海洋發(fā)光細菌的發(fā)光及其應(yīng)用

1、第28卷第2期2007年4月發(fā)光學報CHINESE JOURNALOF LUMINESCENCEVol·28 No·2Apr., 2007文章編號: 1000-7032(2007)02-0167-06海洋發(fā)光細菌的發(fā)光及其應(yīng)用張進興,逄愛梅,孫修勤,孫培光(國家海洋局第一海洋研究所,山東青島266061)摘要:海洋發(fā)光細菌是一類在正常的生理條件下能夠發(fā)射可見光的異養(yǎng)細菌,其發(fā)光特性與細菌體內(nèi)的物質(zhì)結(jié)構(gòu)、海洋環(huán)境要素、水中污染物等多種因素有關(guān)。通過對海洋發(fā)光細菌發(fā)光特性及其應(yīng)用可能性的論述,如利用發(fā)光細菌的發(fā)光強度與水中毒物的濃度、毒性的關(guān)系檢測污染物;利用潛艇航行時激發(fā)的生

2、物發(fā)光勾畫出潛艇渦動的光尾流可跟蹤探測潛艇;海洋發(fā)光細菌的發(fā)光特性還可用以改進水下光通訊與探測、海洋水色遙感、海洋發(fā)光細菌分類、發(fā)光免疫和抗菌素濃度測定等方面。闡明海洋發(fā)光細菌發(fā)光特性的重要研究意義并為進一步開展應(yīng)用研究提供借鑒。關(guān)鍵詞:海洋發(fā)光細菌;發(fā)光特性;應(yīng)用研究中圖分類號:O482. 31PACC:3250F; 7860P文獻標識碼:A收稿日期:2006-08-25;修訂日期:2006-11-24基金項目:國家科技基礎(chǔ)條件平臺項目(海洋微生物菌種種質(zhì)資源標準化整理整合與共享)(2004DKA30640);國家908項目(我國近海海洋綜合調(diào)查與評價)基金資助項目作者簡介:張進興(1954

3、-),男,山東濰坊人,研究員,主要從事應(yīng)用微生物學的研究。E-mai:l zhangjx fio. org. cn, Te:l (0532)889674491引言海洋發(fā)光細菌的發(fā)光現(xiàn)象一直是人們十分關(guān)注的問題,各國科學家對此進行了多方面的調(diào)查研究。國內(nèi)對海洋發(fā)光細菌發(fā)光的觀測研究已有多年歷史。在國標海洋調(diào)查規(guī)范中,早已把“海發(fā)光”列為海洋調(diào)查內(nèi)容,其中“彌漫型”海發(fā)光便是由海洋發(fā)光細菌產(chǎn)生的,作為常規(guī)海洋觀測項目之一,已積累了許多現(xiàn)場觀測資料。近年來,由于實際應(yīng)用的需要,對海洋發(fā)光細菌的觀測研究有所加強,如現(xiàn)正進行的西北太平洋環(huán)境調(diào)查研究項目中,就包含了海洋發(fā)光細菌的分布調(diào)查。有關(guān)海洋發(fā)光細菌

4、的研究內(nèi)容相當廣泛,從近期國內(nèi)外發(fā)表的文獻資料看,主要有海洋發(fā)光細菌的發(fā)光機理,發(fā)光基因、熒光素酶、發(fā)光特性以及某些應(yīng)用方法等研究。在發(fā)光特性研究方面,以往更多地側(cè)重于細菌發(fā)光與其體內(nèi)物質(zhì)、結(jié)構(gòu)關(guān)系的研究,即側(cè)重于微生物學和生物化學方面的研究,而在環(huán)境要素和細菌種類、密度等對細菌光譜的影響方面的研究相對較少。在海洋發(fā)光細菌的研究中,發(fā)光特性及其應(yīng)用研究是一項重要內(nèi)容。利用細菌的發(fā)光特性,開展應(yīng)用研究,尤其結(jié)合光學原理,制作某些傳感器,用于海洋環(huán)境污染監(jiān)測,已引起國內(nèi)外廣泛重視。為了研究海洋發(fā)光細菌發(fā)光特性的應(yīng)用前景,首先必須深入了解海洋發(fā)光細菌的性質(zhì),積累發(fā)光細菌發(fā)光特性的基礎(chǔ)資料和研究經(jīng)驗。

5、然后,依據(jù)細菌發(fā)光的不同特性和應(yīng)用可能性,開展相應(yīng)的應(yīng)用研究。此類研究不僅可為細菌發(fā)光特性的應(yīng)用提供有效方法,并將促進海洋生物學、海洋光學、生物化學之間交叉學科綜合研究的發(fā)展,為從物理學角度研究海洋發(fā)光細菌提供依據(jù)。為此,本文擬在簡要綜述海洋發(fā)光細菌的分布特點與發(fā)光機理研究基礎(chǔ)上,論述發(fā)光特性及其在海洋環(huán)境污染物監(jiān)測、發(fā)光細菌分類、水下通訊探測和水色遙感上的應(yīng)用研究現(xiàn)狀,為進一步開展海洋發(fā)光細菌發(fā)光特性的應(yīng)用研究提供借鑒。2分布特點與發(fā)光機理海洋發(fā)光細菌是一類從海水中或者從海洋動物體表、消化道和發(fā)光器官上以及海底沉積物中可以分離到的,在適宜條件下能夠發(fā)射可見光的異養(yǎng)細菌。海洋中的發(fā)光細菌,除了

