)酵方法的選取 核黃素的微生物發(fā)酵法包括兩種：固體發(fā)酵法和液體深層發(fā)酵法。固體發(fā)酵法是以豆渣為原料進行生產(chǎn)的，具有工藝設(shè)備簡單，原料廣泛，技術(shù)條件要求較低等特點，但又具有生產(chǎn)效率不高，勞動強度大，生產(chǎn)成本較高等缺點。液體深層發(fā)酵法適用于機械化大量生產(chǎn)，原料的利用率較高，有利于降低生產(chǎn)成本，但卻需要較高的設(shè)

8、備條件要求，所需原料量大。圖2 深層發(fā)酵法生產(chǎn)流程3.2.3核黃素的提取 將核黃素從發(fā)酵液中提取出來的方法，主要有四種：重金屬鹽沉淀法、Morehouse法、酸溶液法和堿溶液法。過去，工業(yè)生產(chǎn)中多采用酸溶液法提取核黃素。但由于酸溶液法提取核黃素的耗能較大，經(jīng)一次溶解、結(jié)晶，獲得核黃素純度只有60%70%。章克昌等成功利用堿溶液法提取核黃素，并經(jīng)二次分離結(jié)晶，獲得純度達92.6%的成品，使得核黃素的提取技術(shù)極大提高7。堿溶法提取核黃素不僅收益率高，而且能耗低。隨著離心分離設(shè)備的不斷改進，堿溶法分離提取核黃素的優(yōu)越性將越來越明顯。發(fā)酵液發(fā)酵液預(yù)處理熱處理或酸處理等堿溶直接分離固液分離（絮凝）（絮凝

9、）（不經(jīng)預(yù)處理）高溫冷卻傾析式離心機離心過濾膜過濾離心含核黃素的清夜菌體與核黃素的混合物核黃素提取離心吸附洗脫蒸發(fā)結(jié)晶水玻璃化學沉淀微生物沉淀回調(diào)pH值沉淀多次萃取然后冷卻核黃素粗晶體核黃素純化 （溶解粗晶體）加熱后冷卻氧化回收活性炭吸附后過濾重結(jié)晶圖3 核黃素分離提純匯總3.2.4核黃素的測定 測定發(fā)酵液中核黃素的含量與質(zhì)量，主要有四種方法：微生物法、熒光比色法、高效液相色譜技術(shù)（HPLC）、核黃素化學發(fā)光新方法8。在實際生產(chǎn)過程中，前三種方法，存在的一個很大的缺點是樣品的處理和測定都必須在嚴格的避光條件下進行，并且極易受到干擾。微生物法雖然靈敏度高，檢測限低，可以測到0.10mg/L濃度，

10、但微生物的培養(yǎng)較緩慢，處理繁雜。而近年來，化學發(fā)光分析方法由于它的靈敏度高、分析速度快、方法簡便等特點，越來越受到人們的歡迎。3.2.5核黃素顆粒的制備 微生物發(fā)酵生產(chǎn)的核黃素需要干燥才能制成核黃素成品。常用干燥方法大致可以分為兩種：噴霧干燥法和普通氣流干燥法。張粉艷等研究了核黃素發(fā)酵液噴霧干燥的新工藝，采用不同噴嘴孔徑可得到不同粒徑的顆粒和固體回收率9，通過壓力式噴霧器進行干燥制得固體核黃素超細粉末，采用壓力噴霧式霧化能生產(chǎn)小顆粒物料，減少細粉飛揚，從而提高干粉回收率，且噴嘴制造簡單，加工方便，在工業(yè)上有較廣的應(yīng)用。3.3生產(chǎn)設(shè)備 利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)核黃素過程中，用到的設(shè)備主要有：冰箱、滅菌

11、鍋、試管、三角瓶、搖床、無菌操作間、離心機、壓濾機、小型發(fā)酵罐（種子罐），大型發(fā)酵罐、蒸汽管道等。3.4生產(chǎn)中的注意事項首先，整個生產(chǎn)過程中要嚴格控制在無菌的條件下進行，抗菌素在加入時溫度不能太高，防止抗生素失活；其次，發(fā)酵罐在使用之前，要進行嚴格的滅菌，防止雜菌的污染；第三，發(fā)酵罐與培養(yǎng)基的滅菌要分開進行；第四，發(fā)酵罐進行高溫滅菌時，要注意夾套里注水，防止損壞發(fā)酵罐；第五，發(fā)酵過程中，要注意pH值的變化；第六，注意溶氧的變化；第七，發(fā)酵后期要注意加壓以維持氧濃度。4總結(jié)與其它方法相比，微生物發(fā)酵法也存在一些缺點，例如：在核黃素的后期加工處理過程中，核黃素的分離純化比較困難，很難制得高純度的核

12、黃素。因此，用微生物發(fā)酵法制得的核黃素主要應(yīng)用于飼料行業(yè)，而用于制藥和食品行業(yè)的核黃素大部分還是來自于化學合成法。但是隨著核黃素分離純化技術(shù)的不斷改進，微生物發(fā)酵法將以其環(huán)保、節(jié)能、低成本等優(yōu)點最終取代化學合成法。參考文獻：1. 項昭保, 戴傳云, 朱蠡慶. 核黃素生理生化特性及其功能J.食品研究與開發(fā), 2004, 25(12) : 90- 95.2. 童朝陽，徐琪壽. 核黃素的藥理作用及應(yīng)用前景J.軍事醫(yī)學科學院院刊，2003(6):223-2263. 杜留云，裘娟萍. 核黃素在動物中的作用J.江西飼料，2002(2):17-194. 儀宏, 朱文正, 張華峰. 核黃素生產(chǎn)技術(shù)發(fā)展J.中國食品添加劑, 2003(4) : 14- 17.5. 邱蔚然, 高淑紅. 發(fā)酵法生產(chǎn)核黃素J.工業(yè)微生物, 2000,30(1) : 58- 64.6. 姜小山，孫國萍，王