6、在海水中自由浮游生存的外,還有寄生于其他海洋生物體的。許多海洋生物的發(fā)光與發(fā)光細菌有關(guān),如某些魚類、軟體動物等的發(fā)光是由海洋發(fā)光細菌寄生、共168發(fā)光學報第28卷棲生存所致。海洋發(fā)光細菌的種類不是很多,但其分布卻非常廣,從海表層至深海;從熱帶海洋至非常寒冷的極地海域都有其蹤跡。為了更好地掌握海洋發(fā)光細菌的發(fā)光特性及應(yīng)用可能性,除需要了解發(fā)光細菌的分布特點外,也有必要對發(fā)光細菌的發(fā)光機理作簡要介紹。發(fā)光機理的研究結(jié)果表明,不同種類的發(fā)光細菌其發(fā)光機理是基本一致的,都必須有細菌熒光素酶(LE)、還原性的黃素單核苷酸(FMN·H2)、氧氣(O2)、長鏈脂肪醛(RCHO)的參與,大致歷程如下

7、:FMNH2+LEFMNH2·LE +O2LE·FMNH2·O2+RCHOLE·FMNH2·O2·RCHOLE·FMN+H2O+RCOOH+光概括地說,細菌生物發(fā)光反應(yīng)是由分子氧作用,胞內(nèi)熒光酶催化,將還原態(tài)的黃素單核苷酸及長鏈脂肪醛氧化為黃素單核苷酸(FMN)及長鏈脂肪酸,同時釋放出藍綠光。發(fā)光細菌發(fā)出的光是連續(xù)的,屬“冷光”。這是一種化學發(fā)光類型,在化學能轉(zhuǎn)換為輻射能的過程中發(fā)光。熒光素酶是菌體內(nèi)催化熒光素或脂肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱,細菌熒光素酶是含、兩個多肽亞基的單加氧酶,只有兩個亞基共存時才有活性。從不同海洋發(fā)光

8、細菌中提取的細菌熒光素酶其分子量差別較小。由于海洋發(fā)光細菌發(fā)光細胞內(nèi)含有熒光素和熒光素酶,有了氧氣,細胞內(nèi)的熒光素就受到熒光素酶的催化作用而吸收能量,變成氧化熒光素并釋放光子而發(fā)光。不同種類的海洋發(fā)光細菌可產(chǎn)生不同的熒光素酶,發(fā)光特性也不同。3發(fā)光特性研究海洋發(fā)光細菌的發(fā)光特性研究,包括不同菌種所具有的特異光譜特性研究,發(fā)光強度、發(fā)光特征參數(shù)和發(fā)光條件對細菌發(fā)光的影響等項研究,以及不同種類的發(fā)光組分和酶結(jié)構(gòu)的差異研究。各種生物發(fā)光的本質(zhì)大體一樣,都是由一組化合物熒光酶和高能化合物腺苷三磷酸等構(gòu)成發(fā)光光源。它們發(fā)出的藍、青、綠、黃、橙等不同顏色的光,是因為各自的熒光素、熒光酶在結(jié)構(gòu)上的微小差異引

9、起的。發(fā)光細菌的光譜范圍約420670 nm,max在475485 nm左右,為單一發(fā)射峰,max和半峰全寬有種屬差異。從發(fā)光特征參數(shù)發(fā)光量子產(chǎn)率來看,其生物發(fā)光反應(yīng)特點是高光子產(chǎn)生效率: 0. 50. 8。通過發(fā)射光的比率可以推出未知成分的濃度,因此測定化學反應(yīng)過程中的發(fā)射光是非常有用的。反應(yīng)過程中產(chǎn)生的光與發(fā)射光的量子產(chǎn)率是直接相關(guān)的,與相應(yīng)的發(fā)光物質(zhì)的濃度成比例。因此,反應(yīng)過程中的光可以相對反映出目標樣品中發(fā)光物質(zhì)的量。有關(guān)生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移是指在一個發(fā)光或熒光供體和一個熒光受體(如綠色熒光蛋白的突變體GFP)之間會發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。利用這種方法可以非侵入性地監(jiān)測特異蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相

10、互作用。如Kudryasheva等1研究了細菌生物發(fā)光電子激發(fā)態(tài)上限能量估算,用染色分子作為能量接收者,證實了細菌生物發(fā)光電子激發(fā)態(tài)上限活動的假設(shè)。并給出了MSB(Methylstyryl benzene)中的偶聯(lián)酶系統(tǒng)NADHFMN-氧化還原酶-熒光素酶的細菌發(fā)光光譜。從已有的實驗研究結(jié)果看,大多數(shù)發(fā)光細菌的發(fā)光,僅發(fā)生于高細胞密度,細菌發(fā)光依賴于培養(yǎng)體系中誘導蛋白的濃度和積累。細菌種類和生長條件,包括溫度、鹽度和營養(yǎng)成分以及其他實驗條件對其發(fā)光也有影響2。在正常的生理條件下,發(fā)光細菌能發(fā)出波長為450490 nm的藍綠光;在一定的試驗條件下,發(fā)光強度是恒定的3。但也有學者研究發(fā)現(xiàn),發(fā)光桿菌

11、屬經(jīng)某種處理后其發(fā)光光譜產(chǎn)生位移,如HajimeKaratani等4在由發(fā)光桿菌發(fā)光現(xiàn)象產(chǎn)生的兩種熒光蛋白質(zhì)的特性研究中,發(fā)現(xiàn)從深海發(fā)光細菌中分離的熒光蛋白質(zhì)中,發(fā)光桿菌屬經(jīng)提純、克隆和排序出兩種熒光蛋白質(zhì),最大發(fā)射的熒光波長在488, 517 nm。在尿素中刺激熒光蛋白質(zhì)引起488 nm譜段光強度的減弱,顯示出新的熒光峰值為423 nm;尿素消除,部分可逆轉(zhuǎn)。對海洋發(fā)光細菌的體內(nèi)生物發(fā)光光譜的研究,如朱文杰等5發(fā)現(xiàn),發(fā)光光譜有種屬特異性。以最大發(fā)射波長來說,弧菌屬為482485 nm,發(fā)光桿菌屬則在474480 nm。其中東方弧菌為(484±1) nm,半峰全寬為(92±

12、1) nm。又如朱文杰等6對東方弧菌的無細胞系統(tǒng)的發(fā)光研究,從東方弧菌的細胞裂解液中分離到一種組分,僅需長鏈脂肪醛就可以啟動發(fā)光,其最大發(fā)射峰在480490 nm。他們還測量提取物的吸收光譜和熒光光譜,其中吸收光譜顯示在414 nm處有一最大吸收峰,在380, 485 nm處各有一個弱吸收峰;反應(yīng)后的吸收光譜,除380 nm峰消失外,其余不第2期張進興,等:海洋發(fā)光細菌的發(fā)光及其應(yīng)用169變。汪杰等7則將發(fā)光細菌的生物發(fā)光光譜作微分處理,使各種發(fā)光細菌在光譜上的差異充分顯示出來。近年來,在有關(guān)刊物上發(fā)表了多篇關(guān)于海洋環(huán)境要素、細菌營養(yǎng)成分、細菌體內(nèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)等對發(fā)光細菌發(fā)光特性影響的研究論文,主

13、要的有,杜宗軍等8對一株海洋發(fā)光細菌的分離鑒定及其發(fā)光條件的初步研究表明,該菌種在pH7. 5、溫度30、NaCl濃度3. 0%時,發(fā)光強度最高;正常發(fā)光的溫度在2040、pH=6. 08. 0;液體培養(yǎng)4 h開始發(fā)光, 6 h后發(fā)光達到峰值,持續(xù)發(fā)光時間可達19 h。水體的pH值、溫度、鹽度和營養(yǎng)成分等環(huán)境條件的變化將引起熒光素酶的改變,從而改變細菌的發(fā)光特性。Hkaratani等9關(guān)于海洋中費氏弧菌生物發(fā)光的光譜分布和它的熒光蛋白及細胞密度之間的關(guān)系研究,該研究表明,費氏弧菌產(chǎn)生黃色熒光蛋白(YFP)與產(chǎn)生藍色熒光蛋白(BFP)之比,和細胞密度、菌體生長時間有關(guān);費氏弧菌在細胞生長期間生物

14、發(fā)光的改變,依賴于細胞內(nèi)YFP水平。Miyamoto等10研究了S腺苷-L-蛋氨酸有關(guān)結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)蛋白對哈維氏弧菌發(fā)光的影響。王江安等11潛艇光尾流產(chǎn)生機理及其探測技術(shù)研究表明,不同的聲波、電磁波的波長對不同種類的海洋發(fā)光細菌的生物效應(yīng)是不同的,在受到外界電磁場刺激下,將影響發(fā)光反應(yīng)生理過程,發(fā)光強度有所改變,強度的變化與受試物的類型和強度在一定范圍內(nèi)呈相關(guān)關(guān)系。發(fā)光特性與熒光素酶的結(jié)構(gòu)有關(guān),配體蛋白的相互作用,對化學修飾和致突變實驗中測定特殊氨基酸殘基的功能方面是非常有用的,而氨基酸殘基的突變可引起發(fā)光光譜的位移。對這些改變加以分析研究,將有助于加深對細菌發(fā)光規(guī)律性的認識。通過基因重組及細胞融

15、合技術(shù)可獲得能滿足各種用途的熒光素酶,改變發(fā)射光波長。有關(guān)這方面的綜合研究報道如茆燦泉等12發(fā)光細菌lux報告基因系統(tǒng)的評價及應(yīng)用和張菊梅等13熒光素酶研究進展。4細菌發(fā)光的應(yīng)用研究4.1在海洋環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用海洋環(huán)境中的污染物種類和數(shù)量日益增多,傳統(tǒng)的分析鑒定手段難以達到實時、迅速、在線的要求。發(fā)展新的快速、準確、有效的分析方法與檢測技術(shù)顯得非常迫切、必要。由于發(fā)光細菌的發(fā)光強度與某些污染物的濃度呈較好的線性關(guān)系,能夠穩(wěn)定、快速地反映環(huán)境中的污染物濃度變化;而且檢測時間短(在515 min)、靈敏度高(細胞基本物質(zhì)代謝受到影響前發(fā)光反應(yīng)先被抑制)海洋發(fā)光細菌的發(fā)光特性與環(huán)境中有毒污染物的毒性

16、有關(guān),可用于毒物的檢測。杜宗軍等2發(fā)光細菌的研究和應(yīng)用提出利用發(fā)光細菌來檢測有毒物質(zhì)。由于有毒物質(zhì)僅干擾發(fā)光細菌的發(fā)光系統(tǒng),費時較少且靈敏度高,操作簡便、結(jié)果準確,所以利用發(fā)光細菌的發(fā)光強度作為指標來監(jiān)測有毒物質(zhì),在國內(nèi)外越來越受到重視。我國于1995年將這一方法列為環(huán)境毒性檢測的標準方法(GB/T15441-1995)。這方面的研究有:黃正等14發(fā)光細菌的生理特性及其在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用,就發(fā)光細菌的生理特性、發(fā)光細菌毒性試驗在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用及該技術(shù)的新進展3個方面進行了較為全面的概述,評價了發(fā)光細菌毒性試驗的特點,提出了該技術(shù)今后的發(fā)展方向,預視它將成為環(huán)境監(jiān)測的重要手段。薛建華等15發(fā)光

17、細菌應(yīng)用于監(jiān)測水環(huán)境污染的研究中指出,水環(huán)境中的汞、苯酚都抑制細菌發(fā)光,且抑制程度與汞、苯酚的濃度之間存在著明顯的相關(guān)關(guān)系。吳偉等16發(fā)光細菌在漁業(yè)水域污染物毒性快速檢測中的應(yīng)用一文中,以明亮發(fā)光桿菌為指示生物,對漁業(yè)區(qū)域中污染物的急性毒性進行了檢測;同時研究了pH值、溫度對檢測結(jié)果的影響。研究表明,發(fā)光細菌毒性試驗是一種快速、簡便的毒性測試方法,在溫度2030, pH6. 09. 0條件下進行的測試,其結(jié)果與魚類毒性試驗可以互相替代。林志芬等17在發(fā)光菌生物毒性測試方法的改進中,針對發(fā)光菌發(fā)光強度本底差異較大,檢測期間發(fā)光變化幅度寬的問題,在傳統(tǒng)發(fā)光細菌毒性測試實驗中引入校正因子(P2丙酮)

18、;同時也研究了磁力攪拌時間、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)代數(shù)和培養(yǎng)溫度等條件對EC50測定值的影響。海洋發(fā)光細菌種類不同時,發(fā)光特性有變化,其最佳的發(fā)光條件也不同。因此,利用不同種類的海洋發(fā)光細菌的發(fā)光特性,可以監(jiān)測海洋環(huán)境中的某些污染物。在應(yīng)用細菌發(fā)光特性探測污染物的有關(guān)研究中,利用發(fā)光細菌制備識別元件,成為海洋環(huán)境中污染物探測傳感器研究和發(fā)展的熱點。20世紀80年代初,美國Beck-man公司推出功能完備的170發(fā)光學報第28卷生物毒性測試儀,它具有應(yīng)用范圍廣、靈敏度高、相關(guān)性好、反應(yīng)速度快等優(yōu)點,受到廣泛重視。發(fā)光細菌毒性測試技術(shù)在世界范圍內(nèi)迅速推廣。黃正等細菌發(fā)光傳感器在快速檢測污染物急性毒性中的應(yīng)

19、用18一文中以明亮發(fā)光桿菌作為指示生物,將細胞固定化技術(shù)、生物傳感器與發(fā)光細菌毒性測試技術(shù)有機結(jié)合起來,建立了細菌發(fā)光傳感器。在細菌發(fā)光傳感器研制中,篩選優(yōu)良的菌種是關(guān)鍵技術(shù)之一。4.2在發(fā)光細菌分類、發(fā)光免疫和抗菌素濃度測定上的應(yīng)用以往的發(fā)光細菌分類研究結(jié)果表明,海洋發(fā)光細菌主要分為3個屬,分別是:發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)、弧菌屬(Vibrio)和異短桿菌屬(Xenorhabdus)。發(fā)光細菌的分類鑒定按常規(guī)方法進行比較繁瑣,往往需要做大量的生理、生化特征實驗,而這些實驗既費時又費力。在發(fā)光細菌分類中,還可利用發(fā)光細菌的發(fā)光光譜作為分類的重要特征,用熒光分光光度計測定發(fā)光細

20、菌的發(fā)光光譜就簡便多了。如前面提到的,朱文杰等對海洋發(fā)光細菌的生物光譜研究表明,由于發(fā)光細菌有種屬特異性,因而發(fā)光光譜可作為發(fā)光細菌分類的重要特征。又如汪杰等對發(fā)光細菌發(fā)光的一、二階微分光譜的檢測結(jié)果表明,不同種的發(fā)光細菌的微分光譜有顯著差異,同一種菌的不同菌株則無顯著差異,表明生物發(fā)光光譜,微分光譜可作為發(fā)光細菌菌種分類的特征。也就是說,依賴生物發(fā)光光譜及其微分光譜,不僅在發(fā)光細菌屬的認定上有幫助,還可以區(qū)分不同的菌種。不同菌種有其自身的光譜特征參數(shù),因而研究其光譜特征,可以在發(fā)光細菌分類中找到簡便有效的方法。在生物發(fā)光分析技術(shù)應(yīng)用研究方面,由于發(fā)光測量具有靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好、反應(yīng)

21、速度快、使用方便等優(yōu)點,在免疫學、微生物學、生物化學、臨床檢驗、病毒學等得到了廣泛應(yīng)用。如Edward Jablonski19細菌熒光素酶類制品結(jié)合免疫測定法應(yīng)用于風疹抗體檢測。利用生物發(fā)光反應(yīng)的輔助因子標記抗原或抗體,免疫后,運用生物發(fā)光反應(yīng)進行檢測。免疫檢測中進行標記物的超靈敏檢測已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。生物發(fā)光反應(yīng)也已經(jīng)被證明是檢測酶標記的極為靈敏的方法,作為一種新的生物技術(shù)工具,生物免疫檢測具有一個光明的前景,已有多種雙功能生物發(fā)光分子被準備應(yīng)用到免疫檢測中。同時,還可以發(fā)光細菌的發(fā)光強度為指標去定量抗菌素的效價。如朱文杰等20“海洋發(fā)光細菌快速測定四環(huán)素效價的方法研究”中表明,目前用微生物

22、測定抗菌素效價很費時,操作也較繁瑣,四環(huán)素效價的測定亦然。試驗證明了,四環(huán)素對明亮發(fā)光桿菌A2發(fā)光的影響是在低濃度時刺激發(fā)光,較高濃度時則抑制發(fā)光,在短時間內(nèi),所用的四環(huán)素濃度跟抑制發(fā)光的效應(yīng)呈現(xiàn)依存關(guān)系。據(jù)此,利用發(fā)光細菌可以快速測定四環(huán)素的效價。還有生物發(fā)光技術(shù)在ATP水平測定中的應(yīng)用,所有活細胞都含有ATP,ATP可以從細胞中提取出來,用熒光素酶檢測,并進行生物數(shù)量評估,如微生物學家通過檢測ATP的量測定土壤或沉積物中的全部活微生物含量。4.3在水下通訊探測和水色遙感上的應(yīng)用艦船在發(fā)光水域航行,會留下曳光,使海面戰(zhàn)艦夜間暴露航蹤。在海洋中潛艇的行駛使其身后的海水形成渦流,激使發(fā)光細菌的生

23、物發(fā)光勾畫出潛艇渦動的光尾流,潛艇光尾流是發(fā)光細菌對渦流應(yīng)力攪動的一種應(yīng)激反應(yīng)。利用潛艇光尾流現(xiàn)象可對潛艇進行跟蹤探測。王江安等9在“潛艇光尾流產(chǎn)生機理及其探測技術(shù)研究”一文中就論述了這一應(yīng)用前景。水下潛艇之間用光波進行通訊或者水下潛艇與水面艦艇間的光通訊、水下光探測、照相等都可能對海洋發(fā)光細菌對光的吸收及細菌發(fā)光產(chǎn)生影響。尤其,水下通訊與探測多用藍綠光,這種波段最易透過水層,但它也正好與發(fā)光細菌發(fā)出的光譜吻合,最可能成為水下光通訊與探測的干擾源。藍綠光也是海洋水色遙感的重要工作波段,當海面存在大量發(fā)光細菌時,其產(chǎn)生的“彌漫型”發(fā)光也可能對海洋水色遙感信息產(chǎn)生影響,如何消除或減小這類干擾是相關(guān)

24、應(yīng)用技術(shù)研究中需解決的問題。5結(jié)論海洋發(fā)光細菌發(fā)光特性研究的應(yīng)用前景,近期主要集中在水下探測、環(huán)境污染監(jiān)測、發(fā)光細菌分類及抗菌素濃度測定等方面;應(yīng)用研究的深度也有進展,已由一般的應(yīng)用可能性研究,進入生物傳感器研制階段。而發(fā)光特性的應(yīng)用研究離不開對細菌發(fā)光特性的深入了解,海洋發(fā)光細菌發(fā)光特性的研究涉及微生物學、生物化學、海洋光學等第2期張進興,等:海洋發(fā)光細菌的發(fā)光及其應(yīng)用171學科,研究內(nèi)容較為廣泛且相互交叉、相互滲透。因此,不僅需要在微生物學和生物化學方面進行研究,從海洋水體光學性質(zhì)上,進行系統(tǒng)、深入的研究也是十分必要的。對發(fā)光特性的深入研究,有可能發(fā)現(xiàn)新的應(yīng)用前景,擴展應(yīng)用領(lǐng)域,為應(yīng)用技術(shù)

25、研究打下更堅實的基礎(chǔ)。參考文獻: 1 KudryashevaN S, Nemtseva E V, Sizykh A G,et al.Estimation of energy of the upper electron-excited states of thebacterial bioluminescent emitter J.J. Photochemistry andPhotobiologyB:Biology, 2002,68(2-3): 88-92. 2 EdwardAMeighen. Autoinduction of lightemission in differentspecies o

26、fbioluminescentbacteria J.Lumin., 1999,14(1): 3-9. 3 ZhuWenjie, He Xuemin, Yang Yikang. Bioluminescent emission spectra ofmarine luminous bacteria J.Chin. J.Lumin.(發(fā)光學報), 1986,7(1): 127-132 ( in Chinese). 4 Du Zongjun, WangXianghong, LiHaifeng,et al.The study and application luminescentbacteria J.Hi

27、gh TechnologyLett.(高技術(shù)通訊), 2003,12: 103-106 ( in Chinese). 5 KarataniH, Konaka T, Katsukawa C. Properties of the bimodal fluorescent protein produced by photobacterium phos-phoreum J.Photochemistry andPhotobiology,2000,71(2): 230-236. 6 Zhu Wenjie, He Xuemin, Huang Shaohua,et al.Bioluminescence of v

28、ibrio: Orientalis in vitro: Decanal initiatedbioluminescence J.ActaMicrobiologica Sinica(微生物學報), 1991,31(2): 122-127 ( in Chinese). 7 Wang Jie, ZhuWenj.i The derivative spectra of bioluminescence of fore species luminous bacteria J.J. East ChinaNormalUniversity (NaturalScience)(華東師范大學學報,自然科學版), 1998

29、,1: 89-91 ( in Chinese). 8 Du Zongjun, Wang Xianghong, LiHaifeng,et al.Isolation and identification of aluminous bacterium D40 and prmarystudies on its luminescent conditions J.Transaction ofOceanology and Limnology(海洋湖沼通報), 2003,2: 58-63( in Chinese). 9 KarataniH, Chiba T, Hiayama S·Relationsh

30、ip between spectral distribution of vibrio fischer strain Y1 bioluminescenceand intracellular level of its fluorescent proteins A.Bioluminescence and Chemiluminescence Progress and CurrentApplicationsC. 2002 byWorld Scientific Publishing, 81-84.10 Miyamoto C, Lin Ly, Huang S-Y,et al.Effect SAM-relat

31、ed structural and regulatory proteins on luminescence in vibrioharveyi A.Bioluminescence and Chemiluminescence Progress and CurrentApplicationsC. 2002 byWorld ScientificPublishing, 93-96.11 Wang Jiangan, Zong Siguang·The study engendermechanism of submarine ray track and detect ability J·L

32、aser andInfrared(激光與紅外), 2003,33(4): 280-282 ( in Chinese).12 Mao Canquan, Yang Shude. Evaluation and application of the luminous bacteria on lux report gene system J.Micro-biology(微生物學通報), 2000,2(4): 297-299 ( in Chinese).13 Zhang Jume,i Wu Qingping, Zhou Xiaoyan,et al.Advances in luciferse researc

33、h J.Microbiology(微生物學通報),2001,28(5): 98-101 ( in Chinese).14 Huang Zeng, Wang Jialing. Physiologicalproperties of luminescentbacteria and its application in environmentalmonitoringJ.EnvironmentalScience(環(huán)境科學), 1995,16(3): 87-90 ( in Chinese).15 Xue Jianhua, Wang Junhu,i Huang Chunnong. Study on appl

34、ying photobacteria to pollution monitoring ofwater environ-ment J.Bulletin ofScience andTechnology(科技通報), 1998,14(5): 339-342 ( in Chinese).16 WuWe,i XiXinwe,i Hu Gengqing,et al.Application of luminescent bacteria in rapid determination of acute toxicity ofthe pollutants in the fisherieswater J.J. Z

35、hanJiang Ocean University(湛江海洋大學學報), 1998,18(2): 22-24( in Chinese).17 Lin Zhifen, Yu Hongxia, Xu Shifen,et al.Modification of the photobacterium phosphoreum toxicity testmethod J.EnvironmentalScience(環(huán)境科學), 2001,22(2): 114-117 ( in Chinese).18 Huang Zeng, WangYazhou. The application ofbacterial lum

36、inescent biosensor in rapid determination of acute toxicity ofpollutants J.EnvironmentalScience(環(huán)境科學), 1997,18(1): 14-16 ( in Chinese).172發(fā)光學報第28卷19 Edward Jablonski·The preparation of bacterial luciferase conjugates for immunoassay and application to rubella antibodydetection J.AnalyticalBioch

37、emistry, 1985,148(1): 199-206·20 ZhuWenjie, YangYikang·A quick assay for tetracycline J.Marine Sciences(海洋科學), 1985,9(1): 48-51( inChinese).Application ofLum inescence of theM arine Lum inous BacteriaZHANG Jin-xing, PANG Ai-me,i SUN Xiu-qin, SUN Pei-guang(First Institute ofOceanography, St

38、ateOceanicAdministration People sRepublic ofChina, Qingdao266061, China)Abstract:Marine luminous bacteria, heterotrophic bacteria give outvisible light in normalphysiological con-dition. Many study results show that the luminescencemechanisms ofvariety luminous bacteria are the same.The light-emitti

39、ng in bacteria involves the oxidation of reduced riboflavin phosphate (FMNH2) and a long-chain fatty aldehyde with the emission of blue-green ligh.t The enzymes that catalyze the bioluminescencereaction in these organisms are called luciferases, and inmostcases the substrates are designated as lucif

40、erins.However, consistentwith the apparent absence of strong evolutionary relationship between many of the light-emitting systems, significantdifferences existbetween the bioluminescence reactions aswell as the structuresof the luciferases (enzymes) and luciferins (substrates) from different organis

41、ms. The luminescent characte-ristics ofmarine luminous bacteria connectwith material structure in the bacteria, marine environment ele-ments and pollutants in the seawateretc, the connectstudy includes thatspectrum property, light-emitting in-tensity, light-emitting characteristic parameter, light-e

42、mitting conditions and the structure of luciferases fromdifferent luminous bacteria. Thorough understanding these properties ofmarine luminous bacteria and carryingout the study ofapplication can supply effectivemethods for the application of the property ofmarine luminousbacteria, and promote compr

43、ehensive researches on ocean biology, ocean optics and biochemistry, and showthe feasibility ofphysics researches onmarine luminous bacteria. And the predictions show the concentrationand toxicity ofpollutants in thewater is determined by luminescent intensity of luminous bacteria, the subma-rine sa

44、iling exits the whirlpool and the luminescent bacteria bioluminescentmakes the whirlpool to be a raytrackwhich can be used to detect submarine, the luminescent characteristics can also be used to improve inthe underwater lightcommunications and exploring, oceanwater color remote sensing, bacterial c

45、lassificationbioluminescent immunity and antibiotic concentration determinationetc.In this article, important significanceof the study on luminescent characteristic ofmarine luminous bacteriawas clarified and reference is given forfurther developing.Key words:marine luminous bacteria; luminescent ch

46、aracteristic; application studyReceived date: 2006-08-25第28卷第2期2007年4月發(fā)光學報CHINESE JOURNALOF LUMINESCENCEVol·28 No·2Apr., 2007文章編號: 1000-7032(2007)02-0167-06海洋發(fā)光細菌的發(fā)光及其應(yīng)用張進興,逄愛梅,孫修勤,孫培光(國家海洋局第一海洋研究所,山東青島266061)摘要:海洋發(fā)光細菌是一類在正常的生理條件下能夠發(fā)射可見光的異養(yǎng)細菌,其發(fā)光特性與細菌體內(nèi)的物質(zhì)結(jié)構(gòu)、海洋環(huán)境要素、水中污染物等多種因素有關(guān)。通過對海洋發(fā)光細菌發(fā)光

47、特性及其應(yīng)用可能性的論述,如利用發(fā)光細菌的發(fā)光強度與水中毒物的濃度、毒性的關(guān)系檢測污染物;利用潛艇航行時激發(fā)的生物發(fā)光勾畫出潛艇渦動的光尾流可跟蹤探測潛艇;海洋發(fā)光細菌的發(fā)光特性還可用以改進水下光通訊與探測、海洋水色遙感、海洋發(fā)光細菌分類、發(fā)光免疫和抗菌素濃度測定等方面。闡明海洋發(fā)光細菌發(fā)光特性的重要研究意義并為進一步開展應(yīng)用研究提供借鑒。關(guān)鍵詞:海洋發(fā)光細菌;發(fā)光特性;應(yīng)用研究中圖分類號:O482. 31PACC:3250F; 7860P文獻標識碼:A收稿日期:2006-08-25;修訂日期:2006-11-24基金項目:國家科技基礎(chǔ)條件平臺項目(海洋微生物菌種種質(zhì)資源標準化整理整合與共享)

48、(2004DKA30640);國家908項目(我國近海海洋綜合調(diào)查與評價)基金資助項目作者簡介:張進興(1954-),男,山東濰坊人,研究員,主要從事應(yīng)用微生物學的研究。E-mai:l zhangjx fio. org. cn, Te:l (0532)889674491引言海洋發(fā)光細菌的發(fā)光現(xiàn)象一直是人們十分關(guān)注的問題,各國科學家對此進行了多方面的調(diào)查研究。國內(nèi)對海洋發(fā)光細菌發(fā)光的觀測研究已有多年歷史。在國標海洋調(diào)查規(guī)范中,早已把“海發(fā)光”列為海洋調(diào)查內(nèi)容,其中“彌漫型”海發(fā)光便是由海洋發(fā)光細菌產(chǎn)生的,作為常規(guī)海洋觀測項目之一,已積累了許多現(xiàn)場觀測資料。近年來,由于實際應(yīng)用的需要,對海洋發(fā)光細

49、菌的觀測研究有所加強,如現(xiàn)正進行的西北太平洋環(huán)境調(diào)查研究項目中,就包含了海洋發(fā)光細菌的分布調(diào)查。有關(guān)海洋發(fā)光細菌的研究內(nèi)容相當廣泛,從近期國內(nèi)外發(fā)表的文獻資料看,主要有海洋發(fā)光細菌的發(fā)光機理,發(fā)光基因、熒光素酶、發(fā)光特性以及某些應(yīng)用方法等研究。在發(fā)光特性研究方面,以往更多地側(cè)重于細菌發(fā)光與其體內(nèi)物質(zhì)、結(jié)構(gòu)關(guān)系的研究,即側(cè)重于微生物學和生物化學方面的研究,而在環(huán)境要素和細菌種類、密度等對細菌光譜的影響方面的研究相對較少。在海洋發(fā)光細菌的研究中,發(fā)光特性及其應(yīng)用研究是一項重要內(nèi)容。利用細菌的發(fā)光特性,開展應(yīng)用研究,尤其結(jié)合光學原理,制作某些傳感器,用于海洋環(huán)境污染監(jiān)測,已引起國內(nèi)外廣泛重視。為了研

50、究海洋發(fā)光細菌發(fā)光特性的應(yīng)用前景,首先必須深入了解海洋發(fā)光細菌的性質(zhì),積累發(fā)光細菌發(fā)光特性的基礎(chǔ)資料和研究經(jīng)驗。然后,依據(jù)細菌發(fā)光的不同特性和應(yīng)用可能性,開展相應(yīng)的應(yīng)用研究。此類研究不僅可為細菌發(fā)光特性的應(yīng)用提供有效方法,并將促進海洋生物學、海洋光學、生物化學之間交叉學科綜合研究的發(fā)展,為從物理學角度研究海洋發(fā)光細菌提供依據(jù)。為此,本文擬在簡要綜述海洋發(fā)光細菌的分布特點與發(fā)光機理研究基礎(chǔ)上,論述發(fā)光特性及其在海洋環(huán)境污染物監(jiān)測、發(fā)光細菌分類、水下通訊探測和水色遙感上的應(yīng)用研究現(xiàn)狀,為進一步開展海洋發(fā)光細菌發(fā)光特性的應(yīng)用研究提供借鑒。2分布特點與發(fā)光機理海洋發(fā)光細菌是一類從海水中或者從海洋動物體

51、表、消化道和發(fā)光器官上以及海底沉積物中可以分離到的,在適宜條件下能夠發(fā)射可見光的異養(yǎng)細菌。海洋中的發(fā)光細菌,除了在海水中自由浮游生存的外,還有寄生于其他海洋生物體的。許多海洋生物的發(fā)光與發(fā)光細菌有關(guān),如某些魚類、軟體動物等的發(fā)光是由海洋發(fā)光細菌寄生、共168發(fā)光學報第28卷棲生存所致。海洋發(fā)光細菌的種類不是很多,但其分布卻非常廣,從海表層至深海;從熱帶海洋至非常寒冷的極地海域都有其蹤跡。為了更好地掌握海洋發(fā)光細菌的發(fā)光特性及應(yīng)用可能性,除需要了解發(fā)光細菌的分布特點外,也有必要對發(fā)光細菌的發(fā)光機理作簡要介紹。發(fā)光機理的研究結(jié)果表明,不同種類的發(fā)光細菌其發(fā)光機理是基本一致的,都必須有細菌熒光素酶(

52、LE)、還原性的黃素單核苷酸(FMN·H2)、氧氣(O2)、長鏈脂肪醛(RCHO)的參與,大致歷程如下:FMNH2+LEFMNH2·LE +O2LE·FMNH2·O2+RCHOLE·FMNH2·O2·RCHOLE·FMN+H2O+RCOOH+光概括地說,細菌生物發(fā)光反應(yīng)是由分子氧作用,胞內(nèi)熒光酶催化,將還原態(tài)的黃素單核苷酸及長鏈脂肪醛氧化為黃素單核苷酸(FMN)及長鏈脂肪酸,同時釋放出藍綠光。發(fā)光細菌發(fā)出的光是連續(xù)的,屬“冷光”。這是一種化學發(fā)光類型,在化學能轉(zhuǎn)換為輻射能的過程中發(fā)光。熒光素酶是菌體內(nèi)催化熒光素或脂

53、肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱,細菌熒光素酶是含、兩個多肽亞基的單加氧酶,只有兩個亞基共存時才有活性。從不同海洋發(fā)光細菌中提取的細菌熒光素酶其分子量差別較小。由于海洋發(fā)光細菌發(fā)光細胞內(nèi)含有熒光素和熒光素酶,有了氧氣,細胞內(nèi)的熒光素就受到熒光素酶的催化作用而吸收能量,變成氧化熒光素并釋放光子而發(fā)光。不同種類的海洋發(fā)光細菌可產(chǎn)生不同的熒光素酶,發(fā)光特性也不同。3發(fā)光特性研究海洋發(fā)光細菌的發(fā)光特性研究,包括不同菌種所具有的特異光譜特性研究,發(fā)光強度、發(fā)光特征參數(shù)和發(fā)光條件對細菌發(fā)光的影響等項研究,以及不同種類的發(fā)光組分和酶結(jié)構(gòu)的差異研究。各種生物發(fā)光的本質(zhì)大體一樣,都是由一組化合物熒光酶和高能化合物腺苷

54、三磷酸等構(gòu)成發(fā)光光源。它們發(fā)出的藍、青、綠、黃、橙等不同顏色的光,是因為各自的熒光素、熒光酶在結(jié)構(gòu)上的微小差異引起的。發(fā)光細菌的光譜范圍約420670 nm,max在475485 nm左右,為單一發(fā)射峰,max和半峰全寬有種屬差異。從發(fā)光特征參數(shù)發(fā)光量子產(chǎn)率來看,其生物發(fā)光反應(yīng)特點是高光子產(chǎn)生效率: 0. 50. 8。通過發(fā)射光的比率可以推出未知成分的濃度,因此測定化學反應(yīng)過程中的發(fā)射光是非常有用的。反應(yīng)過程中產(chǎn)生的光與發(fā)射光的量子產(chǎn)率是直接相關(guān)的,與相應(yīng)的發(fā)光物質(zhì)的濃度成比例。因此,反應(yīng)過程中的光可以相對反映出目標樣品中發(fā)光物質(zhì)的量。有關(guān)生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移是指在一個發(fā)光或熒光供體和一個熒光

55、受體(如綠色熒光蛋白的突變體GFP)之間會發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。利用這種方法可以非侵入性地監(jiān)測特異蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用。如Kudryasheva等1研究了細菌生物發(fā)光電子激發(fā)態(tài)上限能量估算,用染色分子作為能量接收者,證實了細菌生物發(fā)光電子激發(fā)態(tài)上限活動的假設(shè)。并給出了MSB(Methylstyryl benzene)中的偶聯(lián)酶系統(tǒng)NADHFMN-氧化還原酶-熒光素酶的細菌發(fā)光光譜。從已有的實驗研究結(jié)果看,大多數(shù)發(fā)光細菌的發(fā)光,僅發(fā)生于高細胞密度,細菌發(fā)光依賴于培養(yǎng)體系中誘導蛋白的濃度和積累。細菌種類和生長條件,包括溫度、鹽度和營養(yǎng)成分以及其他實驗條件對其發(fā)光也有影響2。在正常的生理條件下,發(fā)光細菌能發(fā)出波長為450490 nm的藍綠光;在一定的試驗條件下,發(fā)光強度是恒定的3。但也有學者研究發(fā)現(xiàn),發(fā)光桿菌屬經(jīng)某種處理后其發(fā)光光譜產(chǎn)生位移,如HajimeKaratani等4在由發(fā)光桿菌發(fā)光現(xiàn)象產(chǎn)生的兩種熒光蛋白質(zhì)的特性研究中,發(fā)現(xiàn)從深海發(fā)光細菌中分離的熒光蛋白質(zhì)中,發(fā)光桿菌屬經(jīng)提純、克隆和排序出兩種熒光蛋白質(zhì),最大發(fā)射的熒光波長在488, 517 nm。在尿素